ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

この手順の全体的な目標は、高分子電解質錯体シェルを作製することです。ヘパリン結合ドメインを持つ広範囲の成長因子の放出を捕捉し、調節することができるキャリア。この方法は、効率的な閉じ込めと専用の成長因子の送達のための整形外科組織工学分野の重要な質問に答えることができます。

この技術の主な利点は、有機物を頻繁に使用する必要がないことです。これは、成長因子の生物活性に影響を与えることが知られています。200ミリグラムの非照射アルギン酸ナトリウムまたは400ミリグラムの8メガラド照射アルギン酸ナトリウムを10ミリリットルの二重蒸留水に溶解します。

そして1時間振る。アルギン酸塩溶液を摂氏4度で一晩保管します。アルギン酸マイクロビーズを作製する前に、滅菌済みの0.2ミクロンシリンジフィルターでアルギン酸溶液をろ過します。

静電BEジェネレーターとシリンジポンプを70%エタノールで消毒し、クラス2の生物学的安全キャビネットに置きます。次に、BEジェネレーター内にマグネチックスターバー付きのガラス洗面器を置きます。BEジェネレーターのアーム電極を洗面器から9cm上に設定します。

BEジェネレーターの電極ケーブルをアーム電極のニューロスクリュー2本に接続します。そして、80ミリリットルの塩化ストロンチウム溶液を洗面器に注ぎます。次に、5ミリリットルの0.2ミクロンのろ過アルギン酸溶液をゴムチューブのシリンジにロードします。

ゴムチューブをアーム電極に接続した後、シリンジポンプを毎時5ミリリットルでオンにします。2分間。チューブ内の空気を排出し、アルギン酸溶液をノズルの先端に送ります。

次に、シリンジポンプの電源を切ります。マイクロビーズの生成を開始するには、カプセル化器を5.8キロボルトに設定します。その後、毎時5ミリリットルのアルギン酸流量のシリンジポンプが続きます。

最初の2分間に生成されたマイクロビーズは、サイズや形状が不規則になる傾向があるため、廃棄してください。その後のマイクロビーズを0.2モルの塩化ストロンチウム溶液に集めます。シリンジポンプの電源を切り、次にカプセル化器の電源を切ります。

事前に計画された量のアルギン酸溶液をポンピングした後。これをマイクロビーズ製造の後続のバッチで繰り返します。マイクロビーズを20ミリリットルの0.2モル塩化ストロンチウム溶液に摂氏4度で一晩保存すると、架橋が完了し、ゲルが安定します。

プラスチック製のピペットで0.5ミリリットルのアルギン酸マイクロビーズを収集します。そして、それをスライドガラスの上に置きます。マイクロビーズを光学顕微鏡で10倍の倍率で観察します。

マイクロビーズの画像を顕微鏡CCDカメラで10枚撮影します。500 ミクロンのスケールバーで TIFF 形式で画像を 2048 x 1536 の解像度で保存します。画像Jの長さツールを使用して、マイクロビーズのサイズを測定します。

そしてスケールバー。次に、マイクロビーズの長さをピクセルからマイクロメートルに変換します。ラインツールをクリックして、アルギン酸ビードの中央に線を引きます。

メニューバーの「分析」をクリックし、「測定」を選択します。ポップアップウィンドウが表示されます。これらの手順を繰り返して、画像内のすべてのアルギン酸ビーズを測定します。

画像上のスケールバーを測定します。100ミクロンのナイロンストレーナーを使用してマイクロビーズを収集します。そして、ビーズを二重蒸留水で洗います。

0.1ミリリットルのアルギン酸溶液から作られたすべてのマイクロビーズをスパチュラを使用して2ミリリットルの微量遠心チューブに移し、乾燥を防ぐためにガーゼで覆います。最後に、液体モードを使用して自動切断することにより、または製造元の仕様に従ってマイクロビーズを滅菌します。ビーズが乾燥するのを防ぐために、チャンバーに1.5リットルの蒸留水を追加します。

BSL2フード内で、滅菌マイクロビーズを滅菌した1ミリリットルの滅菌済み2ミリグラム/ミリリットルのプロタミン溶液と室温で1時間インキュベートします。プロタミンコーティングされたマイクロビーズを二重蒸留水で2回洗浄します。次に、卓上型遠心分離機を使用して、Gの200倍で室温で3分間スピンダウンします。

遠心分離後、シリンジを使用して水を吸引します。プロタミン被覆マイクロビーズを滅菌した0.5ミリグラム/ミリリットルのヘパリン溶液1ミリリットルと30分間インキュベートします。これにより、ヘパリン結合成長因子に対して熱心な親和性を持つ高分子電解質錯体化シェルが作られます。

インキュベーション後、注射器を使用してヘプリンを吸引します。そして、二重蒸留水で2回洗浄することにより、高分子電解質錯体から未結合のヘパリンを洗い流します。13.3マイクロリットルの1.5ミリグラム/ミリリットルの骨形態形成タンパク質2またはNELLのような分子1溶液を100マイクログラムの高分子電解質複合体にロードします。

高分子電解質複合体を30RPM未満で摂氏4度でインキュベートし、10時間振とうします。次に、マイクロビーズを1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に摂氏37度で絶えず振とうしながら浸します。上清1ミリリットルを収集し、1日、3日、6日、10日、14日後に1ミリリットルのPBSと交換します。

メーカーのプロトコルに従って、CBQCAタンパク質アッセイ法を使用して、NELL様分子Oneの取り込み効率と放出効率を評価します。または、elisa を実行します。高分子電解質複合体から放出されるNELLL様分子の生理活性は、ウサギ骨髄幹細胞におけるアルカリホスファターゼの発現を増加させる能力を測定することによって評価されます。

24ウェルプレートにウェルあたり20, 000ウサギの骨髄幹細胞を播種します。そして、1ミリリットルのダルベッコの改変されたワシの培地と摂氏37度と5%CO2の10%のウシ胎児血清で1日成長させます。24時間後、培地を1ミリリットルの骨形成培地と交換し、摂氏37度で7日間使用します。

300マイクログラムの高分子電解質複合体と高分子電解質複合体NELLのような分子1を細胞培養インサート内に配置して、複合体を細胞から分離させます。インサートを24ウェルプレートに配置して、骨形成培地交換中に高分子電解質複合体マイクロビーズが洗い流されないようにします。

3日に1回、インサートの外側に針を配置して、骨形成培地の1ミリリットルを吸引します。そして、1ミリリットルの新鮮な骨形成培地と交換します。インキュベーションの7日間と14日後、アルカリホスファターゼアッセイキットでアルカリホスファターゼ活性を測定します。

キットメーカーのプロトコルに従って。高分子電解質複合体を生体吸収性の医療グレードのポリカプロラクトントリカルシウムリン酸足場の細孔にパッケージ化します。BSL2チャンバー内で滅菌したヘラを使用します。

高分子電解質複合体を詰めた足場に、骨形成タンパク質2またはNELL様分子1の1.5ミリグラムまたはミリリットルの溶液を加えます。そして、摂氏4度で一晩インキュベートします。アルギン酸マイクロビーズは、そのサイズと形態を監視するために顕微鏡で検査されます。

非照射アルギン酸マイクロビーズは球形で、照射された対応物は涙滴形です。サイズ分布は、成長因子の取り込みの重要な要素です。また、サイズを小さくすると、表面と面積の比率が増加します。

image Jソフトウェアでアルギン酸マイクロビーズを測定する場合、平均100個のマイクロビーズを使用すると、マイクロビーズの各一致のサイズ分布を適切に推定できます。成長因子の取り込みは適切なコーティング技術に依存するため、各コーティングの層の厚さは共焦点マイクロソピーによって観察されます。ここでは、プロタミン、ヘパリン、NELL様分子1、および骨形態形成タンパク質2の蛍光類似体をインキュベートしたアルギン酸マイクロビーズの共焦点レーザースキャニングマイクロソピー画像を示します。

アルカリホスファターゼ活性は、放出された成長因子の生理活性を測定するために使用されます。14日目に高分子電解質複合体NELL様分子Oneとインキュベートした後、アルカリホスファターゼ活性の2.2倍の増加が観察されました。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間以内に行うことができます。

この手順を実行する際には、アルギン酸塩濃度がマイクロビーズの安定性に影響を与えることを覚えておくことが重要です。照射されたアルギン酸塩については、4ウェイパーセントが必要でした。照射されていない対応物については、2ウェイパーセントが必要でした。

この手順により、多層コーティングにより成長因子の負荷をさらに高めることができます。この技術により、組織工学分野の研究者は、他の疾患モデルにおける成長因子の送達を探求することができます。このビデオを見た後、狭いサイズ分布の高分子電解質複合体を作製することができます。