単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

この手順の全体的な目的は、ヒト胎盤組織由来の間葉系幹細胞（mesenchymal stem stromal cells）を単離し、拡大培養することです。こんにちは、マイク・ドランです。私はオーストラリアのブリスベンにあるクイーンズランド工科大学トランスレーショナル研究センターのグループリーダーを務めています。

こんにちは、私はクイーンズランド大学臨床研究センターの研究員のレベッカ・ペレカノスです。本日は、MSCの分離手順について実演します。胎盤は通常、出産後に廃棄されます。

組織の重量が5〜700gであるため、同種間質系幹細胞の極めて大規模なソースとなります。一般的に、胎盤由来MSCの単離に不慣れな方は、胎盤の解剖学的構造や組織の処理方法、また最終的なMSC培養にどのような細胞（母体由来か胎児由来か）が含まれるかについて詳しくないため、困難に直面することがあります。研究者を支援するため、本ビデオではこれらの重要な詳細について解説します。

この手順の最初のステップは、胎盤の解剖学的構造を確認することです。2番目のステップでは、はさみを使用して、脱落膜、絨毛、または絨毛板のいずれかから10 gの組織を手作業で切り出します。最初の2つのステップを、ここに改めて模式的にまとめます。

ステップ3では、脱落膜、絨毛、または絨毛板組織をハサミでさらに細かく刻みます。ステップ4では、dispaseおよびcollagenase Iを用いて1〜2時間消化し、小さな組織片から細胞を遊離させます。ステップ5では、セルストレーナーで洗浄することで、細胞を線維性組織から分離します。その後、細胞を回収し、培地で再懸濁して培養フラスコに移します。

間葉系ストローマ細胞（MSCs）は、プラスチックへの接着性と、細胞培養液中での生存および増殖能に基づいて選択されます。最終的に、「結果」のセクションにおいて、拡大培養されたMSCsの特性評価を行い、今後の実験に向けて保存します。胎盤は、妊娠中に胎児と母体の間で栄養素や老廃物の交換を行う一時的な器官です。

胎盤は、帝王切開および赤ちゃんの安全な出産後、無菌的に容易に採取することができます。胎盤は主に胎児由来の血管系および膜で構成されています。しかし、そこには一部の母体細胞も含まれています。

胎盤は、母体由来の子宮脱落膜細胞と、胎児由来の浸潤栄養膜細胞の両方によって子宮に接続されています。母体組織と胎児組織の正確な境界を肉眼で判別することは通常不可能です。しかし、胎盤の胎児側は、臍帯がある側として容易に識別できます。

胎児が出産された後、脱落膜組織の薄い層だけが胎盤に付着したまま残ります。胎盤の物理的な向きを確認することで、本日採取する3つの組織の場所を特定することが可能です。まず最初に採取するのは、母体脱落膜です。

緑色のマーカーは、胎盤が子宮壁から剥離した後に表面に残る脱落膜組織を示しています。胎盤内部から採取する2つ目の組織は、胎児側絨毛です。これは図中の青い円で示されています。

次に採取する3つ目の組織は、胎児絨毛板です。この組織は、図の中の赤色のマーカーで示されています。それでは、始めていきましょう。

胎盤を生物安全キャビネット内に置きます。胎児膜を広げ、胎盤の各部位を確認します。臍帯が挿入されている胎児側、絨毛羊膜、または羊膜嚢を確認してください。

胎盤の胎児面では、絨毛板に大きな血管が明瞭に認められ、その上に羊膜が覆っています。羊膜は容易に機械的に剥離することが可能です。母体面は胎児面の反対側であり、明瞭な胎盤小葉（コチレドン）または葉状構造が見られます。母体面が上を向くようにしてください。

胎盤の母体側または脱落膜から、厚さ0.5 cmの切片を切り出します。組織の乾燥を防ぐため、切り出しの際は組織片をハンクス平衡塩溶液（HBSS）を満たしたペトリ皿に入れます。HBSSを入れた皿の中で組織を攪拌し、血液を除去します。

50 mLチューブの10 mLの目盛りまで満たすのに十分な組織（約10 g）を移します。なお、手順の最終段階でより多くの細胞が必要な場合は、この段階でより多くの組織を分離させることができます。胎児面が上を向いていることを確認してください。

絨毛板をそのまま残し、胎盤の胎児面から羊膜を機械的に除去します。絨毛板を、その下の絨毛組織へ約0.5 cmの深さまで切り込みを入れて細長い帯状に切り出します。次に、絨毛板を除去した部位から胎盤内部へ約1 cmの深さまで、絨毛組織を切り出します。

組織をHBSSに入れ、前回と同様に組織を約10 milliliters測定します。液体を最小限にして、組織片を10 centimeterのシャーレに移し、ハサミを用いて約1 cubic milliliterの細片に刻みます。刻んだ組織を50 milチューブに戻します。

残りのすべての組織サンプルについて同様の操作を繰り返します。組織に対して少なくとも1:1の比率で、調製したばかりの消化培地を加えます。チューブを数回反転させて混合します。

組織を消化液と共にチューブに入れ、振盪インキュベーターを用いて37°Cで1〜2時間インキュベートします。組織消化液が濁り、溶液中に白い血管がはっきりと見えたら、15 mLのHBSSを加えて消化液中の酵素を希釈します。サンプルをパルス遠心し、遠心力に340 gに達した状態で5秒間のみ回転させ、停止させます。

これにより、大きなデブリがチューブの底に集まります。サンプルを生物安全キャビネットに戻します。新しい50 milliliterチューブにセルストレーナーを設置します。

単核細胞を含む上清をストレーナーにピペットで移し、溶出液を新しいチューブに回収します。胎盤組織の残渣は最初のチューブに残します。胎盤残渣に15 millilitersのHBSSを加え、激しく振盪してさらに細胞を回収し、サンプルをパルス遠心分離します。

再度、上清を回収チューブ内のセルストレーナーが入ったチューブにピペッティングします。サンプルの粘度によっては、上清をセルストレーナーに注ぐ方が適している場合があります。セルストレーナーを 5 milliliters の HBSS で洗浄します。

胎盤組織の残渣を含むチューブを廃棄します。上清サンプルを340 gで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。赤血球はペレットの底部に層として観察され、MSCを含む単核細胞は赤血球の上のより明るい層となります。

サンプルを生物安全キャビネットに戻します。上清を注意深くデカンテーションして廃棄します。チューブを指で数回弾いて細胞ペレットを剥離させ、35 millilitersのMSC培地で細胞ペレットを再懸濁します。

組織10 milsあたり1本のT175フラスコに細胞懸濁液を移し、5% CO2を含む37°Cのインキュベーターで培養します。分離後、48時間後に培養液を交換してください。コンフルエントになるまで、週に1回培養液を補充します。

培養約14日後には、細胞がコンフルエントになります。最後に、細胞を拡大培養して凍結保存し、MSCの特性を解析して実験に使用します。48時間の培養後、MSCは組織培養用プラスチックに接着しますが、造血系細胞およびその他の細胞集団は接着しません。

ここで、培地を35 millilitersの新鮮な培養培地に交換します。培養上清の外観は、胎盤ドナーによって大きく異なる場合があります。例1と例2でこの変動を示しています。

これら2つの分離は同時に行われましたが、2つの異なる胎盤から採取されました。洗浄後、例3に示すように、培養液から赤血球や組織残渣が除去され、その後の増殖結果は概して一貫しています。48時間後の培地交換後には、少数の細胞のみがフラスコに接着しています。

分離から7日後には、線維芽細胞様MSCコロニーが観察されますが、円形または緩く接着した細胞として非MSC細胞も共存しています。分離から13日後には、線維芽細胞様MSCコロニーが大きくなり、多くの場合、MSC単層が十分にコンフルエントとなり、継代可能な状態になります。継代以降、MSC単層はコンフルエントになると、特徴的な渦巻き状の形態を示します。

胎盤由来MSCは、フローサイトメトリー解析により、典型的なMSCマーカープロファイルを示します。これらの細胞はCD73、CD105、およびCD90に対して陽性であり、造血系マーカーであるCD45、CD34、およびHLA-DRに対しては陰性です。また、胎盤由来MSCは一般に、強力な骨分化能を示す一方で、脂肪分化能は低い傾向にあります。

多くの出版物では、胎児絨毛から単離した細胞を培養すると胎児由来のMSCが得られると想定しています。しかし、我々が以前に報告したように、このプロトコルを用いて胎児絨毛から誘導されたすべての培養物は、母体脱落膜由来のMSC培養と同様に、急速に母体由来のMSCが濃縮されるようになります。ここに示すデータは、脱落膜、絨毛、および絨毛板組織から単離した胎盤MSC培養物の胎児細胞および母体細胞の組成を定量化したものです。

このビデオを視聴することで、胎盤組織由来のMSCを単離し、培養する方法について十分な理解が得られたはずです。これらの手法が、胎盤由来MSCを利用する研究や臨床応用の際に役立つことを願っています。