Name: シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学ぶシリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いたマウス脳ミトコンドリアの形態・構造・分布・体積・数の解析手法。この方法は神経変性疾患と神経発達障害の研究に貢献します。

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技術的な支援を提供してくださったSidney Walkerに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(National Institute of Health)(1R01EY024712-01A1)からの助成金によって部分的に支援されました。

倫理文：動物を対象とする手順は、バージニア工科大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 注意：このプロトコルで使用されるいくつかのコンポーネントを処理し、廃棄する際エクストリーム予防措置を講じなければなりません。使用前に、地元の施設の指針と健康と安全慣行を確立し、従わなければならない、特に揮発性および非常に有毒である四酸化オスミウム、ため、重金属やソース放射能の、および硝酸鉛の両方である酢酸ウラニル、あります重金属毒。チオカルボ（TCH）は、取扱いを誤ると、爆発や有毒ガスを生成するために分解することができます。多くの機関は、これらの試薬は、日常的に利用され、支援を提供することができるでEMの中核施設を持っています。 脳組織とSBFSEMイメージングの作製<ol><li> 5％のisoflura - 4を使用して、C57黒色マウス（C57BL / 6J株） - 若い（4カ月齢〜2）麻酔機関のガイドライン以下のね。筋緊張、随意運動と尾のピンチのような嫌悪刺激に対する応答の欠如の損失を監視することによって麻酔を確認してください。 </li><li>解剖トレイの上でマウスをピンと腹側正中線に沿って皮膚に切開を行います。マウスの胸郭を公開するために、皮膚のさらなる切開を行います。横隔膜を切開し、慎重に拍動する心臓を露出するように外周に沿って胸腔を解剖してから、右心房に切開を行います。 </li><li>蝶のカニューレを使用して、左心室にカニューレを挿入。失血は、肝臓の色の変化によって確認されるまで、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.2の20mlの - 10を使用して経マウスを灌流。 注：肝臓の色の変化は、失血の程度を決定するためのガイドとして使用されます。赤褐色から肝臓の色の変化はピンクの淡いすることを確認してください。 </li><li> 2％のグルタルの20ミリリットル - 経10を用いてマウスを灌流アルデヒドおよび4％パラホルムアルデヒドが内から急速に脳組織を固定するために、0.10 Mカコジル酸緩衝液（pH 7.2）で行われました。固定テール硬化を観察することによって監視されます。 注：pHを調整し、水で100mlにボリュームを作るために塩酸を追加し、80ミリリットルの水にカコジル酸ナトリウムの2.14グラムを溶解することにより、0.10 Mカコジル酸緩衝液（pH 7.2）を準備します。 </li><li> 4 O℃で48時間、2％グルタルアルデヒドおよび4％パラホルムアルデヒドを含有する0.10 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）に固定することにより、その後、灌流に続いて、マウスの首を切る、脳を解剖</li><li> 48時間後ビブラトームを用いて400μmの冠状切片を作成した後、慎重に解剖顕微鏡42の下（例えば、海馬）脳内の関心領域を分析。慎重に組織をトリミングして、向きを保存するための写真を撮ります。 注：処理方法SBFSEMで組織染色のポストは中の重金属染色の様々な方法を組み合わせて順序は、分解能を向上させるとDeerinck ら 40によって以前に開発された方法に基づいています。 </li><li> 0.1 Mカコジル酸緩衝液（pH 7.2）にグルタルアルデヒド固定組織を3回、各5分洗浄します。 </li><li> 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）でタンニン酸を溶解することにより、0.1％タンニン酸溶液を調製します。溶解するまで旋回し、必要に応じて、0.45μmのフィルターでろ過します。 </li><li> RTで60分 - カコジルとPostfixの組織は、30のための1ミリリットルの試薬でインキュベートすることにより、0.1％タンニン酸緩衝しました。 注：インキュベーション時間は、組織のサイズに依存するが、30分には、ほとんどの組織に最適です。 </li><li>ウォッシュは、カコジル酸緩衝液（pH 7.2）で、5分ごとに3回を組織します。 </li><li> 0.3グラムのフェロシアン化カリウムおよびH 2 O（ の dH 2 O）10mlの蒸留で0.86グラムのカコジル酸ナトリウムを溶解させます。氷上のフェロシアン化カリウム溶液を保管してください。使用直前に、4％の四酸化オスミウム（OsO 4）の10ミリリットルを追加します。 </li><li> 2％のOSで組織を染色氷上で90分間mium-フェロシアンソリューション、。 dH 2 Oで3回、各5分洗浄</li><li> 1％チオカルボヒドラジド（TCH）溶液を10mlのdH 2 O中の0.1 gでTCHを溶解することによって調製します完全に溶解するまで10分ごとに旋回することにより、60℃で溶解します。 TCHの処理中に安全上の注意事項を守って、特に金属の使用を避けるように注意してください、高温に加熱、または溶液を乾燥させること。 </li><li> RTで20分間、新たに調製した1％TCHのサンプルを扱います。 dH 2 Oで3回、各5分洗浄</li><li> dH 2 Oで2％ま ​​でのOsO 4 4％を希釈し、1時間インキュベートすることにより2％水性四酸化オスミウムで染色組織。 dH 2 Oで洗浄組織3回、各5分</li><li> 4℃での dH 2 O中の1％酢酸ウラニルでサンプルO / Nインキュベートします。 </li><li> （Deerinck ら 40によって記載されるように）ウォルトンのリードアスパラギン酸溶液を調製します。 <ol><li> 250ミリリットルのdH 2 O中に0.998グラムのL-アスパラギン酸を溶かしpHが5.5に達するまで、次に滴下様式で、10Nの水酸化カリウム（KOH）を加えます。 pH調整した後、30分間60℃に10ミリリットルにアスパラギン酸ストックと熱を硝酸鉛の0.066グラムを追加します。 </li></ol></li><li> dH 2 Oで組織をすすぎ、60℃のオーブンで30分間ウォルトンのリードアスパラギン酸染色でインキュベートします。 dH 2 Oで3回、各5分洗浄</li><li> 100％エタノール、続いて、5分ごとに20％、50％、75％、85％および95％エタノールの冷蔵溶液を用いてアルコールを段階的な一連の3回、10分毎にサンプルを脱水します。 注：開かれたエタノールは、空気中から水分を吸収するように、新たにオープンした瓶から100％エタノールを使用すると失敗する埋め込む引き起こします。インキュベーション時間が長いほど、より大きな組織サンプルでは必要になります。 </li><li>プロピレンオキシドで洗浄サンプル2回、15分ずつ。 </li><li> NMA（ナジックメチル無水物）と1ミリリットルmlで10.5、25ミリリットルの樹脂を用いたプラスチック包埋樹脂を作るDDSA（ドデセニル無水コハク酸）、15.5DMP-30（2,4,6-トリスジメチルアミノメチルフェノール）。振盪することにより、樹脂を混ぜます。スピンとは、樹脂が泡決意するまで放置します。 注：これは、標準培地硬度のレシピです。電子顕微鏡の他のタイプ（EM）プラスチック樹脂を用いてもよいが、必ずしもすべての樹脂はSBFSEMのために働くように、事前に非必須の対照試料を用いて試験されるべきです。 </li><li> 10時間 - プロピレンオキシドは、約8の期間にわたって蒸発するように、2時間後に、最初はその後、非キャップキャップされているバイアルに、包埋樹脂とプロピレンオキシドの50ミックス：50で組織O / Nインキュベートします。 </li><li> 2時間きれいなバイアルに100％の新鮮な埋め込み樹脂に組織を転送します。 </li><li>平坦な金型中で新鮮な埋込樹脂で埋め込んだサンプルは、紙ラベルを印刷し、そして48時間60℃のオーブンでそれらを硬化含有します。約1時間後、再び組織の配置および整列をチェックし、必要に応じて調整します。 </li><li>関心のある領域にサンプルをトリミングしてgellinを使用したアルミニウムピンにマウントその後グラムシアノアクリレート瞬間接着剤または導電性エポキシ樹脂、アルミ端子に導電性経路を提供するために、ブロックの側面の周りのコロイド銀ペーストでコート。 </li><li>チャンバ内ウルトラミクロトームステージと低kVの反射電子検出器32を備えた走査型電子顕微鏡システムを使用して組織標本を調べます。 注：走査型電子顕微鏡（SEM）を使用中の楽器とサイトトレーニングを取得し、許可されたユーザになります。また、小規模なプロジェクトのための研究者や中核施設との連携が可能です。 SEM写真は、X線を発生させるように放射訓練も必要とされ得ます。 </li><li>サンプル画像には、次の設定を使用します。2.25 kVで、5時 - 10ナノメートル/ピクセルの解像度、80の間のフィールドサイズの - xの250μmであり、Y（他のフィールドが可能なサイズ）、および50のスライス厚 - 100 nmで、 20時間の期間 - 16で600スライス - 250の合計。 注意：設定が異なる顕微鏡の間で実質的に変化し、INDIvidualサンプル、および所望の解像度。これらの設定は、多くのサンプルのために容易に解釈されている画像を生成する必要があります。 </li></ol> 2.イメージングデータセットを分析注：画像J /フィジーのソフトウェアは、データセットを分析するために使用され、TrakEM2プラグインに依存します。前処理ステップは、ソフトウェアのさまざまな方法を使って行ってもよいし、豊富なまたは経験レベルに応じて軽微であってもよいし、スタックが得られました。オープンソースソフトウェア（1.50b版ImageJの、フィジーは2015年10月1日のダウンロード）を使用して、メインの変換は、ここで説明されています。 <ol><li>ソフトウェアで開き、→8ビットのメニュー項目画像→タイプを選択することで、元の独自の16ビット画像から8ビットTIFF形式に画像を変換します。 <ol><li>このステップの間、自動コントラスト/明るさ変換​​は画像のための理想的でない場合は、16ビット画像を再度開き、プレスイメージ→→明るさ/コントラストを調整します。すべての画像のために働く範囲を選択し、[Apply]を押します。その後、Cを実行しますonversion。注：一部のSEMでは、このステップは、顕微鏡メーカーのソフトウェアが必要な場合があります。 </li><li>スライス間の許容できない画像の動きに、必要な場合（ 例えばによる充電にドリフト）、登録/画像スタック（メニュー項目のプラグイン→登録→リニアStackAlignmentWithSIFT）を合わせます。ほとんどの登録ソフトウェアでは、「翻訳のみ」モードではなく、「剛体」に設定されました。 SIFT登録プラグインの多くのアプリケーションのための作品や仮想スタックのバージョンがあります：多くのアプローチとソフトウェアが動作する可能性があります注意してください。 <ol><li>必要な場合は、登録前にキャンバスサイズを拡大する（画像→→CanvasSizeを調整）または利息（画像→クロップ）の領域にそれを減らします。 いくつかのドリフトや扇形に開くが発生する可能性があり、および他のプラグインやソフトウェアをしようとすると、より良い結果を生む可能性があります注意してください。マニュアルオプションも（ 例えば ImageJを/ FIJI、プラグイン→登録→のManualLandmarkSelection）ご利用いただけます。 </li></ol></li><li>デザイアーズ場合編、より小さく、より管理しやすいサイズにスケール画像（ 例えば 25％）のImageJ（画像→スケール）を使用。 </li></ol></li><li>ソフトウェアを起動し、[ファイル]→[インポート]→[画像シーケンス、その後、TIFFファイルを選択します。 </li><li> （空白）新→TrakEM2→ファイルを選択して、プラグインを起動します。 2つのウィンドウが開きます。一つのプロジェクトとarea_listsを管理し、他のトレース管理し、「キャンバス」と呼ばれます。 </li><li>キャンバス、インポート時に右クリックを行うことで、プラグインに画像スタックをロードします。インポートを選択して、インポート・スタックをクリックしてください。ポップアップオプションでは、仮想スタックのためのチェックボックスをオンにします。 注：画像スタックが既にソフトウェアで開かれているが、彼らはまた、プラグインでオープンする必要があります。仮想スタックボックスがチェックされている場合は、コンピュータをより円滑に実行することができます。 </li><li>ミップマップが作成され、スタックがロードされた後、右側のプラグインウィンドウの下にプロジェクトの名前をクリックします。テンプレートCOLの「新しいプロジェクト」を右クリックしますUMN、およびそのプロジェクトのための「新しい子を追加」を選択します。右の「area_list &#39;を選択するには、もう一度クリックします。 </li><li>キャンバス上で右クリックし、元の電子顕微鏡写真の設定に同意するプロジェクトのZ軸スケールを設定し、表示をクリックして、キャリブレーションを選択します。また、右側のスケールZと厚さを選択する]をクリックし、プラグインウィンドウ内のすべてのレイヤを選択することにより、Z-スケールを設定。 </li><li>クリックして、「プロジェクト」とプロジェクトがキャンバスウィンドウ内の「Zスペース]タブの[地域のリスト」を作成するセクションオブジェクトにすべての「子供」をドラッグします。 </li><li>色を選択し、設定する「領域リスト」を選択し、右クリックし。さて、電子顕微鏡写真の画像では、このようなミトコンドリアなどのオブジェクトを追跡するためにペイントブラシツールを使用します。使用「Shiftキー+クリック」でズームイン、ズームアウト、および消しゴムにペイントブラシカーソルをオンにする「Altキー+クリック」するには、「Ctrlキー+スクロール」、囲まれた円形に記入します。 </li><li> 15ミクロン - 〜10の二つの領域を選択します10で - 画像の左上隅と右下隅の15ミクロンとすると、各データセット内のミトコンドリアの公平なサンプリングを可能にするために、これらの領域内のすべてのミトコンドリアを識別します。 </li><li> 「キャンバス」で、セクション全体のミトコンドリアを観察し、トレースします。注：ミトコンドリアは同様のサイズの非常に暗い/稠密に現れる細胞小器官、直径が緩く円筒形です。内膜によって形成されたユニークなクリステはこの細胞小器官の内部に容易に区別可能です。 </li><li>トレースが終了したら、右、Zスペース]タブの下のarea_listをクリックして「3Dで表示」を​​選択します。これは、トレースされた画像の3D再構成を表示するには、3Dビューアプラグインを起動します。 <ol><li>ミトコンドリアの体積測定、3Dビューアで選択したオブジェクトを実行するには、「編集」タブをクリックし、[オブジェクトのプロパティ]を選択します。ミトコンドリアの体積推定値は、いくつかの他の測定値と一緒に表示されています。 </li></ol></li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。Emily K BensonはRenovo Neural Inc.の有給従業員であり、Grahame J Kiddは、シリアルブロックフェースSEMサービスと分析の商用プロバイダーであるRenovo Neural Inc.の3DEMのサイエンティフィックディレクターを務めています。

神経系の複雑さは、大きな組織のボリュームを再構築し、そのような十分な解像度を持つミトコンドリアなどの細胞小器官の形態や分布の分析に重要な課題を提起します。 3次元に拡張する多数のプロセスとニューロン、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトを含む複数の細胞が脳組織43内で相互作用します。ミトコンドリアは細胞や遠くの過程の細胞体の両方に存在するので、ミトコンドリアの形態は、神経系（ 図1）で非常に多形性です。十分な解像度を有する適切な立体構造情報は、したがって、そのような共焦点または二光子顕微鏡44,45のような従来の光学顕微鏡法により取得することができません。電子顕微鏡法は、十分に高い分解能で神経組織の大量の再構築を可能にするだけで、現在利用可能な技術です。伝統的に、神経組織の3次元再構成が実現されています超薄切片29の連続切片の透過型電子顕微鏡（SSTEM）により、D。しかし、最近の技術の進歩は、ボリューム電子顕微鏡データの取得と自動化の品質が改善されています。 SBFSEMは最...

ミトコンドリアは細胞骨格との緊密な相互作用において、そのようなニューロン1におけるカルシウム電流などの細胞事象に応答して、携帯手がかりやニーズに応じて、その形状と位置を変更する動的な細胞小器官です。ミトコンドリアはまた、他の細胞小器官と相互作用順番に彼らのダイナミクスと代謝2を調節する小胞体を、 例えば 。ミトコンドリアの形態、 すなわち異なる細胞型における不均一性を示しています。細胞小器官の形状は、筒状のシート、袋や楕円3からなるものに変化します。ミトコンドリアの融合および分裂周期タンパク質は、ミトコンドリア4の位置、大きさ、形状及び分布を調節することができることが示されています。また、ミトコンドリアの形状の変化は、神経変性、神経可塑性、筋萎縮、カルシウムシグナル伝達、活性酸素種の生成だけでなく、寿命及び細胞死関与股関節に関連していますT細胞特異的なミトコンドリアの形態は、正常な細胞機能5-11の維持に重要です。 ミトコンドリアの主要な生体エネルギー機能は、TCAサイクルを介して、完全な栄養素の破壊（ すなわち 、グルコース、脂肪酸、酸またはアミノ酸）を含んでおり、OXPHOSが12を経路代謝反応のシリーズを実行することにより、アデノシン三リン酸（ATP）を生成することです。人間の脳は、体重のわずか2％しかし、それは〜それを器官13を要求する非常にエネルギーを作る製造全エネルギーの20％を消費する構成します。ヒトにおけるミトコンドリア機能障害は、神経学的症状14-17の多くをもたらすことは驚くべきことではありません。 5000個人、およびmの最も一般的な原因の1：ATP生成を損なうOXPHOSコンポーネントの遺伝的変異は、臨床的に不均質な〜1の有病率と疾患群であるミトコンドリア病17,18につながり、子供と大人でetabolic障害。ミトコンドリア由来のATPの赤字は、脳、心臓および骨格筋は、主にこれらの患者14,17,18に影響されるような高エネルギー厳しい臓器で複数の器官系に影響を与えます。近年では、複数の研究では、神経発達と神経変性疾患15-17,19,20両方におけるミトコンドリア機能障害のための証拠を提供しました。ミトコンドリアが不可欠と脳の発達と機能に重要であるので、健康と病気の両方の状態の下で脳ミトコンドリアの形態、構造、大きさ、数および分布の変化を分析することができるプロトコルを開発することが不可欠です。ミトコンドリア標的化緑色蛍光タンパク質（GFP）を有するマウスモデルは、脳21,22ミトコンドリア運動および局在化を可視化するために製造されています。これはミトコンドリアの運動性と一般的な分布を調べるために非常に便利なツールですが、INCLUDいくつかの欠点があります電子限られた解像度および蛍光顕微鏡の感度。これらの属性は、それが困難な比較的小さなサイズのミトコンドリアを追跡することを可能にします。同様に、シリアル伝送電子顕微鏡が正常シナプスミトコンドリア23を表示するために使用されてきたが、この方法は非常に時間がかかります。ミトコンドリアの形態は、それらが連続的な分裂および融合サイクルを受けるように非常に動的であることが知られており、大部分の細胞においてミトコンドリアは非常に接続されたネットワーク24〜26に維持されます。ニューロンは、複数の樹状突起と拡張軸索と高度に極性細胞であり、細胞体で接続された網状ネットワークを形成するミトコンドリアは、彼らがこれらの神経突起を介して自分の道（ 図1）を作るように分離する必要があります。これは、大きさや形状が極めて多様な脳ミトコンドリアを作ります。例えば、シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡を用いて（SBFSEM）技術は、我々が以前に観察されたシナプスmitochondrの体積またはサイズの違いとりわけ神経終末に存在するミトコンドリアに限り16として倍の27とすることができます。 ボリュームを実施するためのいくつかのアプローチがありますウルトラSEM 30収集シリアルセクションのTEM 29、自動化されたテープを含む、28の分析は、イオンビームSEM 31、およびSBFSEM 32を集中しました。 SBFSEM分析は、脳、1ミリメートルまでの領域におけるミトコンドリアのように、それは形態学的形状、大きさ、分布、および細胞小器官の数の定量的データを提供するために解像度を有するという利点を有します。技術的な操作は、以前のEMの経験が不足している多くの生物学的研究室の能力の範囲内のデータ収集と分析しても、少なくとも厳しいです。連続切片のような画像を生成するための市販の装置の出現は、組織の3次元超微細構造解析を行っている、さらに迅速かつ繰り返し可能な方法28で公平な容積測定分析を可能にするルーチン技術、 </SUP&gt;。 SBFSEMは、最初1981年33でレイトンによって導入されたアイデアをもとに、2004年32に記載されており、神経生物学の分野で使用された。それ以来、複数の研究は、神経回路34の再建分析の主要なツールとして、この技術を確立しました。また、多くの小規模なプロジェクトのために、それは、細胞小器官27,35-39を識別するために、再構成分析を提供します。以降、取得された画像は、低電圧後方散乱電子から誘導され、別の既知の重金属染色技術を組み合わせた新たな染色プロトコルは、解像度40を増加させるために開発されました。 本稿では、3次元電子顕微鏡イメージング、以前に私たちと他の人38,39,41によって使用されている方法に基づいて脳ミトコンドリアの容量分析を利用するためのプロトコルを提供します。組織後処理方法として以前Deerinck らによって記載された使用40。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6Jマウス</td><td>ジャクソン研究室&nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>VETone、商品名フルリソ501017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖トレイ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>S65105&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>バタフライ カニューレ</td><td>エクセル インターナショナル</td><td>26704</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液 生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>フィルター (0.45 ミクロン)</td> <td>EMD ミリポア</td><td>NC0813356</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>ビブレータ切片システム</td><td>テッド・ペラ社</td><td>ビブラトーム3000</td><td></td></tr>カ<tr><td>コジル酸ナトリウム</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr>タン<tr><td>ニン酸</td><td>EMS</td><td>21700</td><td></td></tr>フェ<tr><td>ロシアン化カリウムJT</td><td>ベイカー14459-95-1</td><td></td><td></td>四酸化</tr><tr><td>オスミウム4%溶液</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>チオカルボヒドラジド</td><td>EMS</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A93100</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>Acros Organics</td><td>43731000</td><td></td></tr><tr><td>硝酸鉛</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>EMbed-812 埋め込みキット</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>には、812&nbsp; 樹脂、DDSA、NMA、DMP-30 が埋め込まれています。</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド 25% EMグレード</td><td>Polysciences Inc.</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>EMS</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>酸化プロピレン</td><td>EMS</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>埋め込み金型</td><td>EMS</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>アルミ試料ピン</td><td>EMS</td><td>70446</td><td></td></tr><tr><td>コロイド銀液体</td><td>EMS</td><td>12630</td><td></td></tr>カ<tr><td>ミソリ</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>瞬間接着剤(ロックタイトゲルコントロール)</td><td>ロックタイト</td><td>234790</td><td>ハードウェア/クラフトストアはこのアイテムを運ぶ</td></tr><tr><td>導電性エポキシ</td><td>テッドペラ株式会社</td><td>16043</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Sigma VP</td><td></td></tr><tr><td>SEM用インチャンバー超ミクロトーム</td><td>Gatan Inc.</td><td>3View2</td><td>他のSEM用に設計可能</td></tr><tr><td>ピン準備用トリミング顕微鏡</td><td>Gatan Inc.</td><td>3Viewシステム</td><td></td></tr><tr><td>低kV反射電子検出器</td><td>Gatan Inc.</td>の一部として供給<td>3V-BSED</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/ フィジー処理パッケージ&nbsp;</td><td>ImageJ ver 1.50b, FIJI download 2015年10月1日</td><td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a></td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td></tr></tbody></table>

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析



Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

人間の脳は、主燃料源として、グルコースに依存している臓器を消費する高エネルギーです。グルコースは、アデノシン三リン酸（ATP）の形態の細胞エネルギーを産生するために、解糖、トリカルボン酸（TCA）サイクル及び酸化的リン酸化（OXPHOS）経路を介して脳ミトコンドリアによって異化されます。ミトコンドリアのATP産生の障害は、顕著な神経学的および筋疾患の症状を臨床的に提示するミトコンドリア障害を引き起こします。ミトコンドリアの欠陥はまた、神経発達障害（ 例えば 、自閉症スペクトラム障害）および神経変性疾患に存在している（ 例えば 、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病およびパーキンソン病）。このように、健康と病気の両方の状態の下でミトコンドリアの形態、構造と分布の3次元解析を行うためのフィールドへの関心の高まりがあります。脳ミトコンドリアの形態は、特にいくつかのミトコンドリアで、中のものは極めて多様ですシナプス領域は、従来の光学顕微鏡の解像限界以下である&lt;200 nmの直径の範囲にあります。脳内のミトコンドリア標的化緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現することは著しく、共焦点顕微鏡によるオルガネラの検出を強化します。しかし、大型ミトコンドリアの画像を過飽和することなく、比較的小サイズのミトコンドリアの検出感度の制約を克服していません。シリアル透過電子顕微鏡が正常神経シナプスにおいてミトコンドリアを特徴付けるために使用されてきたが、この技術は非常に時間のかかる複数のサンプルを比較する場合は特にです。シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡（SBFSEM）技術、組織、およびデータ収集の撮像ブロックを切片の自動化プロセスを含みます。ここでは、急速にミトコンドリアの形態を再構築し、視覚化するげっ歯類の脳から定義された領域のSBFSEMを実行するためのプロトコルを提供します。このハイテクniqueはまた、定義された脳領域におけるミトコンドリアの数、量、サイズおよび分布に関する正確な情報を提供するために使用することができます。得られた画像の解像度は、（典型的には10nm未満）高いため、任意の総ミトコンドリアの形態学的欠陥も検出することができます。

我々は、脳ミトコンドリアの形態と大きさが異なるニューロンのサブコンパートメントにおいて不均一であることを示しています。ミトコンドリアを標的と緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスで形質導入された低密度の神経細胞培養上の共焦点顕微鏡は、遠位神経突起に存在するものは個別の細長い形態（ 図1 AB）を示すのに対し、神経細胞の細胞体に存在するミトコンドリアは、網状ネットワークを形成することを示しました。 SBFSEM技術を用いて、ミトコンドリアの形態、大きさ、量及び分布は、マウスの脳で分析しました。ミトコンドリアの三つ（3D）立体画像は、マウス脳の海馬において神経突起およびシナプスの両方から再構成しました。シナプス前ミトコンドリアを同定し、常駐のミトコンドリアを保有するシナプス前終末の数を定量しました。ミトコンドリアの大きさの不均一性は、（軸索コンパートメント対樹状Fiの中で観察されましたグレ1 CD）。また、マウス脳の海馬における多くの小さなシナプス前コンパートメントは、ミトコンドリア（ 図...

哺乳類の脳組織からのミトコンドリアの可視化と分析は困難な作業です。ここでは、シリアルブロック面走査型電子顕微鏡(SBFSEM)による3次元(3D)再構成解析を使用して、この重要なエネルギー生成オルガネラの形態学的および体積的解析に関する洞察を得る方法について説明します。

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

シリアルブロック面走査型電子顕微鏡法の全体的な目標は、マウス脳の定義された領域におけるミトコンドリアの形態、構造、分布、体積、および数を分析することです。この方法は、脳のミトコンドリアの構造、数、分布の変化が神経変性疾患や神経発達障害に大きく寄与しているかどうかなど、神経生物学における多くの重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、低真空走査型電子顕微鏡チャンバーに組み込まれたカスタムウルトラミクロトームを組み込むことにより、シリアル切片のイメージングプロセスを自動化することです。実験を開始するには、事前に調製したグルタルアルデヒド固定組織を0.1モルのカコジル酸緩衝液でそれぞれ5分間、3回洗浄します。0.1%タンニン酸を緩衝した1ミリリットルのカコジル酸で組織を室温で30分間後置します。後固定後、組織をカコジル酸緩衝液で洗浄します。0.3グラムのフェロシアン化カリウムと0.86グラムのカコジル酸ナトリウムを10ミリリットルの蒸留水に溶解します。使用直前に、10ミリリットルの4%四酸化オスミウムを加え、2%フェロシアン化オスミウム溶液で組織を氷上で90分間染色します。染色後、蒸留水で組織を洗浄します。新たに調製した1%チオカルボヒドラジドまたはTCH溶液でサンプルを室温で20分間処理します。次に、サンプルを洗浄します。次に、組織を2%四酸化オスミウム水で1時間染色します。染色後、蒸留水で組織を洗浄します。サンプルを1%酢酸ウラニルに含み、4°Cの蒸留水で一晩インキュベートします。翌日、蒸留水で組織をすすぎ、オーブンでウェルトン鉛アスパラギン酸染色剤とインキュベートします。組織の染色を可能な限り良好にすることは、イメージングにとって重要であり、染色が不十分な場合、サンプルに帯電現象が発生し、イメージングが困難または不可能になります。ティッシュを蒸留水で洗います。エタノールの冷却溶液を使用して、各5分間、サンプルを段階的に一連のアルコールで脱水し、続いて100%エタノールをそれぞれ10分間3回脱水します。サンプルをプロピレンオキシドでそれぞれ15分間、2回洗浄します。包埋樹脂とプロピレンオキシドを1:1で混合した中に組織を入れ、バイアルにキャップをして、組織を一晩インキュベートします。2時間後にバイアルのキャップを外し、プロピレンオキシドが9時間で蒸発します。組織を清潔なバイアルに100%新鮮な包埋樹脂に2時間移します。印刷された紙ラベルが入った平らな型にサンプルを新しい埋め込み樹脂に埋め込み、オーブンで硬化させます。1時間後、組織の配置と位置合わせを確認し、必要に応じて調整します。サンプルを関心のある領域にトリミングし、ゲル化シアノアクリレート瞬間接着剤を使用してアルミニウムピンに取り付けます。次に、ブロックの側面の周りにサンプルをコロイド状銀ペーストでコーティングして、アルミニウムピンへの導電性経路を提供します。チャンバー内ウルトラミクロトームステージと低キロボルト反射電子検出器を備えた走査型電子顕微鏡システムを使用して、組織標本を検査します。これらの設定でサンプルを画像化します。解析を開始するには、[画像]、[タイプ]、[8 ビット]の順に選択して、画像を元の独自の 16 ビットから 8 ビット TIFF 形式に変換します。この手順での自動コントラストおよび/または明るさの変換が画像に適していない場合は、16ビット画像を再度開き、画像、調整、明るさ/コントラストを押します。すべての画像に適した範囲を選択し、[適用]を押します。次に、変換を実行します。スライス間で許容できない画像の動きがあった場合は、SIFT で Plugins、Registration、および Linear Stack Alignment を選択して画像スタックを位置合わせし、剛体ではなく平行移動のみモードのアライメントを設定します。登録前に、画像、調整、キャンバスサイズを選択してキャンバスサイズを拡大します。または、目的の領域を選択してからトリミングすることで、画像を関心領域に縮小します。必要に応じて、ImageJ を使用してイメージをより小さく、管理しやすいサイズに拡大縮小し、[イメージ] と [スケール] を選択します。低密度の神経細胞培養物に対する共焦点顕微鏡法は、神経細胞体に存在するミトコンドリアが網状ネットワークを形成するのに対し、遠位神経突起に存在するミトコンドリアは離散的な細長い形態を示すことを示しました。シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡法(SBFSEM)法を用いて、マウスの脳内でミトコンドリア、樹状突起、軸索静脈瘤が明確に観察されました。マウス脳組織の神経突起におけるミトコンドリアの3日間の再構築では、樹状突起ミトコンドリアと軸索ミトコンドリアのサイズに違いが見られました。代表的な2次元SBFSEM画像から抽出されたデータから、ニューロンのシナプス前に存在するミトコンドリアの体積またはサイズは、シナプス外領域に存在するミトコンドリアよりも有意に小さいことが明らかになりました。SBFSEM分析によって取得された画像は、個々のミトコンドリアの超微細構造特性を視覚的に視覚化するための解像度を向上させます。ミトコンドリアの細胞コンパートメントは、非シナプス体細胞ミトコンドリアやシナプス前ミトコンドリアなどの容易に識別可能な構造への近接性を決定することにより、分類することができます。この手法は、染色に3日、樹脂硬化に2日、この分析に適したスタックを生成するためのイメージング1日、分析の準備のための画像後処理に約2〜4時間を含め、約7日で行うことができます。この手順は、遺伝的に標識されたミトコンドリアによるライブイメージングなど、ミトコンドリアをイメージングする他の方法と組み合わせて使用 することもでき、ミトコンドリアの輸送やその分裂と融合のダイナミクスに関する質問に答えることができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典:Mukherjee, K., et.al. シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡を用いた脳ミトコンドリアの解析 J. Vis. Exp. (2016)このビデオは、その準備を示しています。...

シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡による神経細胞ミトコンドリアのイメージング

共焦点走査顕微鏡は、生きた動物における灌流心臓または骨格筋​​におけるミトコンドリアの単一のイベントを画像化するために適用される。スーパーオキシドが点滅し、膜電位の変動などの単一ミトコンドリアのプロセスのリアルタイム監視は、生理学的に関連するコンテキストでかつ病理学的摂動の間、ミトコンドリア機能の評価が可能。...

シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージングインビボ

我々は、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2およびワサビペキシダーゼ染色を含む相関光および体積電子顕微鏡を用いて遺伝子改変後の全細胞におけるミトコンドリアおよび小和性網膜の分布を研究するためのプロトコルを提示し、同じセクション内の標的遺伝子の有無にかかわらず細胞のシリアル断面、および電子顕微鏡によるシリアルイメージング。...

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

ミトコンドリアの輸送および形態の障害は、様々な神経変性疾患に関与している。提示されたプロトコルは、遺伝性痙攣対麻痺におけるミトコンドリア輸送および形態を評価するために、誘導多能性幹細胞由来前脳ニューロンを使用する。このプロトコルは、軸索に沿ったミトコンドリア人身売買の特徴付けとその形態の分析を可能にし、神経変性疾患の研究を容易にする。...

遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析

ヒト誘導多能性幹細胞由来の脳オルガノイドの生成とミトコンドリア病のモデル化におけるその使用に関する詳細なプロトコルについて述べています。...

ミトコンドリア病モデルのためのヒト脳オルガノイドの生成

ミトコンドリアネットワークは非常に複雑で、解析が非常に困難です。新しいMATLABツールは、タイムラプス画像でライブ共焦点画像化されたミトコンドリアを解析しますが、出力量が大きく、個別の手動操作が必要です。この問題に対処するために、ルーチン最適化が開発され、迅速なファイル分析が可能になりました。...

アイソフォーム特異的レチノイン酸受容体による生きた神経細胞ミトコンドリアの恒常性調節の最適化された自動解析(英語)

本研究では、マウスの脳組織 をin...

パーキンソン病モデルにおけるミトコンドリア形態の組織学的検討

このプロトコルは、少量のサンプルしか利用できない場合の呼吸スーパーコンプレックスの分析技術について説明しています。...

ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples) 

このプロトコルは、老化中の C.エレガンスの...

老化中の C.エレガンス におけるミトコンドリア形態のイメージングと定量化

この研究では、ステップバイステップのプロトコルを説明し、サンプル調製、画像取得、データ解析など、生細胞のミトコンドリアの形態学的特性を決定するための重要な詳細を強調します。この方法は、さまざまな条件を研究するためにミトコンドリアの形態を調べるために一般的に使用されます。...

共焦点顕微鏡法を用いた生細胞のミトコンドリア形態の決定

学ぶシリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いたマウス脳ミトコンドリアの形態・構造・分布・体積・数の解析手法。この方法は神経変性疾患と神経発達障害の研究に貢献します。

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

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