Name: 単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学ぶヒト胎盤組織からの間葉系幹細胞単離と増殖法。胎児側と母体側の組織を解剖し、コラゲナーゼ処理とプラスチック接着培養でMSCを効率的に得る方法を解説します。

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RPは、国立保健医療研究評議会（NHMRC）ポストドクトラル研修フェローシップによってサポートされていました。 VSは、クイーンズランド大学国際大学院の学生の奨学金によってサポートされていました。 MRDはNHMRCとインナー・ホイールオーストラリアによってサポートされていました。 私たちは、患者の同意およびサンプル収集を支援するための臨床および看護スタッフに感謝します。私たちは産科、胎児胎盤の開発と胎盤の解剖学で洞察に満ちた議論のための教授ニコラス・フィスク、教授ケリー・アトキンソン博士ローハンラウリーに感謝します。

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著者らは開示するものは何もない。

胎盤は、胎児または母体MSC 22を単離することができる物理的に大きく胎児母体器官です。ここで、我々は、胎盤の解剖学と命令具体的に脱落膜（母性）を解剖する方法については、絨毛膜絨毛（胎児）、および絨毛膜板（胎児）組織（ステップ2.2から2.4）の詳細な概要を提供します。その後、我々は、これら3つの組織（ステップ2.5から2.6）のそれぞれからMSCの分離を可能にする堅牢なプロトコルを概説しました。胎盤MSCの拡大は、効率的で、培養物は、骨髄由来MSCの培養（ 図3と図 4）と同様に表示されます。脂肪細胞への分化が（ 図5C）5一般的にはあまり効率的である一方で骨形成分化は、（ 図5B）信頼性があります。 フィールドに多くの新規参入者は、胎児の絨毛膜絨毛または絨毛膜板組織由来の培養物は、胎児のMSCについて濃縮されるであろうと推定されます。しかし、我々の手中のFeタル細胞濃縮は、DMEM-LG + FBSを5利用されている10％のみと過渡時の標準的なMSC増殖培地です。ここでは、オスの赤ちゃん由来胎盤組織を使用して代表的な結果を提供します。母体細胞はXX染色体を有するものとして識別可能であるが、男性の赤ちゃんから胎盤組織を使用することにより、胎児細胞は、容易に識別可能XY染色体を持つようです。6は、代表的な文化のためのXY FISH結果を示しています。胎児のMSC（XY）は、胎児の絨毛膜絨毛または絨毛膜板組織由来の初期培養物で（80％まで）濃縮されているが、これらの同じ培養物を急速に最初の2つの通路の上に母性（XX）MSCによって（〜100％）に抜かれています。標準培地では、DMEM-LG + 10％FBS、胎児組織は、培養中の胎児由来の細胞を負かす汚染少数の母性由来MSCから構成される。 このプロトコルで概説重要なステップは、胎盤の解剖学的構造のどこ胎児から感謝ですそして、母体組織は、最も効果的に収穫することができます。代表的な結果のセクションで概説したように、胎児組織の切開は、胎児由来のMSCのための過渡的な濃縮を可能にします。拡大培地製剤の改善は、特定の外因性の成長因子培地の補充を介して胎児由来MSC集団の選択的拡大を可能にし、（私たちのグループは現在、このような培地製剤を開発している）胎児ではなく、母体細胞について濃縮された細胞生成物を製造する必要があります。胎児のMSCが等価母体MSC集団37より大きい血管形成および免疫抑制特性を有すると主張されているように、胎児のMSC集団の製造は、多くの利点を有することができます。 記載の分離プロトコルの各々において、我々は、組織の約10gを使用しました。全体の胎盤は、一般的に500〜750グラムで、前作で我々は、自動化された組織ダイジェストと細胞増殖バイオリアクターのprocを介してそれを実証しました単一の胎盤4から7,000以上の臨床細胞用量を製造することが可能でなければならないことesses。これらの数字は、同種異系MSC治療における胎盤由来MSCの潜在的な適合性、およびかかわらず（胎児や母体の）MSC由来のこの方法の重要性を強調表示します。治療の観点から、ユーザーが細胞産物と確実にこの細胞製品を製造する能力を完全に理解していることが最も重要です。私たちは、ビデオは、胎盤解剖学を理解胎盤からMSCを分離し、その文化の可能性が高い胎児や母体の細胞組成物を予測する研究者を支援することを願っています。

間葉系幹/間質細胞（MSC）は、細胞ベースの治療法1で使用するための有望な候補として浮上しています。ほとんどのアプリケーションは、MSC媒介組織修復または免疫調節2を標的とするように思われます。これらの用途の多くでは、同種異系MSCは自家MSC 3と同程度に有効であってもよいです。同種MSCの使用は、多くの患者を治療するための単一のソース組織4からの複数の細胞用量の大規模製造と適合性であるという経済的利点を有します。 歴史的には、前臨床および臨床研究は、MSC由来の骨髄4からを利用しています。骨髄は、一般的にボランティアドナーの腸骨稜から収集されます。このプロセスは、侵襲的であり、骨髄（〜20mL）中のわずかな量は、単一の穿刺を介して収集されます。 MSCの臨床的に意味のある数字を生成することは、 インビトロ拡大に広範囲が必要です。セルの効力は、通路の数とともに減少します<suP&gt; 3、臨床的有効性のために必要な細胞の理論数は、より多くの細胞集団が展開されて増加するパラドックスを作成します。骨髄吸引とは対照的に、用語の胎盤は、ドナーに危険で帝王切開中に無菌的に採取することができる物理的に大きな始動組織（一般的に500〜750グラム4）、です。胎盤由来MSCは、骨髄由来MSCに優れた長期的な増殖5および免疫調節容量6を 、持っています。以前の研究では、単一の用語の胎盤は、最大7000の臨床用量4の製造のための十分なMSCが含まれていることを実証しました。これらの特性は、同種異系MSCの製造のための理想的な供給源組織プラセンタ作ります。 胎盤は、胎児と母親の両方の組織7からなる胎児母体臓器であり、したがって、胎児や母体の起源のMSCは、理論的には、分離することができます。以下の参考文献は、デを提供します開発と病理学上の尾情報、並びにヒト胎盤および付属器8,9の顕微鏡および肉眼検査。胎盤は、適切繁生絨毛膜（板）8で覆われた絨毛膜絨毛を構成する、主として胎児の血管および分泌と栄養膜と呼ばれる支持細胞から構成されています。分枝状の胎盤絨毛は栄養素、ホルモンと胎児と母親との間のガス交換を可能にする、子宮らせん動脈から配信母体血を浴びています。胎盤は、母体の脱落膜間質細胞を経由して子宮内膜に固定され、胎児extravillious栄養膜は、細胞外マトリックス8に散在しています。絨毛は、彼らが臍帯8を形成し 、胎児の絨毛膜板上に収束します。 胎盤由来幹細胞の最初の国際ワークショップ（2008年）の結果は、単離およびcharacterizatioを標準化する必要性の感謝でした人間の満期胎盤10からの細胞のn個。そのため、胎盤の解剖学の、異なる組織の切開は、MSCの単離および予想される培養の結果は、フィールドへの新規参入者のための圧倒的なことができます。このプロトコルでは、MSCの単離および拡大が続く胎盤絨毛組織の収穫は、徹底的に詳述されています。フローサイトメトリーを経由し、in vitro分化における MSCの特徴付けは、ルーチン5,11-13を考え、そのためだけに簡単にここで詳しく説明されています。 最近の系統的な文献レビュー14で強調したように、胎盤の絨毛から得られたMSCは、一般的に胎児であると仮定されています。 、研究のわずか18％が得られたMSCの起源を検討し、それらのが、研究の唯一の半分は、胎児MSCを報告し、他の半分は、母体または混合MSC集団を報告しました。本明細書中に説明した3つの組織成分のそれぞれ（絨毛、絨毛膜板及び基底脱落膜）がコンプです主に胎児膜/絨毛、および配信胎盤に付着したまま、子宮由来の母体細胞の小さな割合のosed。我々は以前に5,11を報告しているとして、母体MSCが望ましい場合ではなく、胎盤の胎児側より、胎盤の母側からMSCを単離し、より適切な出発物質であることを実証するデータを提供します。このプロトコルはまた、細胞培養への胎児や母体の貢献度を検証するXY FISHの使用を記載しています。これは、メーカーからの標準プロトコルであるが、この分析は、しばしば無視し、その重要性は、14を過小評価されています。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>ロングネーム:Hanks Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>ロングネーム:Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>trypsin-substitute</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>12563-029</td><td>ロングネーム:TrypLE Select</td></tr><tr><td>DMEM-LG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11885-092</td><td>長い名前:ダルベッコs Modified Eagles Medium-Low Glucose</td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>ロングネーム:Dulbecco's Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)</td></tr><tr><td>PBS (Mg+Ca+ free)</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>ロングネーム:ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水、マグネシウム、カルシウムフリー</td></tr><tr><td>抗抗</td>ギ<td>ブコ/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>ロングネーム:抗生物質-抗真菌溶液 x100</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド粉末または 4% 溶液</td><td>任意&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I</td><td>Invitrogen</td><td>17100-017&nbsp;</td><td>2,500U/ml</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>10 mg/ml in&nbsp; 0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041&nbsp;</td><td>10 mg / mlを水(20,000 U / ml)に溶かします。</td></tr><tr><td>Material</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Disposables:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50ml遠心分離管ファ</td><td>ルコンまたは任意のブランドの</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿、滅菌プラクティック(直径25cmおよび10cm)</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー(100 &mu;m)</td><td>ベクトンディキンソン</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>175および75 cm2(T175およびT75)組織培養フラスコ</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml、10 ml、25 mlの滅菌血清ピペット任意の</td><td>ブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Company</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td><ストロング>装備:</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;遠心分離機&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;組織培養用インキュベーター 37 &deg;C、5%CO<サブ>2</サブ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;滅菌ハサミとピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブラック&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットボーイまたは同等の</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ギルソンタイプのピペッターと滅菌チップ1,000 &micro;L、200 &micro;l、20 &micro;l。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロッキングまたは振とうインキュベーター(37°C;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>個人用保護具</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>洗浄液(血液に適しています)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>廃棄物容器、組織/血液</td><td></td><td></td><td></td>の正しい廃棄ビン</tr><tr><td>MSC特性評価用の試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗体(クローンID)</td><td>メーカー</td><td>カタログNo.</td><td>Isotype</td></tr><tr><td>CD73 (AD2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-183</td><td>マウスIgG1</td></tr><tr><td>CD105 (43A4E1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-941</td>マウス<td>IgG1</td></tr><tr><td>CD90/Thy-1 (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-403</td>マウス<td>IgG1</td></tr><tr><td>CD45 (5B1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-202</td>マウス<td>IgG2a</td></tr><tr><td>CD34 (AC136)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-954</td>マウス<td>IgG2a</td></tr><tr><td>HLA-DR (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-298</td>マウス<td>IgG2a</td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555446</td><td>マウスIgG1</td></tr><tr><td>CD146 (541-10B2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-849</td>マウス<td>IgG1</td></tr><tr><td>CD44 (DB105)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-180</td><td>マウスIgG1</td></tr><tr><td>Isotypeコントロール（クローンID)</td><td>メーカー</td><td>カタログNo.</td><td></td></tr><tr><td>マウスIgG1アイソタイプ（IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-212</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウスIgG1アイソタイプ(IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr>マウス<tr><td>IgG2a(S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-837</td><td></td></tr>マウス<tr><td>IgG2a(S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-849</td><td></td></tr><tr><td>MACSバッファーMiltenyi</td><td>Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>骨形成分化</ストロング></td><td><ストロング>メーカー</td><td>カタログNo.</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>ロングネーム:ダルベッコ's Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>ロングネーム:Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>Anti- anti-anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>ロングネーム:抗生物質-抗真菌液 x100</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>&β;-グリセロール リン酸塩</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸 2-リン酸</td><td>シグマ</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>アリザリンレッド S</td><td>シグマ</td><td>A5533-25G</td><td>カルシウムマトリックス染色用</td></tr><tr><td><ストロング>脂肪原性分化</ストロング></td><td><ストロング>メーカー</ストロング></td><td><ストロング>カタログNo.</ストロング></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>ギブコ/インビトゲン</td><td>11965118</td><td>ロングネーム:ダルベッコ」s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>ロングネーム:Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>Anti- anti-anti-Anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>ロングネーム:抗生物質-抗真菌剤溶液 x100</td></tr><tr><td>インスリン</td><td></td><td>Sigma I2643</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>インドメタシン</td><td>Σ</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>3-イソブチル-1-メチルキサンチン</td><td>シグマ</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>オイルレッドO溶液</td><td>シグマ</td><td>O1391-250ML</td>細胞の<td></td></tr><tr><td>胎児または母体の起源を決定するための脂質液胞染色用<-strong>XY FISHキット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XYコモソームFISHキット</td><td>Vysis(Abbott Molecular)</td><td>07J20-050</td><td>ロングネーム:CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen 直接標識蛍光DNAプローブキット</td></tr></tbody></table>

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

間葉系幹細胞/間質細胞(MSC)は、細胞ベースの治療に使用する有望な候補です。ほとんどの場合、治療反応は細胞用量依存的であるようです。ヒトの用語であるプラセンタはMSCが豊富で、物理的に大きな組織であり、一般的に出生後に廃棄されます。プラセンタは、同種MSCの複数の細胞投与の大規模製造に理想的な出発物質です。胎盤は、胎児組織または母体組織のいずれかを分離できる胎児の母体器官です。この記事では、胎盤の解剖学と、脱落膜(母体)、絨毛膜絨毛(胎児)、および絨毛板(胎児)組織を解剖する手順について説明します。次に、このプロトコルでは、解剖された各組織領域からMSCを単離する方法を概説し、それぞれの組織タイプに由来する拡張MSCの代表的な分析を提供します。これらの方法は、前臨床MSCの単離を目的としていますが、ヒトの治療用として胎盤MSCの臨床製造にも適応されています。

ここで我々が​​分離し、これらの組織から間葉系幹/間質細胞（MSC）の拡大が続く人間の満期胎盤から胎児と母体組織の切開のための方法を記載しています。

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

この手順の全体的な目的は、ヒト胎盤組織由来の間葉系幹細胞（mesenchymal stem stromal cells）を単離し、拡大培養することです。こんにちは、マイク・ドランです。私はオーストラリアのブリスベンにあるクイーンズランド工科大学トランスレーショナル研究センターのグループリーダーを務めています。こんにちは、私はクイーンズランド大学臨床研究センターの研究員のレベッカ・ペレカノスです。本日は、MSCの分離手順について実演します。胎盤は通常、出産後に廃棄されます。組織の重量が5〜700gであるため、同種間質系幹細胞の極めて大規模なソースとなります。一般的に、胎盤由来MSCの単離に不慣れな方は、胎盤の解剖学的構造や組織の処理方法、また最終的なMSC培養にどのような細胞（母体由来か胎児由来か）が含まれるかについて詳しくないため、困難に直面することがあります。研究者を支援するため、本ビデオではこれらの重要な詳細について解説します。この手順の最初のステップは、胎盤の解剖学的構造を確認することです。2番目のステップでは、はさみを使用して、脱落膜、絨毛、または絨毛板のいずれかから10 gの組織を手作業で切り出します。最初の2つのステップを、ここに改めて模式的にまとめます。ステップ3では、脱落膜、絨毛、または絨毛板組織をハサミでさらに細かく刻みます。ステップ4では、dispaseおよびcollagenase Iを用いて1〜2時間消化し、小さな組織片から細胞を遊離させます。ステップ5では、セルストレーナーで洗浄することで、細胞を線維性組織から分離します。その後、細胞を回収し、培地で再懸濁して培養フラスコに移します。間葉系ストローマ細胞（MSCs）は、プラスチックへの接着性と、細胞培養液中での生存および増殖能に基づいて選択されます。最終的に、「結果」のセクションにおいて、拡大培養されたMSCsの特性評価を行い、今後の実験に向けて保存します。胎盤は、妊娠中に胎児と母体の間で栄養素や老廃物の交換を行う一時的な器官です。胎盤は、帝王切開および赤ちゃんの安全な出産後、無菌的に容易に採取することができます。胎盤は主に胎児由来の血管系および膜で構成されています。しかし、そこには一部の母体細胞も含まれています。胎盤は、母体由来の子宮脱落膜細胞と、胎児由来の浸潤栄養膜細胞の両方によって子宮に接続されています。母体組織と胎児組織の正確な境界を肉眼で判別することは通常不可能です。しかし、胎盤の胎児側は、臍帯がある側として容易に識別できます。胎児が出産された後、脱落膜組織の薄い層だけが胎盤に付着したまま残ります。胎盤の物理的な向きを確認することで、本日採取する3つの組織の場所を特定することが可能です。まず最初に採取するのは、母体脱落膜です。緑色のマーカーは、胎盤が子宮壁から剥離した後に表面に残る脱落膜組織を示しています。胎盤内部から採取する2つ目の組織は、胎児側絨毛です。これは図中の青い円で示されています。次に採取する3つ目の組織は、胎児絨毛板です。この組織は、図の中の赤色のマーカーで示されています。それでは、始めていきましょう。胎盤を生物安全キャビネット内に置きます。胎児膜を広げ、胎盤の各部位を確認します。臍帯が挿入されている胎児側、絨毛羊膜、または羊膜嚢を確認してください。胎盤の胎児面では、絨毛板に大きな血管が明瞭に認められ、その上に羊膜が覆っています。羊膜は容易に機械的に剥離することが可能です。母体面は胎児面の反対側であり、明瞭な胎盤小葉（コチレドン）または葉状構造が見られます。母体面が上を向くようにしてください。胎盤の母体側または脱落膜から、厚さ0.5 cmの切片を切り出します。組織の乾燥を防ぐため、切り出しの際は組織片をハンクス平衡塩溶液（HBSS）を満たしたペトリ皿に入れます。HBSSを入れた皿の中で組織を攪拌し、血液を除去します。50 mLチューブの10 mLの目盛りまで満たすのに十分な組織（約10 g）を移します。なお、手順の最終段階でより多くの細胞が必要な場合は、この段階でより多くの組織を分離させることができます。胎児面が上を向いていることを確認してください。絨毛板をそのまま残し、胎盤の胎児面から羊膜を機械的に除去します。絨毛板を、その下の絨毛組織へ約0.5 cmの深さまで切り込みを入れて細長い帯状に切り出します。次に、絨毛板を除去した部位から胎盤内部へ約1 cmの深さまで、絨毛組織を切り出します。組織をHBSSに入れ、前回と同様に組織を約10 milliliters測定します。液体を最小限にして、組織片を10 centimeterのシャーレに移し、ハサミを用いて約1 cubic milliliterの細片に刻みます。刻んだ組織を50 milチューブに戻します。残りのすべての組織サンプルについて同様の操作を繰り返します。組織に対して少なくとも1:1の比率で、調製したばかりの消化培地を加えます。チューブを数回反転させて混合します。組織を消化液と共にチューブに入れ、振盪インキュベーターを用いて37°Cで1〜2時間インキュベートします。組織消化液が濁り、溶液中に白い血管がはっきりと見えたら、15 mLのHBSSを加えて消化液中の酵素を希釈します。サンプルをパルス遠心し、遠心力に340 gに達した状態で5秒間のみ回転させ、停止させます。これにより、大きなデブリがチューブの底に集まります。サンプルを生物安全キャビネットに戻します。新しい50 milliliterチューブにセルストレーナーを設置します。単核細胞を含む上清をストレーナーにピペットで移し、溶出液を新しいチューブに回収します。胎盤組織の残渣は最初のチューブに残します。胎盤残渣に15 millilitersのHBSSを加え、激しく振盪してさらに細胞を回収し、サンプルをパルス遠心分離します。再度、上清を回収チューブ内のセルストレーナーが入ったチューブにピペッティングします。サンプルの粘度によっては、上清をセルストレーナーに注ぐ方が適している場合があります。セルストレーナーを 5 milliliters の HBSS で洗浄します。胎盤組織の残渣を含むチューブを廃棄します。上清サンプルを340 gで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。赤血球はペレットの底部に層として観察され、MSCを含む単核細胞は赤血球の上のより明るい層となります。サンプルを生物安全キャビネットに戻します。上清を注意深くデカンテーションして廃棄します。チューブを指で数回弾いて細胞ペレットを剥離させ、35 millilitersのMSC培地で細胞ペレットを再懸濁します。組織10 milsあたり1本のT175フラスコに細胞懸濁液を移し、5% CO2を含む37°Cのインキュベーターで培養します。分離後、48時間後に培養液を交換してください。コンフルエントになるまで、週に1回培養液を補充します。培養約14日後には、細胞がコンフルエントになります。最後に、細胞を拡大培養して凍結保存し、MSCの特性を解析して実験に使用します。48時間の培養後、MSCは組織培養用プラスチックに接着しますが、造血系細胞およびその他の細胞集団は接着しません。ここで、培地を35 millilitersの新鮮な培養培地に交換します。培養上清の外観は、胎盤ドナーによって大きく異なる場合があります。例1と例2でこの変動を示しています。これら2つの分離は同時に行われましたが、2つの異なる胎盤から採取されました。洗浄後、例3に示すように、培養液から赤血球や組織残渣が除去され、その後の増殖結果は概して一貫しています。48時間後の培地交換後には、少数の細胞のみがフラスコに接着しています。分離から7日後には、線維芽細胞様MSCコロニーが観察されますが、円形または緩く接着した細胞として非MSC細胞も共存しています。分離から13日後には、線維芽細胞様MSCコロニーが大きくなり、多くの場合、MSC単層が十分にコンフルエントとなり、継代可能な状態になります。継代以降、MSC単層はコンフルエントになると、特徴的な渦巻き状の形態を示します。胎盤由来MSCは、フローサイトメトリー解析により、典型的なMSCマーカープロファイルを示します。これらの細胞はCD73、CD105、およびCD90に対して陽性であり、造血系マーカーであるCD45、CD34、およびHLA-DRに対しては陰性です。また、胎盤由来MSCは一般に、強力な骨分化能を示す一方で、脂肪分化能は低い傾向にあります。多くの出版物では、胎児絨毛から単離した細胞を培養すると胎児由来のMSCが得られると想定しています。しかし、我々が以前に報告したように、このプロトコルを用いて胎児絨毛から誘導されたすべての培養物は、母体脱落膜由来のMSC培養と同様に、急速に母体由来のMSCが濃縮されるようになります。ここに示すデータは、脱落膜、絨毛、および絨毛板組織から単離した胎盤MSC培養物の胎児細胞および母体細胞の組成を定量化したものです。このビデオを視聴することで、胎盤組織由来のMSCを単離し、培養する方法について十分な理解が得られたはずです。これらの手法が、胎盤由来MSCを利用する研究や臨床応用の際に役立つことを願っています。

isolation-expansion-mesenchymal-stemstromal-cells-derived-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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ヒト人工多能性幹細胞から間葉系間質細胞への分化のための2つの代表的な方法の比較

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ヒトBAMBI高MFGE8高 臍帯由来間葉系間質細胞の単離

ヒト脂肪由来の間質細胞内の転写の不均一性は、細胞表面マーカーと骨形成遺伝子を使用して単一細胞レベルで定義することができます。...

強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

学ぶヒト胎盤組織からの間葉系幹細胞単離と増殖法。胎児側と母体側の組織を解剖し、コラゲナーゼ処理とプラスチック接着培養でMSCを効率的に得る方法を解説します。

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

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