ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

この手順の全体的な目標は、蛍光標識されたクロマチンと、高解像度の共焦点顕微鏡を使用して捕捉される細胞膜タンパク質を使用して、生きたゼブラフィッシュの胚における有糸分裂中の染色体分配の忠実度を監視することです。この方法は、有糸分裂障害がどのようにして発生障害を引き起こしたり、生きた脊椎動物に腫瘍が形成されたりするのかなど、有糸分裂分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、生きた脊椎動物生物の有糸分裂を観察しているため、物理学的に関連性のあるデータを収集できることです。

成魚を繁殖させ、卵にH2Aを注入した後。F/Z-EGFP および/または pCS2 mCherry-CAAX RNA をイメージングの約 2 時間前に、蛍光解剖顕微鏡を使用して GFP 陽性胚を同定します。明るい緑色のGFP発現胚を、E3ブルー培地を用いた新しい100×15mmのシャーレに移します。

1%低融点アガロースの原液をE3ブルーで煮沸します。溶かしたアガロース3ミリリットルを17×100ミリメートルの培養チューブに分注します。使用する準備ができるまで、培養チューブを摂氏42度の水浴に入れて、アガロースを暖かく保ちます。

15ミリモルのトリカイン、スクリーニングされた胚、低融点のアガロース、E3ブルー、35ミリメートルのガラスカバースリップボトム培養皿、および解剖光学顕微鏡を収集します。次に、5番ピンセットで、3つの胚から絨毛膜を慎重に取り除き、胚を別の容器に入れて麻酔します。次に、トランスファーピペットを使用して、胚と5ミリリットルの培地が入った皿に15ミリモルのトリカインを3滴加えます。

15ミリモルトリカイン溶液を1%溶融したアガロースのチューブに3〜4滴加えます。.胚に十分な麻酔がかけられたら、P200 Pipetmanを使用して、ピペットの先端の1cmを切り取り、麻酔をかけた胚をカバースリップ底の皿に移します。余分なE3ブルートリカイン溶液をすべて取り除きます。.

胚の上に5〜10マイクロリットルの低融点-アガロース-トリカイン溶液をゆっくりと追加し、各滴を別々に保ち、胚が互いに近づかないようにします。次に、21ゲージの1.5針を使用して、アガロース中の胚を所望の位置に穏やかに向け、倒立顕微鏡を使用する場合は、関心領域をできるだけカバーガラスに近づけます。発生する可能性のあるシフトにより、各胚が必要な位置に留まることを確認するために、各胚に戻る必要がある場合があります。

これは、寒天が固化するにつれて理想的な位置が達成されるまで、複数回行う必要がある場合があります。数分後、セットされているかどうかをテストするために、針を使用してアガロースの小片をバラバラにします。液滴から引き離すことができる場合は、追加の低溶融アガロースを使用して、埋め込まれた胚の上にドームを形成し、カバーガラス全体を覆います。

アガロースが固化する間に、3ミリリットルのE3ブルーメディウムと5滴の15ミリモルトリカインを調製し、イメージング中に埋め込まれた胚の上に置きます。生きたゼブラフィッシュの胚の5D共焦点イメージングを行うには、イメージングソフトウェアを開き、顕微鏡を60倍開口1.4レンズに設定します。レンズに液浸油を塗布し、培養皿を顕微鏡ステージのスライドホルダーに置きます。

軸コントローラーを使用して、目的の胚を対物レンズの中央に配置し、培養皿に合うようにレンズを上げます。E3ブルー溶液とトリカイン溶液を寒天に包埋した胚に注ぎます。次に、アイポートアイコンをクリックして、接眼レンズを通して胚を表示します。

[Eye Port] の選択を無効にし、[View]、[Acquisition Controls]、[A1 Scan Area] の順に選択して [A1 Scan Area] ツールを開きます。GFPチャンネルを選択し、スキャンを再開して、カバースリップに近い関心領域に焦点を合わせます。スキャンを停止し、GFPチャネルとmCherryチャネルを選択し、ライン平均化オプションをnormalに設定します。

次に、[表示]、[取得コントロール]、[ND 取得] の順に選択して、A1 ND 取得ツールを開きます。スキャンを開始します。次に、軸コントローラーを使用して、スキャン領域ができるだけ多くのゼブラフィッシュで満たされるように胚を配置します。

Zスタックの上限を細胞の焦点が合っていない場所に設定し、サンプルの上に3マイクロメートルのスペースを追加して、成長と細胞移動を可能にします。次に、セルが見えなくなった場所に下限を設定し、Z 間隔のステップ サイズを 2 マイクロメートルに設定します。ここで示す実験では、イメージングレーザー出力、HVまたはゲイン、およびオフセットレベルをそれぞれ以下に示すように調整します。

パラメータを設定したら、サンプルの光毒性や光退色を引き起こす可能性のある不要なレーザー曝露を防ぐために、スキャンを停止します。次に、最高の画質と最速のスキャン時間を提供する2Xライン平均化アイコンを選択します。実験に必要な適切な時間間隔と時間を選択します。

野生型細胞分裂の場合、有糸分裂の持続時間を決定するには、2時間の時間間隔を2分で測定するのに適しています。スピンドルアセンブリチェックポイントを30分以上アクティブにする分割は、ここで示すように、蛍光を維持するために、4時間から5分の間隔で4時間行うのに適しています。取得中のファイルを自動的に保存するには、[ファイルに保存] チェック ボックスをオンにして、ファイルに名前を付けます。

最後に、すべてのパラメータが正しく設定されていることを再確認し、[今すぐ実行]をクリックします。取得が完了したら、ファイルを3次元形式で表示するには、ボリュームしきい値アイコンをクリックします。この図は、AB野生型ゼブラフィッシュの尾の広い視野を使用して多くの細胞分裂を観察する能力を示しています。

細胞分裂はアスタリスクで示されます。こちらは対応するムービーです。平均して、ABでは50個の分裂細胞が観察され、オーロラB変異体では30個の分裂細胞が観察されました。

オーロラB変異体胚で画像化された有糸分裂細胞の数が減少したことを説明するために、画像化された細胞数に対する有糸分裂細胞の比率が計算され、オーロラB変異体胚では有糸分裂を通過する細胞の数が少なくなっているのではなく、画像化される全細胞の数が少ないことが示唆されました。有糸分裂の持続時間を定量化するために、1つの細胞分裂を占める時間間隔の数に、各Zスタック間の時間間隔を掛けます。このグラフで明らかになったように、AB野生型の平均分裂時間は25分で、オーロラB変異体は58分です。

野生型胚に見られるように、各有糸分裂期を区別することができます。しかし、オーロラB変異体胚では、有糸分裂停止や細胞質分裂の提出など、有糸分裂の欠陥が観察され、その結果、二核細胞が形成され、その後の小核が形成され、この変異体で測定された分裂時間の増加を支えています。この手法を習得すれば、胚のスクリーニングから共焦点顕微鏡のパラメーターの設定まで、1時間で完了します。

この手順を試行する際には、関心のある領域、期間、時間間隔、Z 深度に関連する実験のコンテキストを覚えておくことが重要です。これにより、効率を最大化するだけでなく、光退色や光毒性を防ぐことができます。この手順に続いて、染色体スプレッドなどの他の方法を実行して、観察された有糸分裂障害の原因に関する追加の質問に答えたり、薬物治療を使用して有糸分裂の進行、期間、または細胞運命への影響を判断したりできます。

その開発後、この技術は、生物学の分野の研究者がゼブラフィッシュを使用して発生生物学と癌生物学の文脈で有糸分裂を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの胚を埋め込む方法、有糸分裂のライブイメージングの撮影方法、有糸分裂の頻度、持続時間、細胞運命の分析方法について十分に理解できるはずです。高出力レーザーや蛍光灯の使用は目に害を及ぼす可能性があるため、この手順を実行する際には、レーザーとの直接の目が触れないようにするなどの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。