Name: 慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学ぶアミロイドβオリゴマーによる神経毒性のメカニズムと、浸透圧ポンプを用いた抗体治療による神経保護効果を動物モデルで評価する方法。この技術はアルツハイマー病の新規治療法開発に貢献します。

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私たちは、ネズミの研究に対して動物施設のキャロライン・ブシャールに感謝します。A.S.はJ.A.ド・セーヴ・マスター・フェローシップを、B.P.はモントリオール大学からCOPSEフェローシップを授与されています。この研究は、FRQS-ファイザーからのJ.B.による助成金と、Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Centerからのスタートアップ資金によって資金提供されました。

倫理の声明：このプロジェクトのための動物プロトコルは、動物ケアに関するカナダの協議会のガイドラインに準拠してHôpitalデュサクレクール寺院モントリオールの動物ケア委員会の承認を得ました。 定位手術の前に1.カテーテルの準備<ol><li>浸透圧ポンプを有するカニューレを接続するために使用されるPE50カテーテルを（長さ6 cm）で ​​切断した （ 図1A参照）。人工脳脊髄液（aCSFの）とPE50カテーテルを記入し、カテーテルの両端を密封します。使用するまで4℃でカテーテルを保管してください。 </li></ol>定位2.カニューレ注入<ol><li>無菌状態で手術を行います。オートクレーブにより、すべての手術器具や材料を滅菌します。徹底的に定位固定装置と作業領域をきれいにし、そして70％のエタノール溶液で消毒。外科手術用マスク、ヘアボンネットと滅菌手袋を着用してください。</li><li>腹腔内（IP）をケタミン及びキシラジンの溶液（100ミリグラム/ kgおよび10mg / kgのそれぞれ）を注入することによってラットを麻酔。穏やかなつま先のピンチの後に動きをチェックすることにより、麻酔を確認してください。 </li><li>手術前に麻酔をかけ、動物、少なくとも30分に皮下（s）;非ステロイド性抗炎症薬（1ミリグラム/キログラムメロキシカム）を注入します。 </li><li>バリカンを用いて動物の頭を剃るとグルコン酸クロルヘキシジンの溶液2％、イソプロピルアルコール2％の3回で皮膚を消毒します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医の眼軟膏を適用します。 </li><li>耳のバーで定位フレームに動物を置きます。定位フレームのホルダアーム上の1つのカニューレを修正しました。頭の上に（SC）局所麻酔薬（ブピバカイン（1.5ミリグラム/ kg）およびリドカイン（1.5ミリグラム/キログラム）を注入します。麻酔は、3％のイソフルランを提供するノーズコーンを配置することによって、全体の手順の間に維持している。全体手術野はする必要がありますオフドレープが、それはより良い技術を実証するためにここで行われていませんでした。 </li><li>メスで頭の上に3センチメートルの切開を行います。明確な頭蓋骨を残すために切開の周りに4クランプを取り付けます。ラウンドチップはさみを使用して、動物の肩甲骨の間の皮膚の下にポケット（2×2 cm 2の）を作ります。 </li><li>ブレードと頭蓋骨の骨膜をこすり。出血場合頭蓋骨にガーゼパッドを適用します。 </li><li>頭蓋骨は平坦でよく定位フレーム上に整列されていることを確認します。頭蓋骨が平坦であることを確認するために、高さはブレグマでラムダで座標を確認してください。基準点として使用されるブレグマの座標を取ります。 </li><li>ブレグマから出発し、海馬に両側性に移植される2つのガイドカニューレの座標計算（前後： - 0.42センチメートル;内外：0.30センチメートル±を、背腹： - 0.28センチメートルPaxinosとワトソンラット脳アトラスに応じて）29は、 。示しますマーカーとカニューレの位置。 </li><li>両方のカニューレの注入点で頭蓋骨に穴（0.5ミリメートル）を開けます。歯科用セメントを適用するときにカニューレを固化するネジを挿入するために、他の二つの穴それらの点の上下に約5mmのドリル。 </li><li>以前にメスでaCSFので満たされたカテーテルの一方の端をカットし、カニューレの角度アームに挿入します。歯科用セメントとの最初のカニューレを修正しました。第二のカニューレ上の位置の周りに歯科用セメントを置かないようにしてください。 </li><li>その後、最初のカニューレからホルダアームを削除し、その中の第二のカニューレを固定し、3分 - 2のための歯科用セメントの乾燥をしてみましょう。繰り返しは、2.11と2.12を繰り返します。両方のガイドカニューレにダミーカニューレを入れてください。ダミーとガイドカニューレは、組織浸潤およびカニューレを遮断を防止するために、同じ長さのものであることを確認してください。 </li><li>以前に動物の肩甲骨の間に作られたポケットの中に両方のカテーテルの自由端を挿入します。クランプを外し、で皮膚をステッチ縫合糸4-0。 注：トップガイドカニューレは、今後のAβo注入のためにアクセスできる必要があります。 </li><li>定位フレームから動物を削除し、そのケージに戻ってそれを置きます。動物が目覚めるまで、手術後の回復時には、暖房水毛布の上にケージを置きます。必要に応じて、ラットは熱から離れて移動することができますので、ケージは、パッドの上に部分的であるべきです。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、常に動物を監視します。 </li><li>綿密なモニタリングの下で​​10日間手術から回復するために動物施設にラットを返します。 注：完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。メロキシカム（1ミリグラム/ kg）を、痛みを治療するための手術後2日間は一日一回与えられています。 </li></ol> 3.浸透圧ポンプのインストール<ol><li>コントロールIgG1、ある日、インストールの前に、6E10抗体（100μlの1mg / mlの）と浸透圧ポンプを埋めます抗体（1 mg / mlで、100μl）を無菌条件下で製造者の指示に従って。ポンプを活性化するために37℃で一晩滅菌蒸留水でポンプを保管してください。 </li><li>浸透圧ポンプ（7日間0.5μL/時間）をインストールするためにイソフルラン3％のラットを麻酔。肩甲骨の間にひげをそるとグルコン酸クロルヘキシジンの溶液2％、イソプロピルアルコール2％で皮膚を消毒します。ガイドカニューレに接続されたPE50カテーテルを配置するために、肩甲骨の間メスで2センチの切開を行います。 </li><li>メスで歯科用セメントを含むPE50カテーテルの端をカットします。 PE50カテーテルに浸透圧ポンプを接続し、接続を確保するためのポンプとカテーテル接合部にいくつかの歯科用セメントを追加します。 </li><li>縫合糸4-0でしっかりと肌をステッチ。暖房水パッドの上に戻って、そのケージに動物を置きます。イソフルラン麻酔（約5分）から急速に目を覚ます動物を観察します。 注：手術はアプロかかりますximately 5〜10分。 </li></ol> 4.Aβo覚醒中の煎茶と自由に動くラット<ol><li>以前に報告されているようAβo溶液（0.2μgの/μl）を準備します。28,30Aβoが注入前に室温で1時間、動的かつ自然に集約できるようにします。 </li><li>輸液ポンプに210μlの注射器を取り付けます。滅菌蒸留水5μlのシリンジを埋めます。メスで長さが約60cmに2 PE50カテーテルをカット。 1ミリリットルのシリンジと21G針を用いて、滅菌蒸留水で両方のカテーテルを埋めます。 </li><li>カテーテルの一端に1ミリリットル注射器を維持し、ハミルトンシリンジにもう一方の端を接続します。 1ミリリットル注射器を取り外し、カテーテル内に気泡がないことを確認してください。 </li><li> PE50カテーテルの終わりに内部カニューレを挿入します。ハミルトンシリンジにμlでTO1までの滅菌蒸留水を使用して、PE50カテーテルに接続された内部カニューレを埋めます。 pで気泡を作ります2μlのまでピストンをバックulling。 </li><li>ピペッティング順守の最低限の先端を使用してAβo液を混ぜます。混合中に気泡を形成することは避けてください。 3.5μlのまでピストンを引き戻すことにより、Aβo液の1.5μlの持つ内部カニューレの両方を入力します。 </li><li>両方のカテーテルで行われ、気泡の前後にマーカーで線を作成します。これは現在進行中の輸液のチェックポイントとして機能します。注入のために、輸液ポンプの近くにケージを持参し、そのカバーを取り外します。 </li><li>寄り添いにおけるラットを置き、しっかりとラットの頭部を固定化するために、その首に寄り添いの腕をこすり。 2ガイドカニューレからダミーカニューレを取り外します。以前にガイドカニューレで製造した内部カニューレを挿入します。彼らは完全に挿入し、ガイドカニューレのベースにはよく固定されていることを確認します。 </li><li>寄り添いからラットを放し、競合ストレスを制限するために、そのケージに戻ってそれを置きます。カテーテルはtogetねじったりしないことを確実にするために密接に監視彼女と注入が適切に行われています。 </li><li>輸液ポンプの電源をオンにします。 0.1μL/分（10分）の速度でAβo溶液1μlを注入します。注入中、2.5μlの3.5μLから注射器ピストンが移動することを確認し、両方のPE50カテーテル内の気泡が連続的に移動すること。 </li><li> Aβoソリューションの効率的な拡散を可能にするために注入した後、別の5分間の場所に内部カニューレを残します。注入溶液の還流を防止するために、内部カニューレ、蓋をガイドカニューレを除去するために戻って寄り添いにおけるラットを持参してください。カニューレの角度アーム直前に停止ダミーカニューレを使用してください。そのケージに動物を返します。 </li><li>連続6日間にわたって1日1回Aβo注入を繰り返します。断頭により動物を安楽死させます。 </li></ol>

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特別な注意が必要で、このプロトコル内の重要なステップがあります。カニューレを移植する場合、第二のカニューレの穴をブロッキングを防止するためにあまりにも液体である歯科用セメントを入れないようにします。炎症および可能炎症反応を防止するために、ポンプに取り付けられたP50カテーテルの自由端に歯科用セメントを配置することが重要です。定位手術当日は、カニューレをブロックを回避するためにガイドカニューレと同じ長さであるダミーカニューレを使用します。しかし、ポンプをインストールした後、海馬へのポンプからの溶液の適切な注入を可能にするために、カニューレの角度アームの前に停止短いダミーカニューレを使用します。密接Aβo注入を監視し、カテーテルで行わ気泡が点滴中に連続的に移動していることを確認します。常に注入カニューレが完全に輸液中にガイドカニューレに挿入されていることを確認してください。 問題は、Aβ注入中の出会いである場合、内部カニューレがブロックされていないことを確認します。それが事実である場合、内部カニューレを通して滅菌蒸留水をフラッシュします。ガイドカニューレが閉塞されている場合は、ガイドカニューレに内部カニューレを回します。それ以外の場合は内部カニューレを上下に移動します。寄り添いにおける競合は、特に最初の日に、ラットのためにストレスになることができます。動物のストレスを減少させるために、我々は操作し、定位手術前に寄り添い匹のラットを慣らすことをお勧めします。 多くの利点は、 インビボのアプローチでは、この新規かつ柔軟に帰することができます。実際、Aβoの性質を正確に注入する前に制御することができる注入、及び（脳由来Aβ溶液対合成など）Aβ調製物の異なるタイプは、 インビボでそれらの神経毒性を評価するために注入することができます。このモデルはまたによって、様々なAβ種（ 例えば 、モノマー、低および高分子量オールメカニズムを調べるために使用することができigomers、プロトフィブリル）は、in vivoで神経毒性作用を誘導することができ、そしてどのように免疫療法などの治療法は、脳での有害な影響を打ち消すことがあります。点滴が目を覚まし、自由に動く動物で実行されているので、以前の研究で示されるように、シグナル伝達経路上の麻酔薬とAβo液との間には交絡の影響は、ありません。自由に動く動物で32,33煎茶も行動試験の任意と互換性があります注入の前と後の時間。 Aβoとポンプ設置の注入は、老化の間にAβoと治療の効果を決定するために、異なる年齢の動物で行うことができます。神経変性は、注入部位の近傍で発生するため、シナプスおよびニューロンの損失が異なり、局所的な脳領域に誘導することができます。担保Aβoの注入および制御（車両またはスクランブルAβ）は、同じ動物内の任意の変化を制御することができます。逆に、Aβoまたは制御ゾル行動タスクで動物をテストする際utionsには、例えば、左右の海馬に両側性に注入することができます。 Aβoと治療の注入は同時に行うか、代わりにポンプすることができ、治療がAβ沈着後に有効であるかどうかを評価するためにAβo注入後にインストールすることができます。 Aβoの脳室内注入を行う際に、ここで説明したものと同じプロトコルを使用することもできます。細胞内シグナル伝達経路にAβoの効果が適度に短い時間枠内でのニューロン損失の前後に評価することができます。 Aβ注入のドーズ量及び数は、多かれ少なかれ深刻なAβの病原性が得られるように調整することができます。 非常に汎用性が、この技術はいくつかの制限を有します。カニューレの移植は、手術後の最初の数日で組織および神経炎症の機械的破壊を生成します。 Aβoinfuを開始する前に、このように、手術後少なくとも1週間待つことが必須ですシオン、およびこれらのイベントを考慮に入れるために、適切なコントロール（車両または不活性スクランブルAβの注射）を追加します。また、Aβoのわずかな体積は、溶液の拡散を制限するために注入することができます。 浸透圧ポンプは、Aβ誘発性神経変性を防止するように設計された薬剤の前臨床検証のための便利でユニークな配信方法を表します。 6E10抗体を用いた免疫療法は以前に、脳内の31の Aβの蓄積を減少させることが示されているので、私たちは私たちの新しいin vivoでのアプローチを検証するために、概念実証として6E10抗体を使用します。このモデルでは浸透圧ポンプを用い今前臨床AD患者におけるAβoの堆積および神経毒性を防ぐことができる新規の疾患修飾治療薬を開発するために使用される可能性があります。

当初は、脳内の不溶性Aβ種の蓄積は、ADの病因の中心であったことを提案した。1,2しかしながら、アミロイド斑はまた、高齢者のいくつかの認知的に正常に検出された。3-7プラーク沈着と認知障害との間に存在する貧困層の相関関係を克服するためにAβオリゴマー化のプロセスは非常に動的であるので、ADで、最新のレポートは患者の臨床状態にはるかに良い相関性疾患の発症、で毒性の可溶性Aβoの存在を示している。8月14日 、それはその神経毒性を示唆されました代わりに、オリゴマーの1つの特定のタイプの様々なAβoによって誘導される。14-16を多くの研究がAβoはシナプスとニューロンの喪失の前にシナプス機能障害を開始できることが示されているので、17-24現在の理論は、Aβ関連の治療はに効果的であるかもしれないことを示しています早期ADのではなく、臨床試験において、これまでテストしたとして、後の段階で。 ADの病因の一つ顕著な特徴は、疾患の後期段階で観察された大規模かつ広範な細胞死、および記憶障害は、臨床レベルで検出可能になる局在化した脳領域で観察された重要なシナプスとニューロンの損失です。歯状回（DG）に嗅内皮質（EC）から突出し有孔質路は、ADの早期発症で顕著に乱される。25,26 ADの前駆状態では、軽度認知障害（MCI）は、見かけ上の有意な細胞死になったときDGにおけるシナプスの損失だけでなく、ECにおいて検出される。25,26 証拠の大きな体が早期ADにおいて可溶性Aβoの毒性作用を正確に指摘したが、神経細胞培養又は器官脳スライス培養で観察された8月14日 Aβo誘発性神経変性は、動物モデルで再現することがより困難となっている。27トランスジェニックADの大半Aを過剰発現するモデルβは、アミロイド斑、タウの過剰リン酸化、シナプス欠損及び記憶障害を有する。27しかし 、これらのモデルは、AD患者の海馬で観察されたモデル化された細胞死にそれほど成功しています。これらの技術的な問題を克服するために、我々は、可溶性Aβoの脳内の注入に基づくモデルを開発しました。私たちは、可溶性Aβoの海馬内注入が緩やかニューロン損失およびタウの過剰リン酸化、ADにおけるメモリの減少に関連する2つの病理学的特徴を誘導繰り返しその先に報告した。28ここでは、特別にAβoの同時注入のために設計カニューレを使用してテストAD治療に新規な方法を示していますそして、浸透圧ポンプとAβo抗体（6E10）の連続注入。 浸透圧ポンプは、直接Aβoの注入部位での生体内で Aβo誘発性神経変性に対する任意の抗体（または他の化合物）の効率をテストするためのユニークな方法を提供します。したがって、これらはポンプのrepr固体の概念実証ADにおける潜在的な治療薬の作用機序に関するを確立するための便利なツールをESENT。最近の報告は、ADの初期段階における可溶性Aβoの重大な影響を指摘しているので、Aβoに向けて多くの治療法は、実際に大学や製薬研究所によってテストされています。この新規な動物モデルは、初期ADにおいて観察されたシナプスおよびニューロンの損失を模倣することができ、浸透圧ポンプはAβo注入部位に特異的に連続的に治療剤を注入するために使用されます。患者を軽度から中等度で、過去数年間にわたって試験AD治療の繰り返しの失敗はAβoが豊富に蓄積し、不可逆的な脳損傷を生成するために開始する前に、前認知症患者に臨床試験を開始するために研究者を促しました。この文脈では、堆積およびAβoの結果として神経毒性を防止する新規化合物を試験することは前臨床患者への関心であるかもしれません。

<table><tbody><tr><td>人工脳脊髄液(aCSF)</td><td>ハーバード装置</td><td>59-7316</td><td></td></tr><tr><td>PE 50カテーテル薄壁</td><td>プラスチック1個</td><td>C232CT</td><td></td></tr><tr><td>塩酸ケタミン(100 mg / ml)</td><td>バイオニッチ</td><td>1989529</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン塩酸塩(100 mg / ml)</td><td>Bimeda</td><td>8XYL004C</td><td></td></tr><tr><td>メロキシカム(5 mg / ml)</td><td>Norbrook</td><td>215670I01</td><td></td></tr><tr><td>グルコン酸クロルヘキシジン2%とイソプロピルアルコール2%の溶液</td><td>Carefusion</td><td>260100C</td><td></td></tr><tr><td>リドカイン塩酸塩</td><td>Alveda Pharma</td><td>0122AG01</td><td></td></tr>ブ<tr><td>ピバカイン塩酸塩</td><td>Hospira</td><td>1559</td><td></td></tr><tr><td>眼科軟膏</td><td>Baussh and Lomb inc.</td><td></td><td></td>2125706</tr><tr><td>定位固定装置フレーム</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>脳定位カニューレホルダーアーム</td><td>ハーバード装置</td><td>72-4837</td><td></td></tr><tr><td>ドリル</td><td>ドレメル</td><td>8050-N/18</td><td></td></tr><tr><td>ガイドカニューレ</td><td>プラスチック</td><td>326OPG/SPC</td><td></td></tr><tr><td>インジェクションカニューレ</td><td>プラスチック</td><td>C315I/spc</td><td></td></tr><tr><td>ダミーカニューレ</td><td>プラスチック 1</td><td>C315DC/spc</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸コーティング vicryl rapide 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VR2297</td><td></td></tr><tr><td>歯科用アクリル セメント</td><td>ハーバード装置</td><td>72-6906</td><td></td></tr><tr><td>ネジ</td><td>JI Morris Company</td><td>P0090CE125</td><td></td></tr><tr><td>6E10 抗体 (マウス IgG1 アイソタイプ)&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>803003</td><td></td></tr><tr><td>マウス IgG1 アイソタイプ対照抗体</td><td>アブカム</td><td>AB18447</td><td></td></tr><tr><td>アルゼット 浸透圧ポンプ モデル 1007D</td><td>Durect corporation</td><td>290</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td>CA2L9100</td><td></td></tr><tr><td>アミロイドベータ 1-42&nbsp;</td><td>rPeptide</td><td>A-1163-1</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ (10 &micro;l)</td><td>フィッシャーサイエンティーク</td><td>14815279</td><td></td></tr><tr><td>輸液シリンジポンプCMA402</td><td>ハーバード装置</td><td>CMA8003110</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ1 mlBD</td><td></td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>針21 G</td><td>テルモ</td><td>NN-2125R</td><td></td></tr><tr><td>寄り添う</td><td>ロミールバイオメディカル</td><td>RTS04</td><td></td></tr></tbody></table>

慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

（事実とイベント用メモリ）海馬依存性の明示的なメモリの減少は、アルツハイマー病（AD）の最も初期の臨床症状の一つです。よくシナプス損失とその後の神経変性は、ADにおける記憶障害のための最良の予測因子であることが確立されています。最新の研究では、臨床症状が明らかになる前に、約10〜15年に人間の脳内に蓄積し始め、可溶性アミロイドβオリゴマー（Aβo）の神経毒性の役割を強調してきました。多くの報告は、可溶性AβoがADモデルおよびヒトにおける記憶障害と相関することを示しています。神経と脳スライス培養で観察されたAβo誘発性神経変性は、多くの動物モデルで再現することがより困難となっています。ここに示した繰り返しAβo注入のモデルでは、この問題を克服し、新たな疾患修飾治療薬を開発するための2つの主要なドメインに対処できるように：早期ADを診断するための生物学的マーカーを同定し、分子メカを決定しますニズムは、ADの発症にAβo誘発性記憶障害を支えます。比較的速い患者の臨床状態とあまり相関しない不溶性Aβフィブリルへの可溶性Aβo集約するので、可溶性Aβoを新たに用意されていると海馬でマークされた細胞死を生成するために6日間一日一回当たりの注射しました。我々は、特別にAβoと浸透圧ポンプを用いて、海馬におけるAβo抗体（6E10）の連続注入の同時注入のために設計カ​​ニューレを使用していました。 生体内の方法で革新的なこれは今前認知症患者におけるAβoの堆積および神経毒性を妨げる可能性がある新しいAD治療の効率を検証するための前臨床試験に使用することができます。

Aβoの神経毒性効果は、カニューレを注入することによってロングエバンスラットで調べました 海馬のDG。可溶性Aβoが6日連続にわたって毎日注射した。我々は、特別に浸透圧ポンプ（ 図1A）を使用して海馬にAβoの同時点滴と連続6E10の注入または対照IgG1抗体のために設計カニューレを使用していました。免疫組織化学ラットを麻酔したため、0.9％NaClを経心的に灌流し、脳を24時間、48時間、15％スクロース溶液を4％パラホルムアルデヒド溶液に浸漬しました。自由に浮遊冠状切片（40μm）を1時間1％ヤギ血清でブロックし、30分間、0.3％H 2 O 2で処理し、抗汎Aβ抗体と共に4℃で一晩インキュベートしました。セクションは、抗体を適用する前に、3分間70％ギ酸で処理しました。検出は、ABC複合体及び0を用いて行きました。05パーセントの3,3-ジアミノベンジジンソリューション。切片をトルエン5分間でインキュベートし、ゼラチンコートスライドガラス、空気乾燥させ、2時間、脱水し（30、70、95、100％のアルコール）に取り付けられ、カバースリップしました。クレシルバイオレット染色のために、切片を、0.5％クレシルバイオレット溶液で10分間インキュベートしたトルエン5分間に浸漬（70、95、および100％アルコール）脱色0.5％酢酸溶液で1分間インキュベートし、そしてで覆われガラスカバースリップ。 ここに示された結果は、この蓄積に関連する注入部位近傍のDGにおけるAβoの堆積、及び細胞死を示します。私たちは、レベルAβoは、実質的に6E10抗体処理（ 図1B）により減少したことがわかりました。マーク神経変性はAβoの注入部位の近くで観察し、6E10抗体処理（ 図1B）によって減衰しました。これらの結果は、我々はDGで観察Aβo蓄積と一致していますここに示した6E10抗体を用いた免疫療法によるアミロイド沈着のマウスで繰り返さAβo注入を以下に示します。28クリアランスは、トランスジェニックADマウスモデルにおいて行われ、別のレポートに沿ったものである。31 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54215/54215fig1.jpg" /> Aβo注入中二国間カニューレと動物の 図1. 写真 Aβoの溶液。（0.2μgの/μlの; 1μl）を、内部カニューレに接続されたPE50カテーテルを用いて、（6日間、1日1回）目を覚まし、自由に移動したラットに注射しましたガイドカニューレに挿入。コントロール（CTL）IgG1または6E10抗体を用いた治療は、動物の肩甲骨の間の皮下に位置する浸透圧ポンプを使用してAβo注入部位に直接注入した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54215/54215fig1large.jpg" target="_blank">目の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>図です。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54215/54215fig2.jpg" /> 。のCtl（IgG1の）で6日間連続一日一回注射し、処理したかで6E10抗体;Aβo沈着により誘発される 図2. ニューロン損失は、6E10抗体治療 A、Aβo（1μL/μlの0.2μgの） によって減衰されます浸透圧ポンプを用いて、注入のサイト。B、カニューレ挿入、およびセル損失を示すクレシルバイオレットでの代表的な染色にすぐに次のセクションにDGでAβoの代表的な蓄積。スケールバー：50μmの（n = 4）は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54215/54215fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

in vivoでのAβoの効果を研究するために、Aβoの神経毒性作用を打ち消すために、浸透圧ポンプを使用して海馬にAβo抗体（6E10）の持続注入と組み合わせた可溶性Aβoの海馬注入の反復に基づくモデルを開発しました。

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

この外科的介入の全体的な目的は、アミロイドβオリゴマーの毒性に対する治療法の効果をin vivoで検証することです。この手法は、動物モデルにおいてアミロイドβオリゴマーの神経毒性作用を標的とした新しい治療法の発見など、アルツハイマー病分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、アミロイドβオリゴマーがin vivoで神経毒性を誘発するメカニズムを調査できることです。そして、免疫療法のような我々の治療法は、脳への有害な影響を打ち消す可能性があります。ここからは、私の研究室の技術者であるChloe Provostが手順を実演します。カニューレ植込みの手順を開始するために、まずPE50カテーテルを6 cmの長さに切断します。次に、カテーテルに人工脳脊髄液を満たします。ヒートシーラーを用いてカテーテルの両端を密封します。両端に歯科用セメントを塗布します。承認された方法に従ってラットを麻酔し、足指を軽くつまんで反応を確認し、麻酔状態であることを確認します。次に、麻酔した動物に非ステロイド性抗炎症薬を投与します。バリカンで動物の頭部を剃毛した後、2%クロルヘキシジングルコン酸塩および2%イソプロピルアルコール溶液で皮膚を消毒します。麻酔中の乾燥を防ぐため、動物の眼に動物用眼軟膏を塗布します。次に、イヤーバーを用いて動物を脳立体定位固定装置に固定します。カニューレ1本を立体定位固定装置のホルダーアームに固定します。局所麻酔剤を投与し、頭頂部にメスで3 cmの切開を加えた後、切開部の周囲に4つのクランプを装着して頭蓋骨を露出させます。次に、丸型Cis-tip鋏を用いて、動物の肩甲骨間の皮下に2 cm×2 cmの正方形のポケットを作成します。再び頭部に移り、ブレードで頭蓋骨の骨膜を掻き出します。出血がある場合は、頭蓋骨にガーゼパッドを当ててください。次に、頭蓋骨が平らで立体定位固定装置上で適切に整列しているかを確認するため、lambda（ラムダ）とbregma（ブレグマ）の高さ座標を確認します。基準点として使用するbregmaの座標を記録してください。2本のガイドカニューレを正確に両側へ配置するための座標を算出した後、両カニューレの挿入位置にある頭蓋骨に0.5 mmの穴をあけます。歯科用セメントを塗布する際にカニューレを固定するためのネジを挿入するため、それらの点の約5 mm上方および下方にさらに3か所の穴をあけます。次に、あらかじめaCSFを満たしておいたカテーターの一端をハサミで切断し、カニューレのアングルアームに挿入します。1本目のカニューレを歯科用セメントで固定します。2本目のカニューレを設置する位置に歯科用セメントが付着しないようにすることが極めて重要です。歯科用セメントを2〜3分間乾燥させた後、1本目のカニューレからホルダーアームを取り外し、切り揃えた2本目のカニューレをそこに装着します。2本目のカニューレを歯科用セメントで固定します。次に、両方のガイドカニューレにダミーカニューレを装着します。両方のカテーテルの自由端を、動物の肩甲骨間にあらかじめ作成しておいたポケットに挿入します。クランプを取り外し、4-0縫合糸で皮膚を縫合します。カニューレの周囲にさらにセメントを追加します。動物を脳定位固定装置から取り出し、清潔なケージ内のヒートパッドの上に置きます。動物が胸骨臥位を維持できる十分な意識を回復するまで、絶えず観察します。その後、動物を飼育室に戻し、厳重な監視下で10日間手術後の回復期間を設けます。 implantの一日前までに、製造元の指示に従い、浸透圧ポンプに6E10抗体またはコントロールIgG1抗体を充填します。ポンプを滅菌蒸留水に入れ、37 °Cで一晩保持してポンプを活性化させます。ラットを3% isofluraneで麻酔し、肩甲骨の間を剃毛した後、2% chlorhexidine gluconateおよび2% isopropyl alcohol溶液で皮膚を消毒します。メスを用いて肩甲骨の間に2 cmの切開を加え、ガイドカニューレに接続されたPE50カテーテルを確認します。次に、歯科用セメントが入ったPE50カテーテルの末端をメスで切断します。浸透圧ポンプをPE50カテーテルに接続し、接続部を固定するためにポンプとカテーテルの接合部に歯科用セメントを少量塗布します。最後に、4-0縫合糸で皮膚をきつく縫合します。動物を温熱パッドを敷いたケージに戻し、イソフルラン麻酔から覚醒するまで観察します。既報の通りにアミロイドベータオリゴマー溶液を調製した後、注入前に室温で1時間、溶液を動的かつ自発的に凝集させます。次に、各シリンジに5 µLの滅菌蒸留水を充填します。次に、メスを用いてPE50カテーテルを約60 cmの長さに2本切り出します。21ゲージの針を装着した1 mLシリンジ2本を使用し、両方のカテーテルに滅菌蒸留水を満たします。1 mLシリンジを各カテーテルの片端に装着したまま、もう一方の自由端をHamiltonシリンジに接続します。1 mLシリンジを取り外し、カテーテル内に気泡がないことを確認します。PE50カテーテルの末端に内部カニューレを挿入します。Hamiltonシリンジを用いて、各内部カニューレに1 µLまで充填し、その後ピストンを2 µLの目盛りまで引き戻して気泡を作ります。次に、低吸着チップを用いてピペッティングを行い、アミロイドβオリゴマー溶液を混合します。混合時に気泡が生じないように注意してください。その後、ピストンを3.5 µLまで引き戻し、両方の内部カニューレにアミロイドβオリゴマー溶液を1.5 µLずつ充填します。次に、両方のカテーテルの気泡の前後に印を付けます。これは、注入が継続しているかを確認するためのチェックポイントとなります。覚醒状態のラットをスナグルホールドで固定し、頭部を不動にします。2本のガイドカニューレからダミーカニューレを取り外し、あらかじめ準備しておいた内部カニューレをガイドカニューレに挿入します。内部カニューレが完全に挿入され、ガイドカニューレの底部にしっかりと固定されていることを確認してください。その後、ラットをスナグルホールドから放し、ハンドリングストレスを抑えるため、ケージに戻します。輸液ポンプの電源を入れ、アミロイドβオリゴマー溶液1 µLを0.1 µL/minの速度で注入します。注入中、シリンジのピストンが3.5 µLから2.5 µLまで移動すること、および両方のPE50カテーテル内の気泡が連続的に移動することを確認してください。また、ラットを確認し、カテーテル同士がねじれていないことを確かめます。アミロイドβオリゴマー溶液を効率的に拡散させるため、注入後さらに5分間、内部カニューレを留置したままにします。注入後、ラットをスナグルホールドに戻し、注入した溶液の逆流を防ぐために内部カニューレとキャップ付きガイドカニューレを取り除きます。ガイドカニューレの屈曲部の直前で止まるダミーカニューレを装着します。最後に、動物をケージに戻します。ここに示した結果は、注入部位に近い歯状回におけるアミロイドβオリゴマーの蓄積と、この蓄積に伴う細胞死を示しています。抗A-beta抗体を用いた免疫染色により、アミロイドβオリゴマーのレベルが6E10抗体処理によって大幅に減少したことが明らかになりました。Cresyl violet染色により、A-beta-Oの注入部位付近で顕著な神経脱落が観察され、6E10抗体による治療でこれが軽減されることが示されました。熟練すれば、適切に行うことでカニューレの留置は30分で完了します。浸透圧ポンプの設置には約10分、アミロイドβの注入には約15分かかります。この手順を行う際は、1本目のカニューレを挿入する際に、2本目のカニューレの挿入位置付近に歯科用セメントを塗布しないように注意することが重要です。また、ガイドカニューレに内部カニューレを挿入する前に、動物が落ち着くまで待ってください。このビデオを視聴することで、アミロイドβオリゴマーを注入し、免疫療法などのアルツハイマー病治療法をテストするための、カニューレおよび浸透圧ポンプの留置方法について十分に理解できるはずです。

neurodegeneration-an-animal-model-chronic-amyloid-beta-oligomer

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β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42まで</sub海馬スライスでのシナプス可塑性の減損の>と誘導

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Aβペプチド特異的抗体とAβオリゴマーのラット海馬への制御注入

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免疫標識およびクルクミン染色による脳組織切片のアミロイドβプラークのイメージング

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マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

アミロイドβ（Aβ）は、動物モデルが定義された量とAβ断片の種の管理を可能にし、各研究グループ内の個人差を低減-injected。このプロトコルは、正常マウスにおけるアルツハイマー様の行動異常の製造を可能にする、定位楽器なしでAβの脳室内（ICV）注射を説明しています。...

急性アルツハイマーなどの認知障害を誘発するために正常マウスにおけるアミロイドβペプチドの脳室内注射

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定量的3Dインシリコモデリング（q3DISM）

このプロトコルでは、体外で合成ペプチド a β オリゴマーを準備しドット解析をしみが付くことによって a β...

A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

このプロトコルは、細胞を固定化するアルギネートの急速な物理的ゲル化による細胞封入方法を示す。得られたマイクロビーズは、時間をかけてアミロイドβの制御および持続的な分泌を可能にし、インビトロおよびインビボモデルで分泌されたアミロイドβの効果を研究するために使用することができる。...

アルツハイマー病のモデリングに用いられるアミロイドβ分泌アルギン酸マイクロビーズの製造

学ぶアミロイドβオリゴマーによる神経毒性のメカニズムと、浸透圧ポンプを用いた抗体治療による神経保護効果を動物モデルで評価する方法。この技術はアルツハイマー病の新規治療法開発に貢献します。

慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

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