Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

このアッセイの全体的な目標は、せん断応力条件下での細胞接着に対する対象治療の効果を決定することです。この方法は、インテグリンの活性化を媒介する要因など、免疫細胞シグナル伝達分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、単一の接着分子インテグリンペアを容易に複製できるフローシステムで研究できることです。

この方法はLFA1の活性化に関する洞察を得ることができますが、他のインテグリンの研究にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、技術的なセットアップを正確に実行する必要があるため、苦労する可能性があります。CHO-ICAM細胞を回収するには、0.5%トリプシンEDTAで培養物を室温で1分間、穏やかに振とうしながら処理します。

細胞が剥離し始めたら、4ミリリットルの新鮮な培地でトリプシンを中和し、解離した細胞の数を数えます。細胞をチャンバー濃度あたり5個目の細胞の10倍の0.75倍に希釈し、遠心分離機でスピンダウンします。次に、ペレットをフローチャンバーあたり30マイクロリットル、完全なCHO-ICAM培養培地に再懸濁し、フローチャンバーのリザーバーごとに30マイクロリットルの細胞アリコートをゆっくりと播種します。

細胞を5%二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに5分間沈殿させます。次に、200マイクロリットルの完全培地を各チャンバーの両方のリザーバーに加え、プレートをインキュベーターに戻して一晩培養します。T細胞を回収した後、細胞懸濁液をカウントし、チャンバーあたり6番目の細胞濃度の10倍に希釈します。

次に、細胞を遠心分離し、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁し、6番目のT細胞に10分の2倍あたり1%グルコースを補給します。次に、室温で8分間光から保護されたCFSEの1〜1000希釈でT細胞を標識します。インキュベーションの終了時に、細胞を遠心分離し、チャンバーあたり240マイクロリットルの無血清RPMI培地にペレットを再懸濁します。

次に、セルを各チャンバーごとに1.5ミリリットルのチューブに分割し、ロードするまでチューブを摂氏37度のヒートブロックに保管します。イメージングする前に、顕微鏡のライブイメージングチャンバーを摂氏37度に温め、500ミリリットルのガラス瓶に水を入れます。蓋に内側と外側のラベルが付けられた2つの穴を開け、シリンジ接続入力ホースをインホールに通し、インプットリザーバー接続ホースをアウトホールに通します。

60ミリリットルのシリンジを使用して、入力ホースを60ミリリットルの水で洗い流し、続いて60ミリリットルの無血清37°C培地でシステムから空気を取り除きます。ホースがプライミングされたら、入力セットアップ全体を顕微鏡のライブイメージングチャンバーに移し、システムを摂氏37度に維持します。ホースとシリンジをチャンバーから出し、シリンジをシリンジポンプにロードします。

次に、250ミリリットルのボトルの蓋に穴を開けて出力廃棄物コンテナとして使用し、出力チューブを穴に通してボトルに通します。次に、出力ボトルの蓋を緩く固定し、出力セットアップ全体をライブイメージングチャンバーに入れます。次に、フローチャンバースライドを顕微鏡ステージに置き、20X対物レンズを使用してCHO ICAMモノレイヤーに焦点面を設定します。

次いで、非刺激制御から始めて、第1のチャンバの出力リザーバから3つの70マイクロリットル容量を廃棄し、T細胞と標識された3つの70マイクロリットル容量のCFCSを入力リザーバに加える。T細胞が入口から出口に移動している間に、各チャンバー内のCFSE陽性T細胞の5つのランダムフィールドを画像化して、プレフローセル数を取得します。次に、気泡が入らないように注意しながら、入力ホースと出力ホースをフローチャンバーのリザーバーに同時に取り付け、CFSCで染色されたT細胞を視覚的に観察しながら、毎分0.3ミリリットルでせん断応力の流れを開始します。

T細胞の動きが観察されたらすぐに、タイマーを5分間開始し、5分間の期間の終わりに流れを終了します。次に、各チャンバー内のCFSE陽性細胞の5つのフィールドを画像化し、フィールドをランダムに選択してポストフロー細胞数を取得します。PMA刺激については、先ほど示したように、T細胞をイメージングのために第2のフローチャンバーにロードする直前に、T細胞の1つのチューブをPMAで刺激してポジティブコントロールとして機能します。

SDF-1アルファ刺激については、まず第3チャンバーの出力リザーバーから3つの70マイクロリットルの媒体を取り除き、次に70マイクロリットルのSDF-1アルファを入力リザーバーに加えます。5分後、出力リザーバーから3つの70マイクロリットルアリコートを廃棄し、示したように、イメージング用に残りのT細胞のチューブを追加します。これらの代表的な画像では、異なる刺激条件下で同数のT細胞がプレフローで観察されています。

5分間の連続せん断応力の後、PMAおよびSDF-1α刺激条件下で接着性T細胞の数は増加しますが、刺激されていないT細胞は数個付着したままです。実際、例えば、SDF-1α T細胞の活性化は、刺激を受けていない対照細胞と比較して、T細胞の接着がほぼ2倍に増加します。さらに、SDF-1αの存在下または非存在下での初代ヒトCD3陽性T細胞の接着率を計算すると、SDF-1α活性化条件下でのT細胞の50%と比較して、刺激されていないT細胞の15%がせん断応力下で接着します。

一度習得すると、この手法は1回のアッセイで6つの実験チャンバーに合理的に拡張できます。この手順を試みるときは、コンフルエントな ICAM モノレイヤーのみを使用することを忘れないでください。この手順に続いて、キャプチャされた画像に対して細胞形状解析などの他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、せん断応力条件下での細胞接着を定量化する方法について十分に理解できるはずです。このビデオをご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。