Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

このアッセイの全体的な目的は、せん断応力条件下における細胞接着に対する、目的の処理の影響を判定することです。この手法は、インテグリン活性化を媒介する因子は何かなど、免疫細胞シグナル伝達分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、単一の接着分子であるインテグリンペアを、容易に再現可能なフローシステムで研究できることです。

この手法はLFA1の活性化に関する知見を得るために有効ですが、他のインテグリンの研究にも応用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、技術的なセットアップを正確に実行する必要があるため、困難に直面することがあります。CHO-ICAM細胞を回収するには、緩やかに振盪しながら、室温で0.5%trypsin EDTAを用いて1分間処理してください。

細胞が剥離し始めたら、4 mLの新鮮な培地でトリプシンを中和し、遊離した細胞数を計測します。細胞を1チャンバーあたり0.75 × 10⁵ cellsの濃度に希釈し、遠心分離機で回収します。次に、完全CHO-ICAM培養培地を用いて、フローチャンバー1つあたり30 µLでペレットを再懸濁し、フローチャンバーの各リザーバーに細胞懸濁液を30 µLずつゆっくりと播種します。

37 °C、5% CO2 のインキュベーター内で5分間静置し、細胞を沈降させます。次に、各チャンバーの両リザーバーに完全培地 200 µL を加え、プレートをインキュベーターに戻して一晩培養します。T細胞を回収後、細胞数を計測し、細胞懸濁液を 2 × 10⁶ cells/chamber の濃度に希釈します。

その後、細胞を遠心分離し、T細胞2×10⁶個あたり1%グルコースを添加したPBS 1mLでペレットを再懸濁します。次に、CFSEを1:1000に希釈した溶液でT細胞を室温で8分間、遮光して標識します。インキュベーション終了後、細胞を遠心分離し、1チャンバーあたり240µLの無血清RPMI培地でペレットを再懸濁します。

その後、各チャンバーあたりの細胞を1.5 milliliterチューブ1本ずつに分注し、ロードするまで37 degrees Celsiusのヒートブロックで保存します。イメージングの前に、顕微鏡のライブイメージングチャンバーを37 degrees Celsiusに温め、500 milliliterのガラスボトルに水を満たします。蓋に「in」と「out」とラベルを貼った2つの穴を開け、in穴からシリンジ接続用入力ホースを、out穴から入力リザーバー接続用ホースを通します。

60 mLのシリンジを用いて、入力ホースに60 mLの水を流し、続いて60 mLの37 °Cの無血清培地を流して、システム内から空気を除去します。ホースのプライミングが完了したら、システムを37 °Cに維持するため、入力セットアップ全体を顕微鏡のライブイメージングチャンバー内に移動させます。ホースとシリンジをチャンバーの外に出し、シリンジをシリンジポンプに装着します。

次に、廃棄液回収容器として使用する250 milliliterボトルの蓋に穴を開け、そこに出口チューブを通します。続いて、ボトル蓋を緩く締め、出力セットアップ全体をライブイメージングチャンバー内に設置します。次に、フローチャンバースライドを顕微鏡ステージに載せ、20X対物レンズを用いてCHO ICAM単層の焦点面を合わせます。

次に、非刺激コントロールから始めて、第1チャンバーの出力リザーバーから70 µLを3回分廃棄し、入力リザーバーにCFSE標識T細胞を70 µLずつ3回分加えます。T細胞が入口から出口へ移動している間に、各チャンバーのCFSE陽性T細胞のランダムな5領域を撮影し、フロー前の細胞数を取得します。次に、気泡が入らないように注意しながら、入力および出力ホースをフローチャンバーのリザーバーに同時に接続し、CFSE染色されたT細胞の観察を継続しながら、0.3 mL/minで剪断応力フローを開始します。

T細胞の移動が観察され次第、5分間のタイマーを開始し、5分が経過した時点でフローを停止させます。その後、各チャンバーにおいてCFSE陽性細胞を含む5つの視野をランダムに選択して撮影し、フロー後の細胞数を取得します。PMA刺激については、先ほど実演したように、T細胞を2番目のフローチャンバーにロードしてイメージングを行う直前に、T細胞1本をPMAで刺激し、陽性対照として使用します。

SDF-1 alpha刺激を行うには、まず第3チャンバーの出力リザーバーから培地を70 µLずつ3回分除去し、次に入力リザーバーに70 µLのSDF-1 alphaを添加します。5分後、出力リザーバーから70 µLずつ3回分を廃棄し、先ほどの実演と同様に、イメージング用の残りのT細胞チューブを添加します。これらの代表的な画像では、異なる刺激条件下において、流動前のT細胞数が同程度であることが観察されます。

5分間の連続的なせん断応力の後、PMAおよびSDF-1 alpha刺激条件下では付着するT細胞数が増加し、一方で非刺激のT細胞はわずかに付着したままでした。実際に、例えばSDF-1 alphaによるT細胞活性化は、非刺激のコントロール細胞と比較して、T細胞の付着をほぼ2倍に増加させます。さらに、SDF-1 alpha存在下または不在下における初代ヒトCD3陽性T細胞の付着率を算出すると、せん断応力下で付着した非刺激T細胞が15%であったのに対し、SDF-1 alpha活性化条件下ではT細胞の50%が付着しました。

この手法を習得すれば、1回のアッセイで6つの実験チャンバーまで合理的に拡張することが可能です。本手順を行う際は、コンフルエントなICAM単層のみを使用することが重要です。本手順の後、得られた画像に対して細胞形態解析などの他の手法を適用することで、さらなる疑問を解明することができます。

このビデオを視聴したことで、せん断応力条件下での細胞接着を定量化する方法について十分に理解できたはずです。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。