ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

本手順の全体的な目的は、蛍光標識されたクロマチンおよび細胞膜タンパク質を用い、高解像度共焦点顕微鏡でキャプチャすることで、生体ゼブラフィッシュ胚における有糸分裂中の染色体分離の忠実度をモニタリングすることです。この手法は、有糸分裂の欠損がどのようにして発生上の欠陥や、生体脊椎動物における腫瘍形成につながるのかといった、有糸分裂分野における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、生体脊椎動物において有糸分裂を観察できるため、生理学的に妥当なデータを収集できることです。

成体ゼブラフィッシュを交配させ、卵にH2A. F/Z-EGFPおよび/またはpCS2 mCherry-CAAX RNAを注入した後、イメージングの約2時間前に、蛍光解剖顕微鏡を用いてGFP陽性胚を特定します。鮮やかな緑色のGFP発現胚を、E3 blue培地を入れた新しい10×15 mmのペトリ皿に移します。

E3 blueにおける1%低融点アガロースのストック溶液を沸騰させる。融解したアガロース3 mLを17 × 10 mmの培養チューブに分注する。使用するまで、培養チューブを42 °Cのウォーターバスに入れてアガロースを保温しておく。

15 mMのトリカイン、スクリーニング済みの胚、低融点アガロース、E3 blue、35 mmガラスカバースリップ底培養ディッシュ、および解剖用光学顕微鏡を用意します。次に、5番ピンセットを用いて、3つの胚から慎重に卵膜を取り除き、麻酔をかけるために胚を別の容器に移します。その後、転送ピペットを用いて、胚と5 mLの培地が入ったディッシュに15 mMトリカインを3滴加えます。

1%の融解したアガロースが入ったチューブに、15 mMのトリカイン溶液を3〜4滴加します。胚が十分に麻酔されたら、先端を1 cmカットしたP20 Pipetmanを用いて、麻酔済みの胚をカバーガラス底ディッシュに移します。過剰なE3 blueトリカイン溶液は除去してください。

胚の上に低融点アガロース・トリカイン溶液を5〜10 µLずつゆっくりと滴下します。このとき、胚同士が接近して漂流しないよう、一滴ずつ離して滴下してください。次に、21ゲージの1.5インチ針を用いて、アガロース内の胚を慎重に目的の向きに調整します。倒立顕微鏡を使用する場合は、関心領域ができるだけカバーガラスに近づくように配置してください。位置がずれる可能性があるため、各胚に戻って、必要な位置に保持されているかを確認する必要がある場合があります。

アガロースが凝固する間に、理想的な位置になるまでこの操作を数回繰り返す必要がある場合があります。数分後、凝固したかどうかを確認するため、針を用いてアガロースの一部を少量壊してみます。滴から剥がれるようになったら、低融点アガロースを追加して、埋め込まれた胚の上にドーム状に盛り上げ、カバーガラス全体を覆います。

アガロースが凝固する間に、イメージング中に埋入した胚の上に滴下するための、15 mM トリカインを5滴加えたE3 blue培地を3 mL準備します。生存ゼブラフィッシュ胚の5D共焦点イメージングを行うには、イメージングソフトウェアを起動し、顕微鏡を60倍、開口数（NA）1.4の対物レンズに設定します。レンズに浸油を塗布し、顕微鏡ステージ上のスライドホルダーに培養皿を設置します。

軸コントローラーを使用して、目的の胚を対物レンズの中心に合わせ、レンズを上げて培養皿に接触させます。寒天に埋め込まれた胚の上に、E3 blueおよびトリカイン溶液を注ぎます。次に、アイポートアイコンをクリックして、接眼レンズを通して胚を観察します。

Eye Port選択を無効にし、[View]、[Acquisition Controls]、[A1 Scan Area]の順に選択して、A1 Scan Areaツールを開きます。GFPチャネルを選択してスキャンを再開し、カバーガラスに近い関心領域にフォーカスを合わせます。スキャンを停止し、GFPおよびmCherryチャネルを選択して、ライン平均化オプションを「normal」に設定します。

次に、[View]、[Acquisition Controls]、[ND Acquisition]を選択し、A1 ND Acquisitionツールを開きます。スキャンを開始してください。その後、軸コントローラーを使用して、スキャン領域に可能な限り多くのゼブラフィッシュが入るように胚を配置します。

Zスタックの上限を、細胞がフォーカスから外れる位置に設定します。この際、細胞の増殖や移動を考慮し、サンプルの上部に3 µmの余裕を持たせてください。次に、下限を細胞が見えなくなる位置に設定し、Z間隔のステップサイズを2 µmに設定します。本実験では、以下に示す通りに、イメージングレーザー出力、HVまたはゲイン、およびオフセットレベルをそれぞれ調整してください。

パラメータを設定したら、サンプルの光毒性や光退色を引き起こす可能性のある不要なレーザー曝露を防ぐため、スキャンを停止します。次に、最高の画質と最短のスキャン時間を実現する2Xラインアベレージングのアイコンを選択します。実験に必要な適切な時間間隔と時間を設定してください。

野生型の細胞分裂において、有糸分裂の期間を決定するには、2時間の間、2分間隔で撮影すれば十分です。ここで実証するように、紡錘体形成チェックポイントが30分以上にわたって活性化する分裂では、蛍光を維持するため、4時間の間、4〜5分間隔で撮影することがより適切です。取得中にファイルを自動的に保存するには、「ファイルに保存」ボックスにチェックを入れ、ファイル名を指定してください。

最後に、すべてのパラメータが正しく設定されているか再確認し、Run Nowをクリックします。取得完了後、ファイルを3次元形式で表示するには、Volume Thresholdアイコンをクリックしてください。この図は、AB野生型ゼブラフィッシュの尾部の広い視野を用いて、多くの細胞分裂を観察できることを示しています。

細胞分裂をアスタリスクで示しています。対応する動画をここに示します。平均して、ABでは50個の分裂細胞が、aurora B変異体では30個の分裂細胞が観察されました。

aurora B変異胚で撮影された有糸分裂細胞数が減少していることを考慮し、撮影された細胞数に対する有糸分裂細胞の割合を算出した。その結果、aurora B変異胚において有糸分裂を行う細胞数自体が少ないのではなく、撮影された総細胞数が少ないことが示唆された。有糸分裂の時間を定量化するため、1回の細胞分裂に要した時間間隔の数に、各Zスタック間の時間間隔を乗じた。このグラフに示されるように、平均分裂時間は、AB野生型で25分、aurora B変異体で58分であった。

野生型胚で観察されるように、各有糸分裂期を区別することができます。しかし、aurora B変異体胚では、有糸分裂の停止や細胞質分裂の不全などの有糸分裂欠損が観察され、その結果、二核細胞となり、続いて微小核が形成されます。これは、この変異体で測定された分裂時間の延長を裏付けるものです。この手法を習得すれば、胚のスクリーニングから共焦点顕微鏡のパラメータ設定まで、1時間で完了させることができます。

本手順を実施する際は、関心領域、時間経過、時間間隔、およびZ深度に関する実験の背景を十分に考慮することが重要です。これにより、効率を最大限に高めるとともに、光退色や光毒性を防ぐことができます。本手順に続き、観察された有糸分裂異常の原因についてさらなる疑問を解消するための染色体スプレッドなどの他手法を併用したり、薬剤処理を用いて有糸分裂の進行、持続時間、または細胞運命への影響を評価したりすることが可能です。

本技術の開発により、生物学分野の研究者がゼブラフィッシュを用いて、発生生物学および癌生物学の観点から有糸分裂を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュ胚の埋込方法、有糸分裂のライブイメージングの撮影方法、および有糸分裂の頻度、持続時間、細胞運命の解析方法について十分に理解することができます。高出力レーザーや蛍光光の使用は目に悪影響を及ぼす可能性があるため、本手順の実施中は、レーザーを直接視認しないなどの予防策を常に講じることを忘れないでください。