単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

この手順の全体的な目標は、ヒト胎盤組織に由来する間葉系幹間質細胞を単離および拡大することです。こんにちは、マイク・ドランです。私は、オーストラリアのブリスベンにあるクイーンズランド工科大学のトランスレーショナルリサーチインスティテュートでグループリーダーを務めています。

こんにちは、私の名前はレベッカ・ペレカノスで、クイーンズランド大学臨床研究センターの研究者です。今日は、MSC分離手順のデモンストレーションを行います。胎盤は通常、出生後に廃棄されます。

組織の重量は5〜700グラムであるため、同種間葉系幹細胞のユニークな大きな供給源を提供します。一般的に、胎盤MSCの分離に不慣れな人は、胎盤の解剖学的構造に不慣れで、組織の処理方法に不慣れで、最終的なMSC培養物に母体または胎児のどのタイプの細胞が入るのかに詳しくないため、苦労します。研究者を支援するために、このビデオではこれらの重要な詳細について説明します。

この手順の最初のステップは、胎盤の解剖学的構造に自分自身を向けることです。この手順の2番目のステップは、ハサミを使用して、脱落膜、絨毛膜絨毛、または絨毛板のいずれかから10グラムの組織を手動で解剖することです。最初の 2 つの手順をここでも概略的にまとめます。

ステップ3では、落葉膜、絨毛膜絨毛、または絨毛板組織をさらにハサミで細かく刻みます。ステップ4では、ステップ5 I.In ディスパーゼおよびコラゲナーゼでの1〜2時間の消化により、細胞が組織の小片から解放され、細胞は細胞ストレーナーを介して洗浄することにより繊維組織から分離されます。次に、細胞を回収し、培地に再懸濁し、培養フラスコに入れます。

間葉系間質細胞(MSC)は、塑性接着の傾向と、細胞培養培地中で生存および増殖する能力に基づいて選択されます。最後に、結果セクションでは、拡張されたMSCを特性評価し、将来の実験で使用するために保存できます。胎盤は、妊娠中に胎児と母親の間で栄養素や老廃物を交換することを可能にする一時的な器官です。

胎盤は、帝王切開と赤ちゃんの安全な分娩後に無菌的に簡単に収集できます。胎盤は主に胎児由来の血管系と膜で構成されています。ただし、一部の母体細胞も含まれています。

胎盤は、母体、子宮由来の脱落膜細胞、および胎児由来の浸潤栄養膜の両方によって子宮に接続されています。通常、母体組織と胎児組織の間の正確な界面を目で識別することは不可能です。ただし、胎盤の胎児側は、臍帯が位置する側として簡単に識別できます。

赤ちゃんが出産すると、脱落膜組織の薄い層だけが胎盤に接続されたままになります。胎盤の物理的な配向を通じて、今日収穫する3つの組織を特定することが可能です。最初に採取される組織は母体の落葉膜です。

緑色のマーカーは、胎盤が子宮壁から排出された後に表面に残る脱落膜組織を指しています。胎盤の内部から採取される2番目の組織は、胎児の絨毛膜絨毛です。これは、図の青い円で示されます。

採取される3番目の組織は、胎児絨毛膜プレートです。この組織は、図の赤いマーカーで識別されます。では、始めましょう。

胎盤を生物学的安全キャビネットに入れます。胎児の膜を開き、胎盤の部分に向きを変えます。臍帯挿入、絨毛膜羊膜レーブ、または羊水嚢を伴う胎児側。

胎盤の胎児表面には、絨毛板に明らかな大きな血管があり、その上に羊膜があり、これもまた機械的に容易に分離されます。母方側は胎児側とは反対側にあり、明らかな子葉または葉があります。母体の表面が上を向いていることを確認してください。

胎盤または落葉の母体側から厚さ0.5cmの小片を切り取ります。解剖中は、ハンクのバランス塩溶液(HBSS)が入ったシャーレに組織片を入れて、組織を濡らし続けます。HBSSで皿の組織を攪拌して、血液を取り除きます。

50ミリリットルのチューブの10ミリリットルマーク(約10グラム)までチューブを満たすのに十分な組織を移します。手順の最後により多くの細胞が必要な場合は、この段階でより多くの組織を分離できることに注意してください。胎児の表面が上を向いていることを確認してください。

胎盤の胎児表面から羊膜を機械的に除去し、絨毛膜板を無傷のままにします。絨毛膜板を、その下の絨毛組織に約半センチメートルの深さで細片に切ります。次に、絨毛膜板が除去された胎盤の約1cmの深さの絨毛絨毛組織を解剖します。

組織をHBSSに入れ、前に行ったように組織の約10ミリリットルを測定します。液体の移し替えを最小限に抑えながら、ティッシュペーパー片を10cmのシャーレに移し、ハサミで約1立方ミリリットルの細かい部分に切り刻みます。細かく刻んだ組織を50ミルチューブに戻します。

残りのすべての組織サンプルについて繰り返します。調製したばかりの消化培地を、組織と少なくとも1対1の比率で加えます。チューブを数回反転させて混ぜます。

チューブ内の組織を消化培地と共生させ、振とうインキュベーター内で37度で1〜2時間インキュベートします。組織消化液が濁った外観に変わり、溶液中に白血血管がはっきりと見えたら、15ミリリットルのHBSSを加えて消化培地中の酵素を希釈します。遠心分離機が340 gに達するまでサンプルを短時間パルス遠心分離し、5秒間停止します。

これにより、大きな破片がチューブの底に集まらざるを得なくなります。サンプルを生物学的安全キャビネットに戻します。セルストレーナーを新しい50ミリリットルのチューブに入れます。

単核細胞を含む上清をストレーナーにピペットで移し、新しいチューブで溶出液をキャッチします。胎盤組織の破片を最初のチューブに残しておきます。15ミリリットルのHBSSを胎盤の破片に加え、激しく振とうしてより多くの細胞を回収し、サンプルをパルス遠心分離します。

再度、セルストレーナーをコレクションチューブに入れて、上清をチューブにピペットで入れます。サンプルの粘稠度によっては、上清をセルストレーナーに注ぐ方が適している場合があります。セルストレーナーを5ミリリットルのHBSSで洗います。

胎盤組織の破片が入ったチューブを廃棄します。上清サンプルを340 gで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。赤血球はペレットの底に層として見え、MSCを含む単核細胞は赤血球の上の明るい層です。

サンプルを生物学的安全キャビネットに戻します。上清を慎重にデカントして捨てます。チューブを指で数回フリックして細胞ペレットを取り外し、細胞ペレットを35ミリリットルのMSC培地に再懸濁します。

細胞懸濁液を組織10ミルあたり1つのT175フラスコに移し、5%CO2の37°Cインキュベーターで培養します。単離後、48時間後に培地を交換してください。コンフルエントになるまで、週に一度培養物に餌を与えます。

培養物は約14日までにコンフルエントになるはずです。最後に、細胞の増殖と凍結保存、MSC特性の解析、実験での使用を行います。48時間の培養後、MSCは組織培養プラスチックに付着しますが、造血および他の細胞集団は付着しません。

このとき、培地は35ミリリットルの新鮮な培地に置き換えられます。培養上清の外観は、胎盤ドナー間で大幅に異なる可能性があります。例 1 と 2 は、このバリエーションを示しています。

これらの2つの分離は同時に行われましたが、2つの異なる胎盤から行われました。一度洗浄すると、例3に示すように、培養物には赤血球や組織の破片がなくなり、その後の増殖結果は一般的に一貫しています。48時間の培地交換後、フラスコに付着する細胞はごくわずかです。

単離の7日後、線維芽細胞性MSCコロニーが見えるが、非MSC細胞も丸い細胞または緩く付着した細胞として存在する。単離の13日後、線維芽細胞性MSCコロニーは大きく、多くの場合、MSCの単層は十分にコンフルエントで継代する準備ができている。通過から以降、MSC単層は合流点で特徴的な渦巻きのような形態を発達させます。

胎盤MSCは、フローサイトメトリー分析により、古典的なMSCマーカープロファイルを示します。細胞は、CD73、CD105、およびCD90に対して陽性であり、CD45、CD34、およびHLA-DRの造血マーカーに対して陰性である。胎盤MSCは一般に、堅牢な骨形成分化を受けますが、脂肪形成分化は不十分です。

多くの出版物では、胎児の絨毛膜から単離された細胞は、培養時に胎児のMSCを生成すると仮定しています。しかし、以前に報告したように、このプロトコルを使用して胎児の絨毛膜に由来するすべての培養物は、母体の脱落膜MSC培養物に予想されるように、母体MSCに対して急速に濃縮されます。ここに示すデータは、脱落膜、絨毛膜絨毛、および絨毛膜プレート組織から単離された胎盤MSC培養物の胎児および母体の細胞組成を定量化したものです。

このビデオを見た後、胎盤組織に由来するMSCを分離および培養する方法についてかなり理解できるはずです。これらの方法が、胎盤由来MSCを使用する可能性のある研究や臨床アプリケーションに役立つことを願っています。