Name: ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 学ぶ ヘパリンとプロタミンを用いた高分子電解質複合体の作製法。BMP-2用量を20分の1に低減し、骨形成成長因子の放出を制御する革新的なドラッグデリバリーシステムを探索する。整形外科組織工学への応用が期待される。

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これらの研究は、National Medical Research Council Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 および NMRC EDG/0022/2008 によって資金提供されました。

1.アルギン酸塩溶液の調製<ol><li>アルギン酸ナトリウム（非照射）または8ミリラジアンの400mgの200 mgの溶解10mlの蒸留水にアルギン酸ナトリウムを照射および非照射アルギン酸照射アルギン酸15分間、1時間振とうします。 4℃で一晩アルギン酸塩溶液を保管してください。アルギン酸マイクロビーズの製造の前に滅菌0.2μmのシリンジフィルターでアルギン酸塩溶液をフィルタリングします。 </li></ol> 2.アルギン酸マイクロビーズの作製<ol><li> 70％エタノールで静電ビーズ発生器とシリンジポンプを消毒し、クラスII生物学的安全キャビネット（ 図1）に配置します。 </li><li>ビーズ発電機内部の磁気攪拌棒をガラス洗面器を置きます。 </li><li> 9センチメートル流域上記のビーズ発電機のアーム電極を設定します。 </li><li>アーム電極のローレットネジ2にビーズ発生器の電極ケーブルを接続し、へのSrCl 2溶液の80ミリリットルを注ぎます流域。 </li><li>シリンジ及びゴムチューブにロード0.2μmのろ過アルギン酸塩溶液の5ミリリットルを。アーム電極にゴムチューブを接続した後、チューブ内の空気を排出し、ノズルの先端にアルギン酸塩溶液を提供するために2分間5ミリリットル/時でシリンジポンプのスイッチを入れます。シリンジポンプの電源を切ります。 </li><li>次に、カプセル化装置のスイッチをオンにした後、シリンジポンプは、マイクロビーズの生成を開始します。 5ミリリットル/時アルギン酸流量とキャプに5.8 kVの電圧を設定します。これらのマイクロビーズは不規則な大きさと形状になる傾向があるように、最初の2分（またはシリンジから送り出さ初期0.5ミリリットルアルギン酸塩溶液）中に生成されたマイクロビーズを捨てます。 </li><li> 0.2 M塩化ストロンチウム溶液中でその後のマイクロビーズを収集します。アルギン酸塩溶液の事前計画されたボリュームをポンピングした後、シリンジポンプと（その順序で）カプセル化装置の両方の電源をオフにします。マイクロビーズ製造のその後のバッチのためにこれを繰り返します。完了すると、のターンキャプ続いて第1のシリンジポンプ、F。 </li><li>架橋を完了し、ゲルを安定化するために4℃で一晩、0.2M塩化ストロンチウム溶液20mlにマイクロビーズを格納します。 </li></ol>アルギン酸マイクロビーズの3サイズの測定<ol><li>プラスチックピペットを用いてアルギン酸マイクロビーズの0.5ミリリットルを採取し、スライドガラス上に置きます。 10倍の倍率で光学顕微鏡下でのマイクロビーズを表示します。顕微鏡用CCDカメラとマイクロビーズの10画像を撮ります。解像度2048 X 1536でTIFF形式のスケールバー（500ミクロン）の画像を保存します。 </li><li> ImageJの長さツールを使用して、マイクロビーズのサイズ及びスケールバー（ 図2）を測定します 。画素からのマイクロビーズの長さは、マイクロメートルに変換します。 <ol><li>ラインツールをクリックするとアルギン酸ビーズの真ん中を横切る線を引きます。 </li><li>メニューバーの「分析」と「測定」を選択しクリックしてください。ポップアップウィンドウが表示されます。 </li><li&gt;繰り返し画像内の全てのアルギン酸ビーズを測定するために3.2.1-3.2.2を繰り返します。画像上のスケールバーを測定します。 </li><li> ×500μmのスケールバーのアルギン酸ビーズ/長さの長さを：式を用いて実際の長さにアルギン酸ビーズの直径を変換します。例えば、1.420（ImageJをすることによって測定された直径）/ 2.657（ImageJをすることによって測定スケールバーの長さ）* 500ミクロン= 267ミクロン。 </li></ol></li><li>マイクロビーズの各バッチの代表サイズとして（平均±標準偏差）100マイクロビーズの平均サイズを考慮してください。 </li></ol> 4.滅菌<ol><li> 100μmのナイロンストレーナーを使用してマイクロビーズを収集し、蒸留水でビーズを洗浄します。 </li><li>スパチュラを使用して、2mLのマイクロ遠心チューブに0.1 mlのアルギネート溶液から作られたすべてのマイクロビーズを転送し、乾燥を防ぐために、ガーゼで覆います。 </li><li>最後に、液体モードを使用して、オートクレーブによりマイクロビーズを滅菌（115℃、15分）またはmに応じてanufacturerの仕様。乾燥からビーズを防ぐために、チャンバに蒸留水1.5リットルを加えます。 </li></ol> 5.プロタミンとヘパリンコーティング<ol><li> BSL-2フードの内側には、室温で1時間（0.2μmのシリンジフィルターを用いて滅菌）を2mg / mlのプロタミン溶液1ml滅菌マイクロビーズをインキュベートします。 </li><li> 1時間（ステップ5.1）のためのマイクロビーズをインキュベートした後、マイクロビシンコニン酸（マイクロBCA）テスト（セクション6）のためのプロタミン溶液150μLを集めます。 </li><li>蒸留水で2回プロタミン被覆したマイクロビーズを洗ってください。室温で3分間、200×gでベンチトップ遠心機を用いてスピンダウン。遠心分離後、シリンジを用いて水を吸引します。 </li><li>高分子電解質複合体（PEC）を作成するために30分間（0.2μmのシリンジフィルターを用いて滅菌）を0.5mg / mlのヘパリン溶液1mlとプロタミンコーティングされたマイクロビーズをインキュベートします。 </li><li>プロタミンコーティングされたマイクロビーズFをインキュベートした後、または30分（ステップ5.4）、ヘパリンコンテンツ（セクション7）を決定するためにヘパリン溶液の400μLを集めます。 </li><li>インキュベーション後、蒸留水で2回洗浄してたPECから未結合ヘパリンを洗い流してください。 </li></ol> 6.プロタミンコンテンツ<ol><li>製造業者の指示に従ってマイクロBCAテストを実行します。簡単に言えば、96ウェルプレートに150μlのプロタミン溶液（前およびマイクロビーズとのインキュベーション後に回収）を追加します。 150μlのマイクロBCAワーキング溶液を追加します。 </li><li>較正標準としてアルブミン溶液（0、0.5、1、2、5、10、20、40及び200μgの/ ml）を使用します。 </li><li> 60℃で60分間混合物をインキュベートします。 562 nmで分光光度計で吸光度を測定します。 </li><li>製造者の指示に従って、各未知試料のプロタミン濃度を決定するための標準曲線を使用します。 </li><li>プロタミンの合計量を差し引くことにより、マイクロビーズのプロタミン含有量を決定（マイクロビーズとのインキュベーション後に）塗布液中に残存するプロタミンの量から（マイクロビーズとのインキュベーション前に）コーティング液。 </li></ol> 7.ヘパリンコンテンツ<ol><li>ブルー4mgのトルイジンと0.01 N塩酸中20mgの塩化ナトリウムを溶解させて使用液の10ミリリットルを準備します。 </li><li> 30秒3、ボルテックス：2の比率で作業溶液に（ステップ5.5から）のサンプル400μlを添加します。 </li><li> n-ヘキサン（ワーキング試薬溶液に相当するボリューム）の600μl加え、トルイジンブルーヘパリン複合体を抽出するために、混合物をボルテックス。 </li><li>吸引し、相分離後のシリンジで水相200μlの。 </li><li> 631 nmで分光光度計を使用して水相中に含まれる未抽出トルイジンブルーの量を測定します。 </li><li> 0-20 / mlのヘパリン標準溶液を準備します。 </li><li> μgの/メートルでヘパリン濃度対各ヘパリン標準の631 nmの読み取りをプロットリットル。各サンプルのヘパリン濃度を決定するために、標準曲線を使用してください。 </li></ol>レイヤー・バイ・レイヤー構造の8共焦点イメージ<ol><li>プロタミン、ヘパリンとNELL-1 / BMP-2蛍光アナログCF-405プロタミン（青）、CF 594ヘパリン（赤）を作製し、FITCは、NELL-1 / FITC標識に従って（緑）、BMP-2 +ヘパリン+プロタミンメーカーのラベル付けテクニカルデータシート。 </li><li>コー​​ト100μgの蛍光アナログ300μlのマイクロビーズ（5.3から5.6で説明したように塗布法）CF-405プロタミン（青）（2 mg / mlで、1時間のインキュベーション）、CF 594ヘパリン（赤）（0.5 mg / mlで、 30分）し、FITCは、標識されたNELL-1 / FITC標識した（緑）、BMP-2（1.5 mg / mlで、一晩）。未結合の蛍光プロタミン、ヘパリンとNELL-1 / BMP-2を除去するために蒸留水で2回マイクロビーズを洗ってください。 </li><li> 10X倍率で共焦点顕微鏡を使用してレイヤーバイレイヤー構造（ 図3）を確認します。7 </li></ol>前記BMP-2そして、NELL-1取り込みおよびリリース<ol><li>負荷PEC100μgの上のBMP-2またはNELL-1溶液の1.5 mg / mlでの13.3μlの。 10時間振盪30 rpmの下に4℃でPECをインキュベートします。 </li><li>一定の振とう（30 rpm）しながら37℃でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の1ミリリットル中にマイクロビーズを浸し。 </li><li> 1mlの上清を収集し、1、3、6、10および14日後に1 mlのPBSと交換してください。 </li><li>取り込みを評価し、製造業者のプロトコルに従ってELISA法を用いてBMP-2の効率を放出します。取り込みを評価し、製造業者のプロトコルに従ってカルボキノリン-2-カルボキシアルデヒド（CBQCA）タンパク質アッセイ法を用いて、NELL-1の効率をリリース。 </li><li>時間（t）での累積放出を決定します。 当時の時間（t）+前のリリースでの時間（t）=リリースでの累積放出（tは-1）。 </li><li>時間に対するBMP-2およびNELL-1の累積放出をプロットします。 </li></ol> 10. インビトロ生物活性NELL-1の注：PECから放出されたNELL-1の生物活性は、ウサギ骨髄幹細胞におけるアルカリホスファターゼ（ALP）の発現を増加させる能力（rBMSC）を測定することによって評価しました。 <ol><li>シード2万24ウェルプレート中のウェルあたりrBMSCsし、それらをウシ胎児血清（FBS）CO 2、37℃で、5％ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 10％の1ミリリットルで一日のために成長することができます。 </li><li> 24時間後、10 -8モル/ Lのデキサメタゾン、10％FBS、2％ペニシリンストレプトマイシン、50μg/ mlのアスコルビン酸、10ミリモル/ Lのβグリセロリン酸を補充した骨形成培地（DMEM 1mlの培地を交換し、そして）37℃で7日間、5％CO 2のため。 </li><li>細胞（これは骨形成培地交換時のPECマイクロビーズの洗い出しを回避）とは別のPECを維持するために300μgのPEC-NELL-1細胞培養インサートの内側とPEC（ステップ8.2から）（TCインサート）を配置します。場所TCはPLも24に挿入します14日間食べました。 </li><li> 3日に1回、TCインサート外に針を配置することによって吸引骨形成培地の1ミリリットルを、新鮮な骨形成培地1mlと交換してください。 </li><li>インキュベーションの7および14日後に、キットの製造業者のプロトコルに従って、ALPアッセイキットを用いてALP活性を決定します。 <ol><li> 10分間4℃で0.1％トリトンX-100を含むアッセイ緩​​衝液で溶解細胞。セルスクレーパーを使用して付着した細胞を削り取ります。少なくとも60分間攪拌しながら4℃で細胞懸濁液をインキュベートします。 </li><li> 10分間4℃で2,500×gで細胞懸濁液を遠心。 ALPアッセイのために上清を収集します。 </li><li> 96ウェルプレートのウェルにミリリットル200 0 ngの/から連続的に希釈したアルカリホスファターゼ標準溶液50μlを追加します。アルカリホスファターゼ標準の最終的な量は、よく/ 10、5、2.5、1.2、0.6、0.3、0.15、および0 ngのです。 </li><li>ステップ10.5.2からの上清を追加します（50μL/ウェル）、希釈Bで希釈uffer。 </li><li>各ウェルにp個の -nitrophenylリン酸（のpNPP）基質溶液50μlを追加します。穏やかに30秒間プレートを振盪することにより、試薬を混ぜます。暗所で30分間混合物をインキュベートします。プレートリーダーにより405nmの吸光度を測定します。 </li><li>検量線を用いてALP活性を計算します。 </li></ol></li><li>製造業者の指示に従ってマイクロBCAタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質含量を決定します。タンパク質含量によりALP活性を割ることによりALP活性を正常化します。 </li></ol> 11.細胞生存率<ol><li> 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）のために24時間37℃でDMEM + 10％FBSを1 mlのPEC-NELL-1 200mgのインキュベートアッセイ。 </li><li> 96ウェルプレート中の種子（10％FBSを含むDMEM100μl中）ウェルあたり2,000 rBMSCsし、37℃、5％CO 2で1日間インキュベートします。 </li><li> PEC-NELL-1 / PECエキス100μlのDMEM + 10％FBSを交換し、インキュベート37℃、5％CO 2。 </li><li>インキュベーションの1日または3日後、5 mg / mlでのMTT溶液10μlを追加し、さらに暗闇の中で4時間、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 </li><li>ホルマザン結晶を溶解し、各ウエルに100μlのDMSO溶液を加えます。 </li><li>マイクロプレートリーダーを用いて570 nmの吸光度を決定します。 </li><li>相対成長率を計算します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54202/54202eq1.jpg" /></li></ol> 12.足場へのパッケージ化とBMP-2＆NELL-1のロード<ol><li> BSL-2チャンバー内の滅菌スパチュラを用いてリン酸三カルシウム（mPCL-TCP）足場 - 生体吸収性医療グレードのポリカプロラクトンの孔にPECを梱包してください。 </li><li> PECを詰めmPCL-TCP足場の上に1.5mg / BMP-2またはNELL-1 mlの溶液を加え、4℃で一晩インキュベートします。 </li></ol>

<ol><li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NELL-1+based+demineralized+bone+graft+promotes+rat+spine+fusion+as+compared+to+commercially+available+BMP-2+product%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Sci%22%5BJournal%5D)">NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product.</a> Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).</li>
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<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+Complex+Carrier+Enhances+Therapeutic+Efficiency+and+Safety+Profile+of+Bone+Morphogenetic+Protein-2+in+Porcine+Lumbar+Interbody+Fusion+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model.</a> Spine. 40, 964-973 (2015).</li>
<li>Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+rhBMP-2+into+self-assembled+polyelectrolyte+complexes+promotes+anatomic+localization+of+new+bone+in+a+porcine+model+of+spinal+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery.</a> Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).</li>
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<li>Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-tricalcium+phosphate+particles+as+a+controlled+release+carrier+of+osteogenic+proteins+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).</li>
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<li>Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+entrapping+conditions+to+improve+the+release+of+BMP-2+from+PELA+carriers+by+response+surface+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology.</a> Biomed Mater. 10, 015002(2015).</li>
</ol>

私たちは、利害関係のありません。

このプロトコルは、レイヤーバイレイヤー自己組織化を通じたPECの調製のための方法を提示しています。層ごとの構造は、プロタミン、ヘパリン、BMP-2およびNELL-1および共焦点顕微鏡の蛍光類似体を用いて可視化されます。取り込みおよび放出試験は、PECのヘパリンは骨形成成長因子の取り込み及び放出を媒介することを示します。 PEC法の取り込み効率は次のとおりです。NELL-1：86.7±2.7％、BMP-2：70.5±3.1％。 PECの担体は、カルシウムアパタイト粒子として純粋表面吸着担体（40-80％）11と比較して、NELL-1（20％）の放出のより良好な調節を有します。 リリースを調節することに加えて、ヘパリンは、このような不要な細胞毒性関連の問題12を回避するためにプロタミンなどのポリカチオンの過度の正電荷を中和します。 MTTアッセイおよびアラマーブルーアッセイ7によって決定されるのPECは、細胞毒性の兆候を示しません。 ALPアッセイは、PECキャリアがbioactを維持することができます示していNELL-...

偽の発生率は、変性脊椎固定術およびリビジョン脊椎手術1の10〜45％と高いことが報告されています。脊椎融合および他の再建骨手術中に偽関節の速度を減少させるために、例えば、BMP-2、NELL-1および血小板由来増殖因子（PDGF）などの骨形成増殖因子はデノボ骨形成を促進するために導入されています。これらのうち、BMP-2は、脊椎固定術2のための一般的な選択です。新骨形成を誘導および促進におけるBMP-2の効力は十分に3を確立してきたが。このような異骨形成、血清腫および血腫形成、炎症反応、神経根炎、椎体の骨溶解、および逆行性射精などの臨床的に有意な合併症が原因で4,5使用超生理学的量に関心事項であり続けます。 したがって、BMP-2の用量を低下させることがでに関連する戦略まま副作用を最小にするために誘惑。また、効率的なキャリアシステムは、現代のコラーゲンスポンジ担体系で観察されたBMP-2の初期バースト放出を抑制し、さらに、この強力なサイトカインの長期化と局所的な送達を促進するために必要とされます。陽イオンおよび陰イオン高分子電解質の交互の層毎の自己集合足場マトリックスまたは移植可能な材料6の表面に高分子電解質複合体を構築するための調整可能な方法として使用することができます。この点では、（すべての生物学的因子の最も負の電荷密度を有するために知られている）、ヘパリンが強く静電及びヘパリン結合ドメインを介して、種々の増殖因子と結合することが認識されています。実際、ヘパリンは半減期を延長し、従って、いくつかの成長因子の生物活性を増強することが示されています。 これに基づいて、私たちのグループは、ヘパリン系高分子電解質複合体（PEC）を製造するために層ごとの自己集合のプロトコルを適合その<html>負荷および固定化7,8の間に骨形成成長因子の生物活性を保持します。アルギン酸マイクロビーズのコアは、二価カチオン、カルシウムまたはストロンチウムイオンと、アルギン酸塩のα-L-グルロン酸（G）残基を架橋することによって作製しました。アルギン酸コアは、生分解性足場の行列です。これは移植後、それは骨の内部成長のための部屋を提供する融合ベッドに再吸収されます。ポリ-L-リジン（PLL）またはプロタミン（この場合は、アルギン酸マイクロビーズキャリアコア）足場マトリックスと負に帯電したヘパリンの両方とインタレースするカチオン性層として使用されます。アニオン性ヘパリン層の機能は、ロードされた成長因子を安定化し、局在化しています。三層PECは、ブタモデル9における成長因子負荷容量を増加させることが示されています。近年、PECキャリアは正常ラット10と脊椎8のブタモデルにおいて少なくとも20倍のBMP-2の有効量を減少させることが示されています。 ntent &quot;&gt;ここでは、我々はモデル骨形成増殖因子としてBMP-2を使用して、脊椎固定術で強化された成長因子の配信および他の再建骨手術のためのPECを製造する方法を報告しています。

<table><tbody><tr><td>ライフサイエンス アクロディスク 25&nbsp;mmシリングフィルター(0.2&nbsp;&マイクロ;m スープルメンブレン</td><td>PALL&nbsp;</td><td>PN4612</td>滅菌<td>プロタミン、限外ろ過によるヘパリン溶液</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>セルスター&nbsp;</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート ヌクロンデルタ表面</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)、MTT</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M5655</td><td>PEC-NELL-1 アセトンの細胞毒性を測定</td></tr><tr><td></td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A/0600/17</td><td>沈殿物 CF-405 標識プロタミン</td></tr><tr><td>アラマー</td><td>ブルー Invitrogen,Life Technologies</td><td>DAL 1025</td><td>PEC-BMP-2</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼアッセイ(ALP)アッセイキット</td>の細胞毒性の測定 <td>Anaspec</td><td>AS-72146</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>Merck</td><td>Art 1145</td><td>FITC標識の試薬を停止</td></tr><tr><td>無水ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D12345</td><td>蛍光イソチオシアネートI</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td></td>・<td>ディゾルブ&nbsp; フォルマザン&nbsp;</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>ヒラヤマ</td><td>HU-110</td><td>アルギン酸ビーズを蒸気滅菌</td></tr><tr><td>β-グリセロリン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit)&nbsp;</td><td>Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA</td><td>7510800</td><td>骨形成成長因子、透析は、FITCカップリング</td></tr>の<tr><td>カルボキシベンゾイルキノリン-2-カルボキシアルデヒド(CBQCA)</td>を妨害する安定剤成分を除去するために必要です&nbsp;<td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-6222</td><td>NELL-1タンパク質</td></tr><tr><td>細胞ストレーナーの定量化 (100&nbsp;&マイクロ;m)</td><td>BD Science</td><td>352360</td><td>ALPアッセイ用PECを保持</td></tr><tr><td>セルスクレーパー 290&nbsp;mm ブレード幅 20&nbsp;mm</td><td>SPL Life Science</td><td>90030</td><td>24ウェルプレートから細胞を取り外す</td></tr><tr><td>CF 405S, Succinimidyl Ester</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600013</td><td>プロタミン標識用青色蛍光色素</td></tr><tr><td>CF 594, Hydrazide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600031</td><td>ヘパリン標識用深赤色蛍光色素</td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>ベックマン・コールター</td><td>マイクロフュージ 22R</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>骨形成培地</td></tr>デ<tr><td>キストラン脱塩カラム</td><td>Pierce (Thermo Scientific)の成分&nbsp;</td><td>43230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>12320</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 Quantikine ELISAキット</td><td>R&Dシステム</td><td>DBP200</td><td>BMP-2放出を決定する</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 FBS</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>フルオセインイソチオシアナン酸、異性体 I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td>NELL-1およびBMP-2標識用緑色蛍光色素</td></tr><tr><td>ThinCert細胞培養インサート、 24ウェルプレート用、滅菌</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>662630</td><td>骨形成媒体を交換するときにPECの洗い流しを防ぎます</td></tr><tr><td>Havard Appartus シリンジ ポンプ (11 plus)</td><td>Havard 装置</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>n-ヘキサン (>99%)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>H3149</td><td>ヘパリン結合ドメインを持つ骨形成性 成長因子と結合</td></tr>します <tr><td>塩酸 (37%)</td><td>メルク</td><td>100317</td><td>高腐食性</td></tr><tr><td>インキュベータ</td><td>ーバインダー</td><td>C8150</td><td></td></tr><tr><td>MicroBCAタンパク質アッセイキット</td><td>Thermoscientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>ALPおよびmicroBCAアッセイ用</td></tr><tr><td>Nisco細胞カプセル化器</td><td>Nisco Engineering Inc</td><td>カプセル化ユニット VAR V1</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>mPCL-TCPスキャフォールド(細孔径は1.3&nbsp;mm)</td><td>Osteopore</td><td>PCL-TCP 0/90</td><td>PECをin vivo研究用PECを保持</td></tr> ペ<tr><td>ニシリン-ストレプトマイシン 10,000 unit/ml, 100&nbsp;ml</td><td>Hyclone Cell Culture</td><td>SV30010</td><td>Antibiotic</td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Vivantis</td><td>PB0344-1L</td><td>10x Solution, Ultra Pure Grade</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2568</td><td>Polycation</td></tr><tr><td>Protamine Sulfate salt, from Salmon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4020</td><td>Polycation</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Labnet</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>スネークスキン透析チューブ 3,500 MWCO 22&nbsp;mm x 35</td>フィート <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>68035</td><td>透析による未反応のFITCの除去</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Qrec</td><td>S5158</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>US バイオロジカル</td><td>S4000</td><td>バッファー</td></tr><tr>炭酸<td>ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S7795-500G</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>塩化ストロンチウムヘキサハイドレート</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>255521</td><td>アルギン酸用架橋剤</td></tr><tr><td>スパチュラ</td><td>3dia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml シリンジ</td><td>テルモ</td><td>140425R</td><td>シリンジの直径は流量に影響します</td></tr><tr><td>75 cm2 細胞培養フラスコ カンテッドネック</td><td>コーニング</td><td>730720</td><td></td></tr><tr><td>トルイジンブルー</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>52040</td><td>ヘパリンアッセイ</td></tr><tr><td>トリプシン 1x</td><td>Hyclone 細胞培養</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>アルギン酸ナトリウム</td><td>Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)</td><td>Pronova UPMVG</td><td>マイクロビーズのコア材料</td></tr></tbody></table>

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

再建骨手術中に、成長因子の超生理学的な量は、経験的に成功した骨の融合を促進するために足場上に装填されています。非常に強力な生物剤の大量投与は、急速な酵素分解の結果としての成長因子の不安定性だけでなく、移植部位で成長因子の十分な量をローカライズにおけるキャリアの非効率性に必要とされます。したがって、例えばBMP-2 / NELL-1のような成長因子の安定性を延長戦略、及びそれらの放出を制御するには、実際に有効な投与量を低下させ、従って、将来の骨再生手術の間に、より大きな用量の必要性を減らすことができます。これにより、副作用および成長因子コストを削減します。自己集合のPECは、 インビボでの安定性を高めることにより、ヘパリン結合、さらに増強成長因子の生物活性を介して、BMP-2 / NELL-1送達の良好な制御を提供するために製造されています。ここでは、deliveに役立つPEC製造の単純さを示しています再建骨の手術中に種々の成長因子のRY。

それは、類似の化学的特性を有し、それは、FDAは、ヘパリンの解毒剤として承認されているとしてのキャリアでは、プロタミン、ポリ-L-リジンの代わりに選択しました。光学顕微鏡の結果は、非照射マイクロビーズが267±14ミクロンの直径を有する球形であることを示しました。 （0.35ミリメートルノズルを5ミリリットル/時間及び5.8 kVでの流量）。照射されたマイクロビーズの大部分は、涙滴形状です。照射されたマイクロビーズのラウンド部分で測定した直径が212±30ミクロン（0.35ミリメートルノズル、4ミリリットル/時＆6 kVでの流量）でした。 （ 図4）。 PECマイクロビーズの共焦点画像は、CF-405ラベルされたプロタミン（青）、CF594標識ヘパリン（赤）とFITC-BMP-2 / FITC-NELL-1（緑）のレイヤーバイレイヤーコーティングを明らかにする。結果は、PECのは、正に帯電したBMP-2と結合し、負ヘ...

ヘパリンとプロタミンから製造された自己組織化高分子電解質複合体(PEC)をアルギン酸ビーズ上に堆積させ、骨形成成長因子の放出を閉じ込めて調節しました。この送達戦略により、脊椎固定術の用途でBMP-2の投与量を20倍に減らすことができます。この記事では、PECの利点と製造について説明します。

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

本手順の全体的な目的は、ポリエレクトライト複合体シェルを作製することです。これは、ヘパリン結合ドメインを持つ幅広い成長因子を封入し、その放出を制御できるキャリアとなります。本手法は、整形外科的な組織工学分野において、特定の成長因子を効率的に封入し送達させるための重要な課題を解決し得ます。この手法の主な利点は、有機溶媒をほとんど使用しなくて済むことです。有機溶媒は成長因子の生物学的活性に影響を及ぼすことが知られています。非照射のアルギン酸ナトリウム200 mg、または8 Mrad照射のアルギン酸ナトリウム400 mgを、2回蒸留水10 mLに溶解させます。その後、1時間振盪させます。アルギン酸溶液を4 °Cで一晩保存します。アルギン酸マイクロビーズを作製する前に、滅菌済みの0.2 µmシリンジフィルターでアルギン酸溶液をろ過します。静電BEジェネレーターとシリンジポンプを70% ethanolで消毒し、クラス2バイオセーフティキャビネット内に設置します。次に、マグネチックスターラーバーを入れたガラス容器をBEジェネレーター内に配置します。BEジェネレーターのアーム電極を、容器から9 cm上に設定します。BEジェネレーターの電極ケーブルを、アーム電極のニューロスルー2に接続します。次に、盆に塩化ストロンチウム溶液を80 milliliters注入します。続いて、0.2 micronでろ過したアルギン酸溶液5 millilitersを、ゴムチューブ付きシリンジに充填します。ゴムチューブを腕電極に接続した後、シリンジポンプを 5 mL/h で2分間作動させます。これにより、チューブ内の空気を排出し、アルギン酸溶液をノズルの先端まで届けます。次に、シリンジポンプの電源を切ります。マイクロビーズの生成を開始するために、エンカプレーターを5.8 kilovoltsに設定します。続いて、シリンジポンプをアルギン酸の流れが5 mL/hになるように設定します。最初の2分間に生成されたマイクロビーズは、サイズや形状が不規則になる傾向があるため、廃棄します。その後、0.2 molar 塩化ストロンチウム溶液中にマイクロビーズを回収します。シリンジポンプを停止し、続いてエンカプシュレーターを停止します。あらかじめ計画した量のアルギン酸溶液をポンプで注入した後、後続のマイクロビーズ作製バッチについても同様の操作を繰り返します。架橋を完了させゲルを安定させるため、マイクロビーズを20 millilitersの0.2 molar塩化ストロンチウム溶液に入れ、4 °Cで一晩保存します。プラスチックピペットを用いて、アルギン酸マイクロビーズを0.5 milliliters回収します。そして、それをガラススライド上に置きます。光学顕微鏡を用い、10xの倍率でマイクロビーズを観察します。顕微鏡用CCDカメラを用いて、マイクロビーズの画像を10枚撮影します。500 micronのスケールバーを含め、解像度2048 × 1536のTIFF形式で画像を保存します。ImageJの長さ測定ツールを使用して、マイクロビーズのサイズを測定します。次にスケールバーを確認します。そして、マイクロビーズの長さをピクセルからマイクロメートルに変換します。ラインツールをクリックし、アルギン酸ビーズの中央に線を引きます。メニューバーの「analyze」をクリックし、「measure」を選択します。ポップアップウィンドウが表示されます。これらの手順を繰り返し、画像内のすべてのアルギン酸ビーズを測定します。画像のスケールバーを測定します。100 µmのナイロンストレイナーを用いてマイクロビーズを回収します。そして、ビーズを二回蒸留水で洗浄します。スパチュラを用いて、0.1 mLのアルギン酸溶液から作製したすべてのマイクロビーズを2 mLマイクロ遠心チューブに移し、乾燥を防ぐためにガーゼで覆います。最後に、液体モードまたはメーカーの仕様に従い、オートクレーブでマイクロビーズを滅菌します。ビーズの乾燥を防ぐため、チャンバーに1.5 Lの蒸留水を加えます。BSL2フード内で、滅菌済みマイクロビーズを2 mg/mLの滅菌プロタミン溶液1 mLに加え、室温で1時間インキュベートする。プロタミンでコーティングされたマイクロビーズを、二回蒸留水で2回洗浄する。その後、ベンチトップ遠心機を用いて、室温で200 ×gで3分間遠心分離する。遠心分離後、シリンジを用いて水を吸引します。プロタミンをコーティングしたマイクロビーズを、滅菌済みの0.5 mg/mLヘパリン溶液1 mLと共に30分間インキュベートします。これにより、ヘパリン結合成長因子に対して高い親和性を持つポリ電解質複合体シェルが形成されます。インキュベーション後、シリンジを用いてヘパリンを吸引して除去します。次に、2回二回蒸留水で洗浄し、ポリ電解質複合体から未結合のヘパリンを洗い流します。100 µgのポリ電解質複合体に、1.5 mg/mLのbone morphogenetic protein 2またはNELL like molecule 1溶液を13.3 µLロードします。ポリ電解質複合体を4 °C、30 RPMで10時間振盪しながらインキュベートします。次に、マイクロビーズを1 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浸し、37 °Cで絶えず振盪させます。1日、3日、6日、10日、および14日後に、上澄み液を1 mL回収し、1 mLのPBSに交換します。メーカーのプロトコルに従い、CBQCAタンパク質アッセイ法を用いて、NELL like molecule oneの取り込みおよび放出効率を評価します。あるいは、ELISAを実施します。ポリエレクトライト複合体から放出されたNELL like molecule oneの生物活性は、ウサギ骨髄幹細胞におけるアルカリホスファターゼの発現を増加させる能力を測定することで評価します。24ウェルプレートの各ウェルにウサギ骨髄幹細胞を20,000個ずつ播種します。10%胎児牛血清を添加したDulbecco's Modified Eagle's Medium 1 mLを用い、37 °C、5% CO2条件下で1日間培養します。24時間後、培地を1 mLの骨分化誘導培地に交換し、37 °Cで7日間培養します。さらに5% CO2条件下とします。ポリエレクトライト複合体およびポリエレクトライト複合体NELL様分子を300 µgずつ、複合体と細胞を分離させるためにセルカルチャーインサート内に配置します。骨分化誘導培地の交換時にポリエレクトライト複合体マイクロビーズが流出するのを防ぐため、インサートを24ウェルプレートに設置します。3日ごとに、インサートの外側に針を設置して、骨分化誘導培地を1 mL吸引し、新鮮な骨分化誘導培地1 mLと交換します。培養7日目と14日目に、アルカリホスファターゼアッセイキットを用いてアルカリホスファターゼ活性を測定します。キットメーカーのプロトコルに従い、ポリエレクトライト複合体を生体吸収性医療グレードのポリカプロラクトン・リン酸三カルシウムスキャフォールドの細孔内に充填します。この操作は、BSL2チャンバー内で滅菌済みのスパチュラを用いて行います。ポリエレクトロライト複合体で充填したスキャフォールドに、1.5 mgまたはmLの骨形態形成タンパク質2またはNELL様分子1の溶液を添加します。その後、4 °Cで一晩インキュベートします。アルギン酸マイクロビーズを顕微鏡下で観察し、そのサイズと形態を確認します。非照射のアルギン酸マイクロビーズは球状であるのに対し、照射後のものは涙滴状になります。粒度分布は成長因子の取り込みにおける重要な要因です。また、サイズが減少すると比表面積が増加します。Image Jソフトウェアを用いてアルギン酸マイクロビーズを測定する場合、平均100個のマイクロビーズを測定することで、各バッチにおけるサイズ分布を適切に推定できます。成長因子の取り込みは適切なコーティング技術に依存するため、各コーティングの層の厚さを共焦点顕微鏡で観察します。ここでは、プロタミン、ヘパリン、NELL like molecule one、および骨形態形成タンパク質2の蛍光アナログとともにインキュベートしたアルギン酸マイクロビーズの共焦点レーザー走査顕微鏡画像を示します。放出された成長因子の生物活性を測定するために、アルカリフォスファターゼ活性を用います。ポリエレクトロライト複合体NELL様分子1で14日間培養後、アルカリフォスファターゼ活性の2.2倍の増加が観察されました。この手法を習得すれば、適切に行うことで5時間以内に完了させることが可能です。本手順を実施する際は、アルギン酸の濃度がマイクロビーズの安定性に影響を与えることに留意することが重要です。放射線照射したアルギン酸では4 wt%が必要であり、非照射のアルギン酸では2 wt%が必要でした。本手順に従うことで、多層コーティングにより成長因子の担持量をさらに増加させることができます。この手法により、組織工学分野の研究者は、他の疾患モデルにおける成長因子のデリバリーを探索することが可能になります。このビデオを視聴することで、サイズ分布の狭いポリ電解質複合体を作製できるようになります。

polyelectrolyte-complex-for-heparin-binding-domain-osteogenic-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

以下のセクションでは、我々は、生物医学アプリケーションで使用するためのアルギン酸ミクロスフェアを調製するための手順を概説します。我々は、特に1型糖尿病の潜在的な治療法として細胞やタンパク質のカプセル化という二重の目的のために多層アルギン酸ミクロスフェアを作成するためのテクニックを示しています。...

バイオメディカル応用のためのアルギン酸ミクロスフェアの生成

我々は、表面上にBMP-2の効率的な固定化を達成するための方法を記載している。我々のアプローチは、その遊離アミン残基を介してBMP-2の共有結合を達成するために、自己組織化単分子膜の形成に基づく。この方法は、細胞膜でのシグナル伝達を研究するための便利なツールです。...

共有結合は、自己組織化単分子膜の手法を用いて表面上のBMP-2の結合

このプロトコルは、エレクトロスピニングとマイクロスフェアを組み合わせて、ニューロンを指向するための組織工学的な足場を開発します。神経成長因子をPLGAマイクロスフェア内にカプセル化し、ヒアルロン酸(HA)繊維状足場にエレクトロスピニングしました。...

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設計されたマイクロチャネルを持つ骨のようなテンプレートを作成するための段階的な一般的なプロセスが提示されます。テンプレートの高い吸収能力と保持能力は、マイクロチャネルを介した毛細管現象によって実証されます。...

骨様テンプレートでのマイクロチャネルによって独特の毛細管現象は大骨欠損の回復のために細胞の動員を強化することができます

スキャフォールドは、細胞ニッチの複雑な生化学的および生物物理学的な微小環境を再現する必要があります。ここでは、界面高分子電解質錯体化繊維をプラットフォームとして使用して、持続的な生化学的放出を伴う複合多成分高分子足場を作成する方法を示します。...

生体分子の時間的に制御された放出のための界面高分子電解質繊維の複合足場

このビデオは、FACS単離のための密度勾配で胸腺上皮細胞（TEC）を濃縮するプロトコールを示しています。また、EAK16-II/EAKIIH6ペプチドを使用してTEC凝集体の形成を促進する様子も示しています。EAK16-II/EAKIIH6ハイドロゲルの微小環境は、TECの生存と機能を維持するために必要な3D構成を提供します。...

EAK 16-II / EAKIIH6自己組織化ヒドロゲルとFACS精製した胸腺上皮細胞の3-D集約を推進

ここでは、血管形成生体内可視化するプロトコルを提案と多光子顕微鏡による 3 D 足場でリアルタイム。重要な性マウス頭蓋骨骨欠損モデルにおける血管新生遺伝子組み換え足場を調べた。コントロールの治療群よりもより新しい血管を認めた.

頭蓋骨の重要な骨欠損修復の多光子顕微鏡In Vivo遺伝子組み換え 3 D-PLGA/nHAp 足場による血管新生を可視化

骨形態形成タンパク質 2 (BMP2)...

骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定

骨髄血管ニッチの in vitro モデルは、間葉系細胞および内皮細胞をプレキャスト3D...

イメージングマイクロプレート中のプレキャストポリ(エチレングリコール)(PEG)ヒドロゲルを用いた血管化骨形成骨髄ニッチの簡単な確立

間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植して軟骨内骨化術を行う骨治療は、従来の治療法の欠点を回避できる可能性があります。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、均一に分化した軟骨移植片のスケールアップや、 in...

間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

このプロトコルは、酸素供給のために設計された階層的に多孔質なUiO-66ナノ粒子の合成、ヘモグロビン封閉、表面PEG化について詳述しています。この手法は欠陥工学とひずみ促進バイオルソゴナル共役を組み合わせ、生物医学応用に適した透過性が高く生理学的に安定したキャリアを生成します。...

酸素供給用途における階層的多孔質UiO-66ナノ粒子における合成、ヘモグロビン封装および双直交PEG化

学ぶ ヘパリンとプロタミンを用いた高分子電解質複合体の作製法。BMP-2用量を20分の1に低減し、骨形成成長因子の放出を制御する革新的なドラッグデリバリーシステムを探索する。整形外科組織工学への応用が期待される。

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

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