Name: 以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデルインビボ細胞トラッキング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶ大腿骨ウィンドウチャンバーモデルを用いたマウス骨髄内好中球の長期的イメージング手法。多光子蛍光顕微鏡で血管構造と細胞動態を可視化し、免疫学および腫瘍学研究に応用する。

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著者らは、WCと撮影台を製造するためのプリンセスマーガレットがんセンターマシンショップから顕微鏡の支援のために大学健康ネットワークで高度な光学顕微鏡施設（www.aomf.caを）感謝したい、と氏はジェイソン・エリスでしょう。また、原稿編集のために博士アイリスKulbatskiに感謝したいと思います。

注：すべての動物の作業は、大学健康ネットワーク施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの＃2615で行いました。 マウスの1外科の準備<ol><li>手術に先立ち、オートクレーブにより、すべての手術器具や窓室（WC）を滅菌します。 2日前、手術とアモキシシリンの50 mg / kg体重で飲料水を補います。腹腔内に4時間、手術前にブプレノルフィンの0.1 mg / kg体重でマウスを注入します。 </li><li> 80ミリグラム/ kgのケタミンおよび13 mgの/ kgのキシラジン（注を含む350〜400μlの生理食塩水の腹腔内注射による無胸腺ヌードマウスを麻酔：これは施設内動物実験委員会によって承認された、と私たちは悪影響の経験がありませんでした）。足の反射をテストすることによって、適切な麻酔を確認してください。手順中の呼吸パターン、粘膜の色と足の反射のために観察し続けます。 </li><li>外科的な広報を行います手術中に無菌状態を維持するための安全キャビネットの下ocedures。手術中の体温を維持するために、外科用ドレープで覆われた電気加熱パッドの上にマウスを置きます。実体顕微鏡下ですべての外科的処置を実行します。 </li><li>手術中に湿った目を保つために眼軟膏を適用します。必要に応じて、外科手術の際に繰り返します。連続して7.5％ポビドンヨード、70％のイソプロピルアルコールおよび10％ポビドンヨードで拭いて、マウスの動作領域を殺菌し、この手順を2回繰り返します。 </li><li>側面から大腿骨に接近し、ブレード（＃15）とメスを用いて10ミリメートル縦皮膚切開を行います。筋肉の機能を確保するために鉗子や止血剤を使用して、鈍的切開により屈筋と伸筋の間の大腿骨を公開します。 </li><li>骨の下でU字型の棒を挿入し、WC（ 図1）をインストールします。 2つのナットを使用してウィンドウでバーを固定し、ためにナットを締めCEPS。歯科用セメントと骨とWCとの間の空間を満たします。 </li><li>骨髄腔への光アクセスを得るために、マイクロドリルで6×2ミリメートル2領域での皮質骨を削ります。 注：この手順を実行しながら、慎重に顕微鏡下皮質骨の菲薄化を検査します。骨の無傷の、ほぼ透明骨膜層を残します。 </li><li>ウィンドウ上に8ミリメートルのカバーガラスを配置し、所定の位置にそれを維持するためにスナップリングでカバーガラスを固定します。 </li><li>手術後のその機能を維持するために鉗子を使用して戻って元の場所への屈筋と伸筋の筋組織を再調整します。 5-0縫合糸と針ホルダを使用して、真皮を縫合。 </li><li>それは意識があると自由に移動できるようになるまで、回復のためのマウスを監視します。回収されたときに、新しいケージに動物を入れてください。 </li><li>回復後、（セクション2を参照）と同じ日または次の日に動物の画像取得を行います。 physiを監視します毎日マウスのCAL条件。 注：このような四肢、ハンチング、急速または浅い呼吸、後肢の腫脹、自傷、蜂巣および重度の皮膚炎に体重負荷のような物理的な条件を、監視します。 </li><li> 3日間のブプレノルフィン/ kg体重を0.1mgの腹腔内注射を与え、術後疼痛及び炎症の治療のための手術後5日間、メロキシカム1mg / kg体重。 5日間アモキシシリンを補充した水を提供し続けます。 </li><li>実験的なエンドポイントで、二次的方法（ 例えば 、頚椎脱臼）、続いてCO 2ナルコーシスにより動物を安楽死させます。 </li></ol>複合多光子共焦点顕微鏡を用いて2画像取得<ol><li>撮影に先立ち、80ミリグラム/ kgのケタミンおよび13 mgの/ kgのキシラジンを含む350〜400μlの生理食塩水の腹腔内注射によってマウスを麻酔。利用可能な場合あるいは、吸入可能麻酔薬を使用しています。眼軟膏を適用します。 </li><li>および好中球（アロフィコシアニン（APC） - 抗Ly6G抗体4μgの）（2 MDAフルオレセイン（FITC） - デキストランの0.65 mg）をラベリング血管系のための血管内色素の混合物を注入します。 </li><li>青から赤に励起波長を提供して705から980 nmのから二光子励起のために及ぶ多光子レーザー、ならびに単一光子レーザーを装備した直立組み合わせた多光子共焦点顕微鏡を使用してください。 </li><li>顕微鏡（ 図1B）上にカスタムメイドの撮影台を設定します。ワニ口クリップでWCの2つの端部をクランプすることにより、ステージ上でマウスを固定します。 注：WCを保持するための2つのワニ口クリップ、撮像中にマウスの生理的温度（37℃）を維持するために加熱要素：ステージの重要な構成要素です。 </li><li>二光子レーザーおよび共焦点システムの電源を入れ、「スタートシステム」をクリックすることで、画像取得ソフトウェアを起動します。 4つのタブ付きウィンドウ（見つけて、収集、処理、および保守）が開きます。 </li><li>イメージングチャンネルを設定します。取得タブの下に「スマートセットアップ」をクリックして、イメージングのために使用される染料を選択：FITC（488 nm励起、493から588 nmの発光）とAPC（633 nm励起および638から743 nmの発光を）。 「最良の信号」を選択し、「適用」をクリックします。 </li><li>第二高調波発生（SHG）撮像チャネルを手動で追加します。買収タブの「レーザー」ウィンドウの下に二光子レーザーをオンにします。 Channelsウィンドウの下で、トラックを追加するには、「+」記号をクリックしてください。 </li><li> SHGトラックを設定します。上下の矢印を使用してChannelsウィンドウの下に840 nmの波長を変更し、スライダバーを使用して「光パス」ウィンドウの下に415から425 nmで検出範囲を選択します。 </li><li>探しタブの下に「接眼レンズオンライン」をクリックします。関心のある領域を表示し、トンを回して手動でピントを調整するためにFITC用のフィルタ設定の下でFITCをクリックします彼は顕微鏡の側につまみを集中します。関心領域が配置されているときに、見つけタブの下に「接眼レンズオフライン」をクリックします。 </li><li>取得]タブをクリックします。 Channelsウィンドウの下にFITCトラックを選択して、5倍の対物レンズを用いてFITCデキストランの画像をプレビューするには、「ライブ」をクリックしてください。必要に応じてフォーカスを調整し、プレビューを停止するには、取得]タブの下で「停止」をクリックします。 </li><li>手動でレンズの上にホイールを動かすことによって、20X水目標に向けます。 20Xの対物レンズを用いてFITCデキストランのために再度画像を表示し、最適な信号とコントラストを達成するために、チャンネル・ウィンドウの下にマスターゲインとピンホールを調整します。 Channelsウィンドウの下にAPCとSHGのトラックを選択することで、他のチャンネルについて、この手順を繰り返します。 </li><li>撮像パラメータを選択します。そのウィンドウを開くには、「取得モード」をクリックします。高品質の画像を得るために、フレーム1,024×1024ピクセルにサイズ、および4Xの平均化を設定します。 </li><li> 2Dスナップショットを取得します。チャンネルが勝つの下にすべてのチャンネルを選択しますダウとは、買収のタブの下に「スナップ」をクリックしてください。画像の品質を確認し、必要に応じて撮影パラメータを変更します。 </li><li> 2Dタイムラプス画像を取得します。 <ol><li>時系列ウィンドウを開くために取得タブで「時系列」をオフに確認してください。間隔の下で0を入力し、時間間隔なしで連続40画像を撮影するためのスキャンの合計数は40。 注：40スキャンは7.5秒/フレームの走査速度及び600μmの×600ミクロンの画像サイズで約5分の長期時系列を生成します。間隔顕微鏡、画像取得の設定、カメラのフレームレートに応じて、スキャンの数を調整します。固定されたインターバル時間（&gt; 0秒）は、異なる時点で取得されたタイムラプス画像を比較するために使用することができます。長いタイムラプスイメージングの期間は、実験条件における好中球の予想平均速度（または関心のある他の細胞）に応じて必要となる場合があります。 </li></ol></li><li> 3D画像を取得します。<ol><li> Z-Stack]ウィンドウを開くために取得タブで「Z-スタック」をオフに確認してください。 FITCデキストランのための「ライブ」プレビューモードを開始します。サンプルの上に焦点を当て、「最初の設定」をクリックし、サンプルのもう一方の端に焦点を当ててクリックZスタックウィンドウに「最後のセット」。 </li><li> Zスタックウィンドウの下には10μmであると間隔を設定します。前のステップで選択した最初と最後の光学スライスに応じて、これは90から180ミクロンの全体的な光学的厚さで、10月20日のスライスを生成します。 注：zスタック間隔は、光学スライスの厚さを決定するピンホールの大きさに依存します。光学スライスの厚さよりも小さくなるように間隔を設定します。 </li><li>画像の収集を開始するために取得]タブの下の「実験を開始」をクリックします。 </li></ol></li><li> 3Dタイムラプス画像を取得します。 <ol><li>時系列を開くために取得タブで「時系列」をオフにチェックし、「Z-スタック」Zスタック窓。 </li><li>ステップ2.14と2.15で説明したように時系列およびZ-スタック取得パラメータを設定します。画像の収集を開始するために取得]タブの下の「実験を開始」をクリックします。 </li></ol></li><li>それが安定して無意識であることを確認するために撮像中にマウスを監視します。マウスは、撮影時の不安定および/または意識がある場合は、ステージからマウスを削除し、腹腔内に麻酔液の追加の100-150μLを注入し、撮影を続けます。 注意：不安定性の徴候は、取得した画像にアーチファクトをシフトとして見ることができるマウスの速い呼吸と動きを、含まれています。 </li><li>画像取得後、ステージからマウスを取ると、ケージに戻します。暖かいそれを維持し、それは意識があるまで、マウスを監視するために加熱ランプを使用してください。 </li></ol> 3.画像解析と定量化<ol><li> 3次元時系列データを分析するために画像解析ソフトウェアを使用。ソフトウェアを開いて、「アリーナ」ビューと呼ばれるオープン画面へドラッグして画像を追加します。それを開くには、画像ファイルをダブルクリックします。画像は「サーパス」ビューの下で開かれます。 </li><li> 2D / 3D画像を作成します。 <ol><li>右上にある &quot;詳細&quot;バーから、「画面の調整」ウィンドウを開くには、「編集/表示するディスプレイの調整」をクリックします。各チャネルのしきい値を調整することにより、蛍光表示を最適化し、画像を保存するスナップショットを取ります。 </li></ol></li><li>タイムラプス画像を使用してオブジェクトのトラックを生成します。 <ol><li>ビューを「サーパス」で分析する画像を開きます。 「サーパス」アイコンの下に見つかったオレンジ色のドットの画像とアイコンをクリックします。これは、新しい「スポット」ウィンドウを開きます。 </li><li> 「（時間以上）のトラックスポット」をオフにチェックして、次のステップに進むために青色の矢印をクリックしてください。 「ソースチャンネル」の下で追跡するためのオブジェクトを含むチャンネルを選択して、推定されたオブジェクトDIAMETを設定数値を入力して「推定XY直径」の下えー。次のステップに進むために青色の矢印をクリックしてください。 注：好中球の追跡のために、好中球に対するAPCの蛍光を含むチャンネルを選択して、好中球の既知のサイズに基づいて、12ミクロンへのオブジェクトの直径を設定します。 </li><li>ウィンドウで、検索し、下矢印をクリックして「品質」フィルタを選択します。ソフトウェアで定義されたスポットを観察し、スポットを含めるか除外するかを手動でしきい値を調整します。しきい値が定義されると、「トラッキング」のステップに行くために青色の矢印をクリックしてください。 </li><li>アルゴリズムの下で、下矢印をクリックして「自己回帰モーションアルゴリズム」を見つけ、選択します。 「最大ギャップサイズ」の「最大距離」のための10ミクロンおよび3のタイプは、パラメータの下で見つかりました。オフチェック追跡を開始し、次のステップに行くために青色の矢印をクリックし、「すべての検出されたオブジェクトとのギャップを埋めます」。 注：「自己回帰運動アルゴリズムは「F使用されていますまたはそれは、前の動きから予測位置に基づいて、トラックを生成するので、動きを指示したオブジェクト。 「最大距離」と「最大ギャップサイズは、「予想される寸法と速度追跡されているオブジェクトのと同様に、タイムラプス画像の全体の持続時間に応じて調整することができます。 </li><li>フィルタの種類]で、「トラック時間」フィルタを選択します。追跡を終了するには、緑色の矢印をクリックし、生成されたトラックを確認してください。必要に応じて手動でトラックをソートする前のステップに戻ります。 </li></ol></li><li>生成されたタイムラプス画像ドリフトの場合、翻訳ドリフトの正しいです。 <ol><li>鉛筆の画像でアイコンをクリックしてください。これは、「編集トラック」ウィンドウが開き、編集タブです。タイムラプス画像を調べて、すべての画像に移動すべきではないの参照場所を見つけます。 </li><li>画面の左上隅で、「ポインタ」ウィンドウを見つけるとCuをアクティブにする」を選択し、「オフチェックスポットを選択するためのrsor。参照スポットをクリックします。 </li><li> 「編集トラック」ウィンドウに「正しいドリフト」をクリックしてください。 「トランスレーショナドリフト」をオフに確認してください。ソフトウェアは自動的に画像の補正後のシリーズを生成します。 </li></ol></li><li>タイムラプス画像内のオブジェクトのトラックによって定義された携帯の動きを測定します。 <ol><li> 「編集トラック」ウィンドウの下に、「トラック」をオフにチェックし、細胞の動きを表すトラックを選択。選択したトラックは、時系列画像の黄色で強調表示されます。 </li><li> 「統計」ウィンドウ（統計]タブ）を開くために、グラフの画像とアイコンをクリックしてください。 </li><li> 「選択」の下では、トラックの速度が選択されたトラックのために意味を生成するには、下矢印をクリックして「トラックスピード平均」を選択します。別のトラックを選択し、トラックの速度は関心のあるすべてのセルの平均を測定するためのステップを繰り返します。 </li></ol></li></ol>

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<li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVacaru%2C+A+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).</li>
</ol>

著者には、競合する金融利害関係を持っていません。

リアルタイムは、骨髄中の動的な細胞プロセスの連続撮影は、そうでなければ、このような組織学および総血球数などの従来の技術を用いて得ることが挑戦されている情報を提供します。ここで説明した大腿骨WCモデルは、時間の経過とともに、骨髄中の細胞と構造変化を調査するためのユニークな機会を提供しています。大腿骨WCモデルは、以前に報告されているが、本発明の新規な設計は、成体マウスでの使用のための多くの互換性のあるビュー小さい全体WCサイズの大きな撮像視野を提供します。大腿骨WCモデルは、免疫および/またはトランスジェニックレポーターマウスなどのマウス系統の様々な使用することができます。 全体の時間とイメージングの品質を決定手術中の重要なステップがあります。大腿骨を露出させた場合、屈筋と伸筋の間の筋肉の唯一の鈍的切開が行われます。これらの筋肉の除去は、マウスとMUSの減少、移動度をもたらし得ますtが回避されます。また、皮質骨の粉砕を慎重に行わなければなりません。大腿血管網の構造的完全性を維持しながら、約50μmの粉砕は光学イメージングに適しています。骨の周りの歯科用セメントの適用は、外科的に露出面...

骨髄は造血及び免疫調節に関与する重要な器官です。これは、造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）を含む造血成分、および間葉細胞1を生じる非造血前駆細胞を含む間質成分から成ります。造血活性の三分の二は、骨髄細胞2の世代に捧げられています。 1-2×10 11細胞は、正常な成人2日ごとに生成して、特に、好中球の大多数は、骨髄で産生されます。好中球は、微生物感染に対する防御の第一線であり、ストレスが末梢 ​​好中球1,3を補完するために彼らの動員をトリガするまで、主に骨髄に予約されています。それらの抗菌効果に加えて、最近の研究では、形質転換成長によってプロ及び抗腫瘍形成表現型の両方を有する、癌生物学における好中球の重要な役割を示唆しています腫瘍微小環境4,5におけるシグナル伝達因子β（TGF-β）。また、研究では、循環中の好中球は、細胞毒性、抗転移効果8を発揮しながら、原発腫瘍に蓄積する好中球は、T細胞6,7の細胞傷害性機能を抑制することにより、プロ腫瘍形成および転移性効果を発揮することを実証しました。このように、骨髄中の造血細胞の研究、特に好中球は、免疫および腫瘍調節におけるそれらの役割を解明するために重要です。 組織病 ​​理学および完全な末梢血球数を日常骨髄9細胞および構造変化を評価するために使用されます。しかしながら、これらの方法は、異なる細胞集団または組織の微細構造の静的な情報を提供します。長手方向のインビボイメージングは、複数の細胞、血管および間質成分の動力学ならびに細胞からCを評価するための標準的な方法と組み合わせて使用することができます縦の方法でエル相互作用。顕微鏡の分解能10で生きている動物の画像化として定義される生体顕微鏡（IVM）は、必要な実験動物の数を減少させる、同じ試料中の経時動的な細胞プロセスを評価するために特に有用です。 IVMは、多くの場合、数週間から数ヶ月の期間にわたって画像化の対象の臓器にアクセスするために慢性的に移植窓室（WC）と組み合わされます。頭蓋と背皮脂WCのモデルが戻って1990年代半ばにさかのぼる使用の最も長い歴史を持っています。より最近では、このような乳房脂肪パッドおよび様々な腹部の器官のものなどの他の臓器特異的WCモデル11を開発されてきました。 生体内で骨髄を撮像するための典型的なアプローチは、薄くなった骨が最小限の外科的介入12-14と単一細胞の直接可視化を可能にしたマウスの頭蓋冠、の主に関与露出を持っています。しかし、頭蓋冠の骨髄は、bの場合があり電子HSPCs 15の維持・発展を減少示し頭蓋冠でHSPCsと低酸素細胞の低い数、によって示されるように、そのような長い骨のような他の骨、のとは異なります。したがって、長骨内の細胞成分を評価するための代替的なアプローチが研究されてきました。これらは、大腿骨の髄16と背側皮下脂肪WC 17で分割大腿骨の異所性移植の直接のエクスポージャーが含まれます。しかし、前者はより長い期間にわたって、セルラー構造的および機能的変化の追跡を許可しない端末の手順であり、後者の可能性が高いが原因背側皮下脂肪WC内部の異所性サイトへの大腿骨の移植に正常な骨髄機能を妨げます。時間をかけて大腿骨髄の同所シリアルイメージングを可能にするもう一つの方法は、大腿骨にWCを使用することです。一つ前のレポートでは、使用して大腿骨髄中の微小循環の長期的なイメージングを実証しましたマウス18で大腿骨WC。さらに、著者らは、骨髄転移をモニタリングにおけるその有用性を示す、大腿骨における腫瘍細胞の可視化を示しました。しかし、このWCの設計は、それによって作り、その大きなサイズ（1.2センチ直径）と大規模なマウスのみに適した比較的小さな撮影領域（直径4mm）、（26〜34グラム、生後3-6ヶ月）によって制限されていました日常的な使用のための非現実的なアプローチ。 したがって、小さい全体のサイズと大きい内側の撮像領域を持つ新しいWCは、本研究の目的のために設計されました。この研究の目的は、大腿骨の髄内に種々の細胞型を撮像するための方法を提供することでした。大腿骨WCモデルは、社内で開発された3D血管網内の好中球を可視化し、追跡するために使用されました。このモデルを用いて、骨髄のIVMは、40日間に渡って連続的に行うことができます。このアプローチは、免疫調節A、造血のプロセスを解明するための様々な分野に適用することができますND腫瘍発生。

<table><tbody><tr><td>NRCNU-F 無声性ヌードマウス</td><td>Taconic</td><td>Ncr ヌード</td><td>8-10週齢、雌</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>バクスター</td><td>JB1302P</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン塩酸塩</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&nbsp;</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バイエル ヘルスケア, バイエル インク</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>外科用ドレープ</td><td>プロキシマ</td><td>DYNJP2405</td><td></td></tr><tr><td>電気加熱パッド</td><td>ライフ ブランド</td><td>57800827375</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>ライカ M60</td><td></td></tr><tr><td>眼軟膏 (涙液)</td><td>ノバルティス&nbsp;</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>7.5% ベタジン</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>70% イソプロピル アルコール</td><td>GreenField</td><td>P010IP7P</td><td></td></tr><tr><td>10% ベタジン</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-150-05</td><td></td></tr><tr><td>メス ハンドル</td> <td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>メス ブレード (#15)</td> <td>VWR</td><td>89176-368</td><td></td></tr><tr><td>春はさみ湾曲</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>ベビーミックスヘモスタット</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>エクストラファイングレーフ鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>ハルステッド-モスキート止血ファイン</td><td>サイエンスツール</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>マイクロドリル</td><td>ハーバード Apparaus</td><td>72-6065</td><td></td></tr><tr><td>マイクロドリル バリ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>19007-14</td><td></td></tr><tr><td>大腿骨窓室</td><td>PMCC マシン</td><td>ショップ カスタム デザイン</td><td>9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (外径から内径まで)、2.16 mm (2 つの穴の半径)、13.9 mm (2 つの穴の間の距離)、0.7 mm (厚さ)</td></tr><tr><td>U 字型バー</td><td>PMCC マシン ショップ</td><td>カスタム デザイン</td><td>13.8 mm (長さ), 1.6 mm (幅), 3.7 mm (高さ)</td></tr><tr><td>カバーガラス (8 mm)</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>HBIO 64-0701 CS-8R</td><td></td></tr><tr><td>リテーニング リング (8 mm)</td><td>ACKLANDS GRAINGER</td><td>UNSPSC #</td><td></td></tr> 31163202 <tr><td>ナット (六角形ステンレス鋼)</td><td>Fastenal</td><td>70701</td><td></td></tr><tr><td>歯科用セメント</td><td>3M</td><td>RelyX U200</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸 (5-0 モノソフ ブラック)</td><td>Covioien</td><td>SN-5698</td><td></td></tr><tr><td>Halsey ニードル ホルダー</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン(テムゲシック)</td><td>レキットベンキー</td><td>ザーDIN 0281251</td><td></td></tr><tr><td>メロキシカム(メタカム)</td><td>ベーリンガーインゲルハイム</td><td>DIN 02240463</td><td></td></tr><tr><td>アモキシシリン(クラマボックス)</td><td>ファイ</td><td>ザーDIN 02027879</td><td></td></tr><tr><td>FITC-デキストラン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>APC-アンチマウスLy-6G(Gr-1)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-9668</td><td></td></tr><tr><td>2光子顕微鏡 LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td></td></tr><tr><td>イメージングステージ</td><td>PMCC マシンショップ</td><td>カスタムデザイン</td><td>15.9 cm (長さ)、11 cm (幅)、0.9 cm (高さ)</td></tr><tr><td>Imaris ソフトウェア</td><td>Bitplane</td><td>Imaris 8.0</td><td>プロトコルのセクション3に記載されている画像解析ソフトウェア&nbsp;</td></tr><tr><td>Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2012</td><td>議定書のセクション2に記載されている画像取得ソフトウェア&nbsp;</td></tr></tbody></table>

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル<em&gt;インビボ</emマウス骨髄内&gt;細胞トラッキング

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

骨髄は、さまざまな造血細胞と非造血細胞を含む複雑な器官です。これらの細胞は、造血、免疫調節、腫瘍調節など、多くの生物学的プロセスに関与しています。組織学や血球数など、骨髄における細胞の作用を理解するために一般的に使用される方法は、in vivoで複数の細胞成分の動的な作用を捉えるのではなく、静的な情報を提供します。標準的な方法を補完するために、マウスの骨髄の細胞と構造の連続的なin vivoイメージングを可能にするために、ウィンドウチャンバー(WC)ベースのモデルが開発されました。このプロトコルは、大腿骨骨髄への長期的な光学的アクセスを容易にするために、大腿骨にWCを設置するための外科的手順を説明しています。特に、その実験的有用性を実証するために、このWCアプローチを使用して、大腿骨の血管ネットワーク内の好中球を画像化および追跡し、骨髄内の免疫細胞の輸送と制御を視覚化および定量化する新しい方法を提供しました。この方法は、造血、幹細胞移植、がんなどの病的状態における免疫応答など、マウスの骨髄におけるさまざまな生物学的プロセスの研究に応用できます。

マウス大腿骨髄が正常に個々の好中球および血管ネットワークの可視化を可能にするためにWCを使用してアクセスします。1は、WCの楽器を示し、内部の光学アクセスを得るために、大腿骨と皮質骨の菲薄化の露出を伴う外科手術を、説明図骨。手術はマウスで忍容性が良好です。それらは苦痛の無い報告書では、このような5日後に手術のためのWCに後肢の腫脹、非重量は手足にベアリング、自傷、蜂巣や皮膚炎、ならびに損傷などの有害な物理的反応、について評価しました。特に、ウィンドウは介入後の細胞と構造変化の長期的な評価を可能にする、最大40日間IVMのために光学的に透明なままです。 骨髄内の血管系は、FITCデキストランのような血管内の色素によって可視化することができます（ 図2）。コントラスト色素の注入に依存するため、取得された画像は、十分な血流が存在する機能的血管構造を表します。...

このプロトコルは、生体内で大腿骨骨髄内の細胞の動きを追跡するために使用できる新しいマウス大腿骨窓室モデルについて説明しています。生体内多光子蛍光顕微鏡は、大腿骨骨髄の3つの成分(血管系、コラーゲンマトリックス、好中球)を経時的にイメージングするために使用されます。

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

この手順の全体的な目標は、大腿骨の上に埋め込まれた慢性窓室を通じて、マウス骨髄内の血管構造における好中球の長期的な顕微鏡イメージングと追跡を行うことです。この方法は、感染、腫瘍形成、および腫瘍転移の調節における単球の役割に関する免疫学および腫瘍学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、造血の中心部位である大腿骨髄への長期的な顕微鏡的アクセスを可能にし、従来の方法では取得が困難であった動的な情報を提供することです。この方法は血管ネットワーク内の好中球イメージングに特異的ですが、関心のある他の免疫細胞集団の可視化にも使用できます。手術当日は、アシミックヌードマウスのつま先つまみに反応しないことで、適切な鎮静レベルを確認します。次に、マウスを手術用ドレープで覆われた電気加熱パッドの上に置き、実体顕微鏡で観察します。次に、動物の目に軟膏を塗布し、7.5%ポビドンヨード、70%イソプロピルアルコール、および10%ポビドンヨードを含む2回の連続ワイプで手術領域を滅菌します。動物を準備したら、15番の刃が付いたメスを使用して、外側から大腿骨に近づく縦10ミリメートルの皮膚切開を行います。次に、鉗子と止血剤で鈍く解剖し、屈筋と伸筋の間の大腿骨を露出させます。大腿骨が観察できるようになったら、骨の下にU字型のバーを挿入し、窓室を取り付けます。2つのナットを使用して、バーを窓に固定します。次に、鉗子でナットを締めます。鉗子を使用して、屈筋と伸筋の筋肉組織を元の位置に戻します。骨と窓室の間のスペースを歯科用セメントで満たし、窓室を所定の位置に固定します。次に、マイクロドリルを使用して皮質骨に6 x 2ミリメートルの領域を粉砕し、骨髄腔への光学的アクセスを取得します。骨のほぼ透明な骨膜層が得られたら、8ミリメートルのカバーガラスを窓に置き、スナップリングを使用してカバーガラスを所定の位置に固定します。次に、5-0縫合糸とニードルホルダーで真皮を閉じます。次に、マウスを清潔な寝具を備えた新しいケージに入れ、完全に回復するまで監視します。ウィンドウチャンバーを通じて多光子顕微鏡と共焦点顕微鏡を組み合わせた画像を取得するには、まず、適切な蛍光血管系好中球標識溶液を尾静脈によってマウスに注入します。ウィンドウチャンバーの端をワニ口クリップで固定して、マウスをカスタムメイドのステージに固定します。次に、イメージングステージを多光子顕微鏡と共焦点顕微鏡の組み合わせに置きます。マウスが固定されたら、2光子レーザーと共焦点システムをオンにし、[システムの開始]をクリックして画像取得ソフトウェアを起動します。イメージングチャンネルを設定するには、[Acquisition]タブで[Smart Setup]をクリックし、イメージング用のレーザーを選択します。[最適な信号] を選択し、[適用] をクリックします。[レーザー] ウィンドウで 2 光子レーザーをオンにし、第 2 高調波発生の適切な取得波長を設定して、第 2 高調波発生画像取得チャネルを手動で追加します。[Locate] タブで [Oculars online] をクリックし、顕微鏡で目視検査により対象領域を特定します。「Oculars offline」をクリックし、「Acquisition」タブを開きます。「Channels」ウィンドウで「FITC Track」を選択し、「Live」をクリックして、5倍対物レンズでFITC-Dextran画像をプレビューします。必要に応じてピントを合わせます。次に、「Acquisition」タブの下の「Stop」をクリックして、プレビューを停止します。次に、手動で 20x 水対物レンズを選択し、FITC-Dextran 画像を再度表示し、チャンネル ウィンドウの下のマスター ゲインとピンホールを調整して、最高の信号とコントラストを実現します。3 つのチャンネルすべてで最適な画像が得られたら、[チャンネル] ウィンドウですべてのチャンネルを選択し、[取得] タブの [スナップ] をクリックして 2D スナップショットを取得します。次に、2Dタイムラプス画像を取得するには、時系列を選択して時系列ウィンドウを開き、間隔にゼロ、スキャンの総数に40を入力して、時間間隔なしで40枚の画像を連続して取得します。画像を分析するには、適切な画像解析ソフトウェアを開き、画像ファイルを開きます。タイムラプス画像を使用してオブジェクトトラックを生成するには、Surpassビューで分析する画像を開き、オレンジ色の点の画像があるアイコンをクリックして新しいSpotsウィンドウを開きます。トラッキングパラメータを設定したら、[検出されたすべてのオブジェクトでギャップを埋める]ボックスをクリックしてトラッキングを開始します。そして、青い矢印をクリックして次のステップに進みます。[Filter Type] で [Track Duration] フィルターを選択し、緑色の矢印をクリックしてトラッキングを終了します。次に、生成されたトラックを確認し、必要に応じて前の手順に戻ります。タイムラプス画像のオブジェクト トラックによって定義される細胞の動きを測定するには、[トラックの編集] ウィンドウで [トラック] ボックスを選択し、目的のセルの動きに対応するトラックを選択します。選択したトラックは、時系列画像で黄色で強調表示されます。最後に、[統計]タブで、グラフの画像のアイコンをクリックして、[統計]ウィンドウを開きます。次に、[選択] で下矢印をクリックして [Track Speed Mean] を生成します。骨髄内の血管系は、FITC-デキストランなどの血管内色素によって視覚化できます。コントラストは染料の注入に依存するため、取得された画像は、十分な血流がある機能的な血管系を表します。これらの画像は、異なる時点での骨髄の同じ領域の画像で、数日間にわたって血管内空間と血管外空間の両方に好中球が存在することを示しています。この皮質骨(主にコラーゲン線維から構成される)のイメージングは、第2高調波発生によって行われ、好中球による血管組織への浸潤をさらに示しています。これらの好中球は、各スキャンの間に追加の時間間隔を空けずに骨髄血管ニッチで追跡され、その動きを正確に追跡することができました。その後、画像解析ソフトウェアによって生成されたトラックの速度を測定して、各セルの速度を分析できます。この手順に続いて、ex vivo標識細胞やトランスジェニックレポーターマウスを使用するなどの他の方法を使用して、腫瘍の進行や転移に対する免疫細胞の影響など、in situ内の他の生物学的プロセスを評価できます。このビデオを見れば、骨髄血管ニッチやコラーゲン構造を通じて好中球を追跡するために、マウスの大腿骨にウィンドウチャンバーを設置する方法についてよく理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このプロトコルは、マウスを犠牲にすることなく大腿骨骨髄(BM)の連続サンプリングの手順を説明しています。この手順により、マウスのBM組成の経時的な縦断的研究が容易になり、ex...

生きたマウスにおける大腿骨髄吸引

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。...

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）および骨髄ニッチの間の相互作用の性質は、ほとんど理解されている。カスタムハードウェアの修正および多段階取得プロトコルは、ex vivo画像骨髄エリア内ホーミング標識HSPCs、追跡相互作用及び運動に二光子共焦点顕微鏡の使用を可能にする。...

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

単球は自然免疫の主要な調節因子であり、末梢の単核食作用系の更新や炎症の場合に重要な役割を果たします。この原稿では、単球の動員メカニズムを研究するためのマウスのカルバリア骨髄のリアルタイムイメージングの手順について説明します。...

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

骨髄の組織学的データを定量的に分析する戦略が提示されます。組織切片中の蛍光標識細胞の共焦点顕微鏡検査により、2次元画像が得られ、自動的に解析されます。異なる細胞タイプの共局在解析をシミュレーション画像からのデータと比較し、細胞相互作用に関する定量的な情報を提供します。...

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

ホーミングや骨髄 (BM) のニッチに造血細胞の生着を研究する遺伝的動物モデルとの組み合わせで、calvarium の生体内蛍光顕微鏡 (IVFM)...

骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

マウスにおける異なるヒト化骨髄ニッチを作成し、ライブイメージする方法が提示される。ヒト間葉系細胞によって作り出された支持的ニッチに基づいて、ヒト内皮細胞の添加はヒト血管の形成を誘導するが、rhBMP-2の添加はヒト - マウスキメラ成熟骨組織の形成を誘導する。...

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

ここでは、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、その 場で 巨核球の超構造を解析するプロトコルを紹介する。マウス骨マロウは、収集され、固定され、エポキシ樹脂に埋め込まれ、超薄切片で切断される。コントラスト染色後、骨髄は120kVのTEM顕微鏡下で観察される。...

イン・シトゥ 透過電子顕微鏡を用いたネズミ巨核生物の探索

ここでは、2光子顕微鏡を用いて生きているマウスの頭蓋骨の骨髄にメガカルヨサイトおよびプロ血小板をイメージングする方法について説明する。...

イン・ヴィヴォ マウスの頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング

生体内顕微鏡検査は、組織再生や腫瘍発生などのダイナミックな生物学的プロセスの研究を可能にします。非常に動的な組織である頭蓋骨髄は、造血と血管機能に関する洞察を提供します。生体適合性のある3Dプリントされた頭部固定インプラントを使用すると、反復的な縦方向のイメージングが可能になり、組織ダイナミクスと腫瘍微小環境の理解が深まります。...

Calvarial Bone Marrowにおける血管動態の生体内縦断的イメージング

マウス骨髄損傷モデルは、出生後の骨形成を膜内骨化で研究するための有用なツールです。この簡略化された外科的プロトコルは、損傷後の新しい骨形成と細胞反応の下流評価のための骨髄アブレーション手順を説明しています。...

マウス骨髄損傷モデルにおける膜内骨化による出生後骨形成の研究方法の改善

学ぶ大腿骨ウィンドウチャンバーモデルを用いたマウス骨髄内好中球の長期的イメージング手法。多光子蛍光顕微鏡で血管構造と細胞動態を可視化し、免疫学および腫瘍学研究に応用する。

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル

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