シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

シリアルブロック面走査型電子顕微鏡法の全体的な目標は、マウス脳の定義された領域におけるミトコンドリアの形態、構造、分布、体積、および数を分析することです。この方法は、脳のミトコンドリアの構造、数、分布の変化が神経変性疾患や神経発達障害に大きく寄与しているかどうかなど、神経生物学における多くの重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、低真空走査型電子顕微鏡チャンバーに組み込まれたカスタムウルトラミクロトームを組み込むことにより、シリアル切片のイメージングプロセスを自動化することです。

実験を開始するには、事前に調製したグルタルアルデヒド固定組織を0.1モルのカコジル酸緩衝液でそれぞれ5分間、3回洗浄します。0.1%タンニン酸を緩衝した1ミリリットルのカコジル酸で組織を室温で30分間後置します。後固定後、組織をカコジル酸緩衝液で洗浄します。

0.3グラムのフェロシアン化カリウムと0.86グラムのカコジル酸ナトリウムを10ミリリットルの蒸留水に溶解します。使用直前に、10ミリリットルの4%四酸化オスミウムを加え、2%フェロシアン化オスミウム溶液で組織を氷上で90分間染色します。染色後、蒸留水で組織を洗浄します。

新たに調製した1%チオカルボヒドラジドまたはTCH溶液でサンプルを室温で20分間処理します。次に、サンプルを洗浄します。次に、組織を2%四酸化オスミウム水で1時間染色します。

染色後、蒸留水で組織を洗浄します。サンプルを1%酢酸ウラニルに含み、4°Cの蒸留水で一晩インキュベートします。翌日、蒸留水で組織をすすぎ、オーブンでウェルトン鉛アスパラギン酸染色剤とインキュベートします。

組織の染色を可能な限り良好にすることは、イメージングにとって重要であり、染色が不十分な場合、サンプルに帯電現象が発生し、イメージングが困難または不可能になります。ティッシュを蒸留水で洗います。エタノールの冷却溶液を使用して、各5分間、サンプルを段階的に一連のアルコールで脱水し、続いて100%エタノールをそれぞれ10分間3回脱水します。

サンプルをプロピレンオキシドでそれぞれ15分間、2回洗浄します。包埋樹脂とプロピレンオキシドを1:1で混合した中に組織を入れ、バイアルにキャップをして、組織を一晩インキュベートします。2時間後にバイアルのキャップを外し、プロピレンオキシドが9時間で蒸発します。

組織を清潔なバイアルに100%新鮮な包埋樹脂に2時間移します。印刷された紙ラベルが入った平らな型にサンプルを新しい埋め込み樹脂に埋め込み、オーブンで硬化させます。1時間後、組織の配置と位置合わせを確認し、必要に応じて調整します。

サンプルを関心のある領域にトリミングし、ゲル化シアノアクリレート瞬間接着剤を使用してアルミニウムピンに取り付けます。次に、ブロックの側面の周りにサンプルをコロイド状銀ペーストでコーティングして、アルミニウムピンへの導電性経路を提供します。チャンバー内ウルトラミクロトームステージと低キロボルト反射電子検出器を備えた走査型電子顕微鏡システムを使用して、組織標本を検査します。

これらの設定でサンプルを画像化します。解析を開始するには、[画像]、[タイプ]、[8 ビット]の順に選択して、画像を元の独自の 16 ビットから 8 ビット TIFF 形式に変換します。この手順での自動コントラストおよび/または明るさの変換が画像に適していない場合は、16ビット画像を再度開き、画像、調整、明るさ/コントラストを押します。

すべての画像に適した範囲を選択し、[適用]を押します。次に、変換を実行します。スライス間で許容できない画像の動きがあった場合は、SIFT で Plugins、Registration、および Linear Stack Alignment を選択して画像スタックを位置合わせし、剛体ではなく平行移動のみモードのアライメントを設定します。

登録前に、画像、調整、キャンバスサイズを選択してキャンバスサイズを拡大します。または、目的の領域を選択してからトリミングすることで、画像を関心領域に縮小します。必要に応じて、ImageJ を使用してイメージをより小さく、管理しやすいサイズに拡大縮小し、[イメージ] と [スケール] を選択します。

低密度の神経細胞培養物に対する共焦点顕微鏡法は、神経細胞体に存在するミトコンドリアが網状ネットワークを形成するのに対し、遠位神経突起に存在するミトコンドリアは離散的な細長い形態を示すことを示しました。シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡法(SBFSEM)法を用いて、マウスの脳内でミトコンドリア、樹状突起、軸索静脈瘤が明確に観察されました。マウス脳組織の神経突起におけるミトコンドリアの3日間の再構築では、樹状突起ミトコンドリアと軸索ミトコンドリアのサイズに違いが見られました。

代表的な2次元SBFSEM画像から抽出されたデータから、ニューロンのシナプス前に存在するミトコンドリアの体積またはサイズは、シナプス外領域に存在するミトコンドリアよりも有意に小さいことが明らかになりました。SBFSEM分析によって取得された画像は、個々のミトコンドリアの超微細構造特性を視覚的に視覚化するための解像度を向上させます。ミトコンドリアの細胞コンパートメントは、非シナプス体細胞ミトコンドリアやシナプス前ミトコンドリアなどの容易に識別可能な構造への近接性を決定することにより、分類することができます。

この手法は、染色に3日、樹脂硬化に2日、この分析に適したスタックを生成するためのイメージング1日、分析の準備のための画像後処理に約2〜4時間を含め、約7日で行うことができます。この手順は、遺伝的に標識されたミトコンドリアによるライブイメージングなど、ミトコンドリアをイメージングする他の方法と組み合わせて使用 することもでき、ミトコンドリアの輸送やその分裂と融合のダイナミクスに関する質問に答えることができます。