Name: によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用 Q熱リケッチアのsiRNAサイレンシング中 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学ぼうsiRNA遺伝子サイレンシングとFRETベースレポーターアッセイを用いた細菌エフェクター転位の測定法。Coxiella burnetiiを用いて宿主細胞との相互作用を解析し、細胞微生物学の理解を深める。

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この作業は、HJNに授与されたNational Health and Medical Research Council (NHMRC)の助成金（Grant ID 1062383 and 1063646）によって支援されました。EALは、Australian Postgraduate Awardによってサポートされています。

著者らは開示するものは何もない。

分泌系、および細菌エフェクタータンパク質の宿主細胞の細胞質へのこれらのシステムの輸送は、多くの病原性細菌は、一意複製ニッチ内感染を確立するために利用する重要な病原性要素です。多くの研究グループの焦点は、細菌のエフェクターおよび宿主タンパク質およびこれらのエフェクターは、宿主細胞経路上に持っている影響力の間の相互作用を調査することでした。非常に限られた研究は、もしあれば、成功した細菌エフェクター転位のために必要であると宿主タンパク質の可能性を検討しました。 本研究では、偏性細胞内病原体Q熱リケッチア 、人獣共通感染Q熱の原因物質を使用していました。宿主細胞への侵入後、 コクシエラ含有液胞は、受動的に、それは非常に高い数字に複製し、酸性リソソーム由来の液胞に到達するまで、標準的なエンドサイトーシス経路を介して入稿します。別にアドバンタを取ってから通常のホストの人身売買経路のGEは、成功した複製ニッチを確立するコクシエラの能力はまた、機能タイプIVB分泌システム（T4SS）とそれに続くエフェクター転座8,17に依...

Q熱リケッチアは人獣共通ヒト感染のQ熱の原因となるユニークな細胞内病原体です。この疾患は、多くの場合、暴露1の後に心内膜炎の年として現れる生命を脅かす慢性感染症に無症候性抗体陽転から延びる臨床症状の広いスペクトルに関連しています。ヒトへの感染は、反芻動物感染症、特に、乳牛、羊やヤギのための主要なリザーバと、主に汚染されたエアロゾルの吸入を介して行われます。これらの動物におけるコクシエラ感染は通常、無症候性であるが、感染は流産を引き起こす可能性と出産流体と胎盤内のかなりの細菌負荷は、ローカル環境1を汚染することができます。このような汚染が公衆衛生と農業産業の両方に持つことができる巨大な負担の例は、最近オランダ2で発生したQ熱の流行で観察されました。 2007との間2010年には、Q熱の4,000以上のヒト症例が診断され、この流行はヤギ農場3の重大な汚染に連結されていました。さらに、 コクシエラは厳しい罹患率と死亡率4を引き起こす細菌や必要な低感染量の環境安定性に米国疾病対策予防センター、によって分類され、潜在的な生物兵器です。 コクシエラは、2つの段階に存在する：天然源から単離されたフェーズIの生物は、非常に病原性であり、フェーズIIの生物は非常に生体内で減衰されます。例えば、 コクシエラバーネッティナインマイルフェーズIの生物のいくつかのin vitroで継代した後、フェーズII細菌は切り捨てリポポリサッカライド（LPS）5で得られた不可逆的な染色体欠失を含有する製造されました。この株、C.バーネッティ NMIIは、組織培養モデルにおけるI相に表現型が類似しており、安全なモードを提供します研究室5にコクシエラの病因を研究する研究者のためのリットル。近年では、いくつかのブレークスルーは急速にコクシエラの遺伝学の分野を進めてきました。最も顕著なのは、純粋メディア（酸性クエン酸、システイン媒体- ACCM-2）の開発は、液体と6,7固形培地上の両方でコクシエラの無細胞成長を可能にしました。これは、誘導性遺伝子発現システム、シャトルベクターとランダムトランスポゾンシステムを8月11日を含むコクシエラために利用可能な遺伝子ツールの直接的な改善をもたらしました。最近では、標的遺伝子の不活性化のための2つの方法は、特定の病原性遺伝子の候補12を検査するための道を切り開いて、開発されてきました。 肺胞マクロファージによる内在続いて、 コクシエラは膜結合区画内に高い数字に複製は液胞（CCV）を含むCoxiella-と呼ばれます。 CCVは、エンドサイトーシス人身売買番目のホストが必要ですラフ初期および後期エンドソームはリソソーム由来の細胞小器官13内に成熟するまで。このプロセスを通じて、CCVは、どちらかが一過現れるかを含め、液胞に関連付けられているが、Rab5の、Rab7、CD63およびLAMP-1 13-15、これらに限定されないままと宿主因子を取得します。宿主細胞内でコクシエラのレプリケーションが完全に機能するドット/ ICMタイプIVB分泌系（T4SS）8,16,17に完全に依存しています。この分泌系はancestrally共役システムに関する多タンパク質構造であり、細菌タンパク質を送達するために、両方の細菌および液胞の膜にまたがる、宿主細胞質18に、エフェクターと呼びます。 コクシエラ T4SSは、機能的には十分に特徴付けタイプレジオネラニューモ 19,20のIVBドット/ ICM分泌系に非常に類似しています。 コクシエラが酸性リソソーム由来に達するまで興味深いことに、T4SSとその後のエフェクター転座の活性化は発生しませんオルガネラ、約8時間の感染後17,21。現在までに、130以上のドット/ ICMのエフェクターは9,17,22-24を同定されています。これらのエフェクターの多くは、おそらく宿主細胞内コクシエラの複製中に重要な役割を果たしています。しかし、わずか数エフェクターは機能的に25-29を特徴づけられています。 本研究では、宿主細胞の細胞質（ 図1）内のβラクタマーゼ活性を介して（以下BLAM基板と呼ぶ）CCF2-AM FRET基質の切断に依存する蛍光に基づく転位アッセイを利用します。目的の遺伝子は、構成的発現を提供するレポータープラスミドのTEM-1βラクタマーゼ（BLAM）に融合されます。 BLAM基質はFRET対を形成する2つのフルオロフォア（クマリンおよびフルオレセイン）で構成されています。フルオレセインおよびエフェクター転座の不在下で緑色の蛍光発光のFRETのクマリン結果の励起;しかし、Blaの場合M-エフェクター融合タンパク質が宿主細胞質に転位され、得られたβラクタマーゼ活性切断励起以下の青色蛍光発光を生成するFRETペアを分離BLAM基板のβラクタム環、。この転座アッセイはよくC.含むさまざまな細胞内および細胞外の細菌の範囲からエフェクタータンパク質を同定するためのアプローチとして実証されていますバーネッティ 、L.ニューモ 、L. longbeachae、 トラコーマクラミジア 、腸管病原性E.大腸菌 、 サルモネラ菌およびブルセラ 17,30-35。 コクシエラエフェクター転上の特定の宿主因子の役割を決定するために、我々は、特定の低分子干渉RNA（siRNA）で、RNA干渉として知られている遺伝子サイレンシングのための十分に確立された方法を利用します。もともと線虫（Caenorhabditis elegans）で同定され、RNA干渉は、先天性defeに使用保存された内因性細胞プロセスであり、ウイルスだけでなく、遺伝子調節36,37に対してNSE。配列特異的なsiRNAの結合後、mRNAの分解は、特異的な遺伝子サイレンシングまたはノックダウン38で得られた（RNA誘導サイレンシング複合体）RISCを介して行われます。この研究では、siRNAは、エンドサイトーシス経路の重要な調節因子である2つのホストタンパク質、Rab5AとRab7Aを標的化するために使用しました。エフェクター転上Rab5AとRab7Aサイレンシングの影響は、Cを使用して確認しましたバーネッティ pBlaM-CBU0077。それは以前にコクシエラ 17のドット/ ICMの分泌系によって転位することが示されたようCBU0077を選択しました。 siRNAの遺伝子サイレンシング、ここでは説明fluorescencebased転座アッセイの両方を利用して、我々はコクシエラによってエフェクタータンパク質の転位に宿主因子の役割を確立するために始めています。このアプローチは、類似secretioを有し、両方の細胞内および細胞外の細菌の広い範囲に適用することができますエフェクタータンパク質のトランスロケーションを担当するN個のシステム。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>シグマ</td><td>C0759</td><td>ACCM-2中型成分</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S4641</td><td>ACCM-2中型成分</td></tr><tr><td>リン酸カリウム</td><td>シグマ</td><td>60218</td><td>ACCM-2中型成分</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>カルバイオケム</td><td>442611</td><td>ACCM-2培地成分</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Σ</td><td>C5080</td><td>ACCM-2 中 成分</td></tr><tr><td>硫酸鉄</td><td>フィッシャー</td><td>S93248</td><td>ACCM-2 中級</td></tr><tr><td>ナトリウム 塩化ナトリウム</td><td></td><td>Σ S9625</td><td>ACCM-2 中</td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>Σ</td><td>C6852</td><td>ACCM-2 中 成分</td></tr><tr><td>バクトネオペプトン</td><td>BD</td><td>211681</td><td>ACCM-2 中成分</td></tr><tr><td>カサミノ酸</td><td>フィッシャー</td><td>BP1424</td><td>ACCM-2 中型 メチル</td></tr><tr><td>ベータ シクロデキストリン</td><td>シグマ</td><td>C4555</td><td>ACCM-2 中型</td></tr><tr><td>RPMI + グルタマックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>61870-036</td><td>ACCM-2 中型</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>シグマ</td><td>C0378</td><td>細菌培養用</td></tr><tr><td>ON-TARGETplus ノンターゲティングコントロールプール (OTP)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-05</td><td>非標的制御</td></tr><tr><td>siGENOME ヒト PLK1 (5347) siRNA - スマートプール</td><td>ダルマコン</td><td>M-003290-01-005</td><td>細胞死を引き起こし、トランスフェクション効率の測定</td></tr><tr><td>siGENOME ヒト RAB5A (5968) siRNA - スマートプール</td><td>ダルマコン</td><td>M-004009-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME ヒト RAB7A (7879) siRNA - スマートプール</td><td>ダルマコン</td><td>M-010388-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNAバッファー</td><td>Dharmacon</td><td>B-002000-UB-100</td><td>滅菌済みRNaseフリー水を使用して、5x siRNAバッファーを1x siRNAバッファーに希釈します</td></tr><tr><td>DharmaFECT-1 トランスフェクション試薬</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>トランスフェクション用</td></tr><tr><td>Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td>トランスフェクションに使用する減血清培地</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>細胞培養および感染用</td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清(FCS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>代替同等製品を使用できます</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Coxiella株PBS</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>の保存<td>用 細胞培養用</td></tr><tr><td>0.05% トリプシン+EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Quick-gDNA Mini Prep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3007</td><td>gDNA抽出に同等の代替製品を使用可能</td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-98020</td><td>qPCR反応用の同等のqPCRマスターミックス製品を使用可能</td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G CCF2-AM</td><td>Invitrogen</td><td>K1032</td><td>蛍光を用いた転座の測定と6倍ローディング溶液(溶液A、B、C、DMSOを含む)の生成用水</td></tr><tr><td>酸化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>106469</td><td>プロベニシド溶液成分</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性</td><td>シグマ</td><td>71505</td><td>プロベニシド溶液</td></tr> 成分 <tr><td>オルトリン酸水素</td>ナトリウム <td>メルク</td><td>106586</td><td>プロベニシド溶液成分</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td>Probenicid 溶液 成分</td></tr><tr><td>DRAQ5 蛍光プローブ溶液 (5 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62251</td><td>細胞の生存率を測定するための核染色。1:4000をPBSで希釈して使用してください。&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS中の4%PFA(パラホルムアルデヒド)溶液</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>HeLa 229細胞用固定液</td></tr><tr><td>25 cm2 ベントキャップ付き組織培養フラスコ</td> コー<td>ニング</td><td>430639</td><td>細菌株の増殖用</td></tr><tr><td>96 ウェルフラット クリアボトム ブラックポリスチレンTC処理マイクロプレート、個別包装、蓋付き、滅菌済み</td><td>コーニング</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 ベントキャップ付き組織培養フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430641</td><td>HeLa 229細胞の増殖用</td></tr><tr><td>175 cm2ベントキャップ付き組織培養フラスコ</td><td>コーニング</td><td>431080</td><td>HeLa 229細胞の増殖用</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td></td><td></td><td>HeLa 229細胞の定量用</td></tr><tr><td>Tear-A-Way 96 ウェルPCRプレート</td><td>4titude</td><td>4ti-0750/TA</td><td>qPCR用反応</td></tr><tr><td>8-蓋チェーン、フラット</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td>qPCR 反応用</td></tr><tr><td>名前</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</>Bench</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>top microfuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップボルテック</td>ス オービ<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>タルミキサー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810 R</td><td>細菌培養のペレット化用</td></tr><tr><td>ナノドロップ</td><td></td><td></td><td>gDNA定量用</td></tr><tr><td>Mx3005P QPCRマシン</td><td>Aligent Technologies</td><td>401456</td><td>7日間培養におけるコキシエラゲノムの定量化</td></tr><tr><td>ClarioSTARマイクロプレートリーダー</td><td>BMG LabTech</td><td></td><td>蛍光測定用</td></tr></tbody></table>

によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（fret）を適用<em&gt; q熱リケッチア</em&gt;のsirnaサイレンシング中

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Q熱リケッチア 、Q熱の原因物質は、複製ニッチを確立するために、タイプIVドット/ ICM分泌系に依存して細胞内病原体です。エフェクターのコホートは、ホストプロセスを操作し、複製のためのユニークなリソソーム由来の液胞の確立を可能にするために宿主細胞にこのシステム通って移動しています。特定の遺伝子のsiRNAを用いたサイレンシングし、βラクタマーゼ活性に依存するFRETベースの基板を用いて、エフェクター転位の測定：ここで提示された方法は、2つのよく確立された技術の組合せを含みます。これら二つのアプローチを適用すると、我々は、細菌の分泌システム機能およびエフェクター転における宿主因子の役割を理解し始めることができます。本研究では、Rab5AとRab7A、両方のエンドサイトーシス人身売買経路の重要な調節因子の役割を調べました。我々は、エフェクターの減少タンパク質をもたらすいずれかの発現をサイレンシングすることを実証translocation個の効率。これらの方法は、容易にまた分泌系を利用する他の細胞内および細胞外の病原体を検査するように変更することができます。このようにして、細菌のエフェクター転座に関与する宿主因子の全体像を明らかにすることができます。

この研究のために、C. CBU0077が以前コクシエラドット/ ICMの分泌系17の転エフェクターであることが示されているようにバーネッティ pBlaM-CBU0077株を選択しました。感染7日C.におけるゲノム/ mLの総数に先立ちバーネッティ pBlaM-CBU0077文化は、定量PCRを使用して列挙した。 図4は、定量PCR、次の両方の標準およびサンプルから予想されるサイクル閾値（Ct）値の一例を示しています。 4.3.3で説明したように（数値的に増幅プロット（ 図4B）および（ 図4C）にグラフで表されている）Ct値はエクスポートし、分析しました。示す代表的なデータに基づいて、10ミリリットル中2.31×10 8ゲノム/ mlに再懸濁細菌培養物（ 図4D）がありまし...

細菌性病原体とそれらのホスト間の相互作用を調査することは、生物学的研究の重要な領域です。ここでは、BLAM基板を用いたsiRNAの遺伝子サイレンシング中にQ熱リケッチアによってエフェクター転座を測定するために必要な技術を記載しています。

によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;のsiRNAサイレンシング中

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

この実験手順の全体的な目的は、特定の宿主プロセスが、細菌病原体のエフェクタータンパク質移行能に及ぼす影響を調べることです。この手法は、細胞微生物学分野における重要な疑問、具体的に、宿主が細菌病原性エフェクターの宿主細胞内への導入をどのように阻害または促進しているかという問いに答えるのに役立ちます。本手法の主な利点は、2つの確立された手法、すなわちsiRNAによる遺伝子サイレンシングと、細菌タンパク質のトランスロケーションを測定するためのレポーターアッセイを組み合わせている点にあります。これにより、病原体と真核細胞の間の相互作用を調査することが可能になります。この手法はCoxiellaの病原性に関する知見を提供し、効率的なタンパク質移行に依存する他の細菌（例えば、Chlamydia、Salmonella、および付着浸潤性E.coliなど）の宿主・病原体相互作用の調査にも適用可能です。CBU0077を発現させたC.burnetiiを培養した後、通気性キャップ付きの25 cm²培養フラスコを用い、テキストプロトコルに従ってベータラクタマーゼを融合させます。3 µg/mLのクロラムフェニコールを含む、あらかじめ温めておいた10 mLのACCM2に、20 µLの細菌を接種します。5% CO₂および2.5% O₂条件下、37 °Cで7日間培養します。HeLa細胞にsiRNAを逆トランスフェクションするため、テキストのプロトコルに従ってsiRNAを調製した後、DMEM + 10% FCS、0.5% trypsin EDTA、およびPBSを37 °Cのウォーターバスに30分間浸し、使用前に温めておきます。各実験用siRNAのトランスフェクションについて、0.4 µLのトランスフェクション試薬と63.6 µLの低血清培地を個別のマイクロチューブに合わせます。すべてのマイクロチューブをボルテックスし、室温で5分間コンプレックスを形成させます。それぞれのトランスフェクションコンプレックスを含むマイクロチューブに、各実験用siRNAを16 µLずつ加えます。その後、ボルテックスして室温で20分間インキュベートします。この20分間のインキュベーション中に、トランスフェクション試薬、低血清培地、およびsiRNAの混合液 20 µLを、滅菌済みの黒色・平底・透明底96ウェルプレートの適切なウェルに加えます。また、同じく20分間のインキュベーション中に、あらかじめ加温したPBS 10 mLを用いて、75 cm²flask内のコンフルエントまたはサブコンフルエントなHeLa細胞の単層を洗浄します。0.5%トリプシンEDTA溶液を1 mLフラスコに加え、37 °C、5% CO₂条件下で3〜5分間インキュベートして細胞を剥離させます。あらかじめ温めておいた10% FCS含有DMEM 9 mLで細

applying-fluorescence-resonance-energy-transfer-fret-to-examine

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Immunology and Infection

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単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

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単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化

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によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用

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