Name: ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュ胚のライブイメージングによる有糸分裂ダイナミクス観察法。蛍光標識染色体と細胞膜タンパク質を用いて、染色体分配の正確性をモニタリングし、発生異常や腫瘍形成との関連を解明します。この手法は生理学的に関連性の高いデータ収集を可能にします。

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pCS2-H2A.F/Z-EGFPおよびpCS2-mCherry-CAAXベクトルを提供してくださったKristen Kwanに感謝します。ゼブラフィッシュのライブイメージングについて指導してくださったChris Rodeschに感謝します。Shawn Williams氏、Erik Malarkey氏、Brad Yoder氏には、UABの共焦点イメージングとUABの高解像度イメージング施設の支援に感謝します。高解像度イメージング施設は、UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant(P30CA013148)とRheumatic Disease Core Center(P30 AR048311)によってサポートされています。JMPは、国立神経疾患および脳卒中研究所(NIH R21 NS092105)の支援を受けており、米国がん協会(ACS IRG-60-001-53-IRG)およびUAB総合がんセンター(P30CA013148)からのパイロット助成金を受けています。S.M.P.は、Cell and Molecular Biology T32 Training Grant(5T32GM008111-28)の支援を受けています。

1. in vitro転写<ol><li>酵素31を消化NotI制限によってPCS2-H2A.F / Z-EGFPおよび/ ​​またはPCS2-mCherryを-CAAXベクトルを線形化。 インビトロ転写キットに RNAを用いて、製造業者のプロトコールに従って、各テンプレートから5 &#39;キャップされたmRNAの産物を生成します。 </li><li>精製キットを用いてキャップされたmRNAを精製します。製造元の指示に従ってください。 RNaseフリーのH 2 Oで溶出</li><li>分光光度計を用いて260 nmの吸光度によってRNAの濃度を決定します。 （OD 260のx希釈×40 / mlの）。 </li><li>各H2A.F / Z-EGFPおよびRNaseフリーH 2 OでmCherryを-CAAXのためμL/ 100 ngのにRNAの希釈RNAの濃度が低すぎると、蛍光が減少または存在しないことになります。明るいサンプルは、光毒性および光退色に対する懸念を軽減します。一方、あまりにも多くのRNAは有毒であることおよび/またはオフターゲット効果を引き起こす可能性があります。 注：残りの保管-80℃の冷凍庫で精製したmRNA。 </li></ol> 2.ゼブラフィッシュの繁殖、胚コレクション、およびmRNA注入36-38 <ol><li>二つの領域にタンクを分離し、ゼブラフィッシュの施設で使用される養殖システムの水でそれぞれ飼育タンクを埋めるために障壁と繁殖タンクを組み立てます。 </li><li>不時の繁殖を防ぐために、飼育前夜反対側の障壁と二人の女性の魚の片側に2男性の魚を置きます。 </li><li>翌日、氷の上に先に調製したmRNA混合物を解凍。新鮮な養殖システムの水で飼育水槽内の水を交換し、障壁を取り除きます。障壁が引っ張られた直後、28.5°Cに射出成形金型を温め、マイクロインジェクションのための機器を設定します。 注：射出成形金型については、ゲルラッハ36を参照してください。 </li><li>茶こしを使って15分とEとのきれいな100×15ミリメートルペトリ皿に卵をすすぐ - 卵ごとに10を収集3ブルー（5のNaCl、0.17のKCl、0.33mMのCaCl 2を、0.33 mMのMgSO 4を、10 -5％メチレンブルー）。 E3ブルーは、真菌の増殖を防止し、仔魚の適切な発展を確実にするために使用されます。交配と胚コレクションの詳細については、ゲルラッハ36とPorazinkski 37を参照してください。 </li><li>埋め込 ​​み1セルは、温めた射出成形金型に胚を上演し、胚の所望の量（ 図1A）に卵黄の中にRNAを注入します。実験に必要とされるよりも15％以上の胚の胚性注射を行うことで、自然胚の死と未受精胚のためのアカウント。ゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクションに関する詳細については、ゲルラッハ36とPorazinkski 37を参照してください。 注：mRNAの初めての使用のためには、前5D撮影を行うには（5 DPFまで肉眼発達障害と定義される）蛍光および生存のために最適な用量を決定するために、用量曲線分析を行います。 150から200 ngの/μlの胚に注入は、したがって、それは最終濃度ための良い出発点であり、多くの場合、最適な濃度です。 </li><li>慎重に修正された9「ガラスパスツールピペットを用いて、金型から注入された胚を抽出します。ピペットを変更するには、それがボールを形成するまでブンゼンバーナーを使用して、エンドを溶かします。 </li><li> 100×15ミリメートルのペトリE3ブルーディッシュと28.5℃のインキュベーターに家に注入された胚を置きます。 </li><li>六時間の注射後、プレートから任意の死亡または未受精胚を削除し、クリーンE3ブ​​ルーを追加します。 28.5℃でのハウスは、胚。 </li></ol> 3.イメージングのためのライブゼブラフィッシュ胚（図1B）の調製と埋め込み<ol><li>撮影前の2時間は、蛍光解剖顕微鏡を用いてGFPのための注入された胚を選別します。 E3ブルーと新しい100×15ミリメートルペトリ皿に明るい緑色のGFP発現胚を置きます。 </li><li>アガロースE3ブルー100mlに低融点1gを添加することによって、1％低融点アガロースのストック溶液を沸騰。アガロースを使用した後、アルミホイルでフラスコを覆います。原液は、1ヶ月までのために有用なままです。 </li><li> 17×100mmの培養チューブに小分けした溶融寒天の3ミリリットルを。使用するまで42℃の水浴中で培養管を配置することによって、アガロースを暖かく保ちます。ゼブラフィッシュ胚36を麻酔するために、脱イオン水で15 mMのトリカイン溶液を調製します。 注：以前の時点で撮像が望まれる場合、寒天の濃度は0.3％39限り低く低下させることができます。 </li><li> 15 mMのトリカイン、スクリーニングの胚、低融点アガロース、E3ブルー、および解剖光顕微鏡に35ミリメートルのカバーガラス底の培養皿を持参してください。慎重に＃5ピンセットで胚の絨毛膜を除去します。 3胚のためにこれを行います。 </li><li>麻酔する別の容器にdechorionated胚を置きます。カバーガラスボトムディッシュの蓋は、多くの場合、この目的のために使用されます。トランスファーピペットを用いて、3滴（約150μl）を追加15 mMのトリカインの5ミリリットルE3青（カバーガラスボトムディッシュの蓋を使用している場合）または胚が十分に麻酔をかけてきたまでの一品に。 1％溶融アガロースチューブに15 mMのトリカイン溶液を - （200μlの約150）また、3-4滴を追加します。 </li><li>カットオフピペットチップから1cmとP200のピペットを用いて、カバーガラス底皿に麻酔胚を移します。余分なE3ブルーを削除：トリカインソリューション。 </li><li>胚が誤ってお互いに近いドリフトしないことを保証するために別々の各ドロップを保ち、胚を超えるトリカインソリューション：低融点アガロース10μlの - ゆっくりと5を追加します。 警告：アガロースがあまりにも暖かくている場合、それは胚を損傷します。寒天を維持するために良好な温度は42℃です。 </li><li> 21 G 1½針を使用して、静かに所望の位置にアガロースで胚を向けます。タイムラプスイメージングのための倒立顕微鏡を使用する場合、possibなどのカバーガラスに近い関心領域（ROI）を配向ル。 注意：一般的な目的のために、テール領域が比較的薄い組織（ 図1A）に配向し、明確化のしやすさを提供しています。そのような卵黄フィン折り目を囲む上皮層などの他の組織は、28,29を使用することができます。これらの組織は、しかし、これらの領域がわずか数細胞層の厚さ、偉大な明快さを提供しています。このプロトコルのためには、できるだけ多くの細胞分裂を取得するテール領域画像に有益です。 </li><li>寒天の部分凝固のためのいくつかの分を許可します。その凝固をテストするために、寒天の小片を分割するために針を使用してください。寒天の片が落下から引き離すことができた場合、次のステップに進みます。 </li><li>低融点寒天が埋め込まれた胚の上にドームを形成すると全体カバースリップをカバーしています。寒天は、共焦点画像（ 図1A）のための皿を移動する前に固化することを可能にします。 </li><li>寒天凝固過程（約10分かかります）中に3mlのO調製（約250μl）を15 mMのトリカインの5滴とF E3ブルー溶液は、撮像中に埋め込まれた胚の上に配置されます。 </li></ol>ライブゼブラフィッシュ胚40,41の4 5D共焦点イメージング注：他の共焦点システムを使用して5D撮影を行う方法の詳細については有賀40とオブライエン41を参照してください。 Z-intervalには、Zスタック、Z深度、時間間隔、および5Dの定義は、 図1Cを参照してください。 <ol><li>イメージングソフトウェアを開き、60X NA 1.4対物レンズに顕微鏡を設定します。対物レンズにイマージョンオイルを塗布し、顕微鏡ステージ上にスライドホルダーに培養皿を置きます。軸コントローラを使用して、対物レンズの上に興味のある胚を中心と培養皿を満たすために上向きの対物レンズをもたらします。 </li><li>アイピースのアイコンをクリックして、顕微鏡でGFPフィルターに切り替えます。 ROIに焦点を当てています。 Oカバーガラスに最も近い組織になります着目最良の撮像結果ffer。 </li><li>インターロックを外します。 （ソフトウェアで予め設定された波長）GFPとmCherryをチャンネルを選択し、通常のオプションを平均ラインを設定します。 </li><li> A1スキャン領域のツールを開くには、「表示/取得コントロール/ A1スキャン領域」コマンドを使用します。 </li><li>スキャンを開始します。スキャン領域を可能なゼブラフィッシュの限りで満たされているように、軸コントローラを使用して、胚を置きます。レーザー出力は、この時点で最適である必要はありません。不要な光退色を避けるために、レーザーパワーを下げます。 </li><li> ND取得コントロールパネルを開くには、「表示/取得コントロール/ ND取得」コマンドを使用します。 </li><li> Z-スタックパラメータを設定するためにスキャンを開始します。細胞は、もはや表示されている場所へのZ-スタックセルにフォーカスがないどこに上限値と下限値を設定します。イメージング分野に拡張してもよい成長と細胞運動のためのサンプル上記3μmの空間を可能にします。このプロに示す数値のためのZスタックトコールは、胚の尾部に40ミクロ​​ンのZ深さをカバーしました。 </li><li> 2μmのZ-間隔のステップサイズを設定します。平均すると、細胞は直径が10μmです。したがって、2μmの各セルのために分析されるイメージングデータの5区間を生成します。 注：取得することができる画像の深さはZ間隔に依存します。 Zの解像度が可能（大Z-深さ）などの有糸分裂を受けて、多くの細胞として画像化するためにZ次元での全体的な深さを得るために犠牲にされています。逆が真であるZ深さを（小Z深度）犠牲にしながら、その中に、ステップサイズを小さくすることにより、Z分解能が得られます。 </li><li>画像レーザパワー、HVを調整し、レベルを相殺しました。このプロトコルで実証実験のために、以下のレーザーパワー、HVを使用し、GFPチャネルに対して、それぞれ、対応するレベルで設定レベルをオフセット。 5、120 - - 2 140、および-11 -9。 mCherryをチャネルに対して、それぞれ、次のレーザパワー、HVを使用して、レベルをオフセット。 3から6、120から140、および-3へ-8。パラメータを設定したら、サンプルの光毒性および光退色を引き起こす可能性があり、不必要なレーザー露光を防止するためにスキャンを遮断してください。 </li><li> 2倍のライン平均のアイコンを選択します。 「いいえ、平均は「大幅に」平均4倍のラインが「スキャン時間を増加させながら、粒子の粗い画像を生成しません。 2倍のライン平均を使用すると、最高の画質と最速のスキャン時間を提供します。 </li><li>実験のために必要な適切な時間間隔と持続時間を選択します。野生型分割のために、2時間2分の時間間隔は、（ 図1、図2、図3A、および図3Bにおいて使用される）、有糸分裂の持続時間を決定するのが最良です。より長い30分間紡錘体チェックポイントを活性化部門は、図3Cに示されているように、蛍光を維持するために4つの時間、5分間隔のために適しています。 </li><li> 「ファイルに保存」ボックスをチェックし、それが取得されているときに自動的にファイルを保存するファイルに名前を付けます。すべてのPAダブルチェックラメータが正しく設定され、「実行を開始「ヒットしています。 </li><li>買収は、3次元形式でファイルを表示するには、完了すると、ボリュームのしきい値アイコンをクリックしてください。 </li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

この方法を使用すると、1が生体内および時間依存的に二つの新しい細胞を形成するために核エンベロープの崩壊、微小管動原体の添付ファイルによって中期板の形成、及び姉妹染色分の分離を推測することができます。細胞は天然の生理学で撮像されているので、ゼブラフィッシュで有糸分裂を観察する能力は、固定サンプル、細胞培養系に比べて有利であり、組織は、使用する蛍光タンパク質を可能にする透明であり、それらが比較的速く開発し、タイムラプスイメージング取得することができます。このプロトコルのための大人のゼブラフィッシュの使用は、皮膚や目ではない厚い組織のために取得することができる限られたZ-深さに制限されています。 H2A.F / Z-EGFPおよびmCherryを-CAAXを発現するトランスジェニック動物は、同じ目的のために使用することができるが、異なる変異体ゼブラフィッシュへのmRNAの注入の汎用性と使いやすさは、遺伝的交雑よりも有利です。有糸分裂の分析である状況で3日後に受精（DPF）以降の胚に必要な、トランスジェニック動物が原因で、この急速に発展する生物におけるRNAの半減期に必要であろう。 <p class="jove_con...

有糸分裂は、生体内の増殖、分化、および再生のための重要な細胞プロセスに不可欠です。正確な準備と間期におけるDNAの複製の際に、細胞は分裂するプライミングされます。有糸分裂の第一期、前期は、サイクリンB / Cdk1のの活性化によって開始されます。前期は、染色体にクロマチン材料の凝縮によって特徴付けられます。核膜の内訳は、前期と中期の間の遷移で発生します。前中期では、中心体は、紡錘体形成のための核形成中心は、動原体の添付ファイルの検索で微小管を拡張しながら反対の極に移行し始めます。取り付け時には、変換は微小管の添付ファイルを-終了すると張力は、中期板1を形成する染色体を向けます。すべての染色体が正しく接続されている場合、スピンドルアセンブリチェックポイントが満たされ、一緒に姉妹染色を保持コヒーシン環が切断され、および微小管は妹を引っ張って短くされています後期2,3の間に反対の極にクロマチド。最終段階、終期は、二つの新しい核の周りに核膜のセルと改革の伸長を伴います。細胞質分裂は、2つの新しい娘細胞4-6の細胞質を分離することにより、分割プロセスを完了します。キー有糸分裂経路（ すなわち、紡錘体形成チェックポイント、中心体の複製、姉妹染色分体の接着など ）の変更は、中期停止、染色体のmissegregation、およびゲノム不安定性7-10をもたらすことができます。最終的には、有糸分裂を制御する経路における欠陥は、有糸分裂およびライブでの欠陥、脊椎動物、多細胞生物10-16の可視化を必要と、発達障害やがんを引き起こす可能性があります。 ゼブラフィッシュの胚は透明な組織、マイクロインジェクションの容易さ、および迅速な開発によるライブイメージングのための偉大なモデル生物としての役割を果たす。ゼブラフィッシュを用いて、この原稿の全体的な目標はにありますライブ5D有糸分裂17（ 図1C）の（寸法X、Y、Z、時間、及び波長）イメージングの方法を記載します。別の有糸分裂経路における欠損変異体ゼブラフィッシュの使用は、このような欠陥の結果を示しています。このプロトコルについては、オーロラBおよびEsco2変異体は、これらの欠陥を説明するために選択しました。オーロラBは、紡錘体形成と微小管の添付ファイルに関わる染色体パッセンジャー複合体（CPC）の一部であるキナーゼです。また、細胞質分裂18,19内の分裂溝の形成のために必要とされます。ゼブラフィッシュでは、オーロラBの欠乏は畝間誘導、細胞質分裂、および染色体分離20の欠陥につながります。 Esco2は、他の一方で、姉妹染色分体凝集21,22のために不可欠であるアセチルトランスフェラーゼです。したがって、中期、後期の遷移23で適切な染色体分離を確保するために、コヒーシンの安定化リングのSMC3部にコヒーシンをアセチル化。ゼブラフィッシュにおけるEsco2の損失をCHにつながりますromosome missegregation、早期の姉妹染色分体の分離、ゲノム不安定性、およびp53依存性および非依存性アポトーシス24,25。在庫状況により、 オーロラの hi1045、およびhi2865変異ゼブラフィッシュをesco2に（以下、それぞれ、aurB メートル/メートルと呼ばれ、esco2 m / m）のこの手法25-27を説明するために使用されます。 蛍光タグ付き細胞機構とのカップリング共焦点顕微鏡は、有糸分裂25,28,29の間にクロマチンと細胞膜動態を可視化する研究を可能にしました。蛍光タグ化ヒストンは、歴史的にクロマチンを可視化するために使用されてきました。ヒストンは、染色体30を構成するヌクレオソーム構造を担当している4異なる対（H2A、H2B、H3、およびH4）からなる核タンパク質です。 H2Bは間違いなく中の蛍光タンパク質のための最も使用されるヒストンですがマウスおよび細胞培養、ヒストン2Aの使用、家族Z（H2A.F / Z）はゼブラフィッシュ31,32で使用するために十分であることが判明しました。コンカナバリンA及びカゼインキナーゼ、例えば、1-γは、細胞膜に局在し、以前にウニとショウジョウバエ33,34に細胞膜を可視化するのに有効なことが示されています。他の研究では、CAAX蛍光標識タンパク質が細胞膜を標識することが示されており、ゼブラフィッシュ31に成功したしました。 CAAXは、farnesyltransferasesやgeranylgeranyltransferasesなどの翻訳後修飾酵素によって認識されるモチーフです。これらの酵素による修飾は、タンパク質は、このように細胞膜35を標識する 、膜結合になることが。 ゼブラフィッシュでの使用前に、このプロトコルは、クロマチンと細胞膜を標識するためにH2A.F / ZとCAAXを使用することにしました。この方法の適用は、個々の染色体を観察するために、研究者は、個々の細胞レベルで有糸分裂を監視することができますダイナミクスは、だけでなく、同​​時に組織分化と発達に影響を与える可能性のある複数の細胞分裂を監視します。この記事では、個々の細胞レベルでの有糸分裂の際に染色体の分離のダイナミクスを画像化に焦点を当てます。この原稿の中に、いくつかの有糸分裂を観察する分割時間を計算し、有糸分裂の表現型を解読する能力が示され、説明されます。これらのパラメータを用いて、生理学的に関連するデータを収集することができ、有糸分裂の欠陥の影響を受け、いくつかの疾患状態に適用されます。

<table><tbody><tr><td>pCS2ベクター</td><td>K. Kwan</td><td></td>からの贈り物 <td>目的のプラスミド用</td></tr><tr><td>NotI-HF制限酵素</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>プラスミドの制限消化用</td></tr><tr><td>mMessage SP6キット</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>in vitro転写用</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>mRNAの精製用</td></tr><tr><td>100 x 15mm ペトリ皿</td><td>フィッシャー科学</td><td>FB0875712</td><td>胚を収容するため</td></tr><tr><td>マイクロインジェクション金型</td><td>自家製</td><td></td><td>マイクロインジェクション中に胚を保持するため</td></tr><tr><td>アガロース II</td><td>アムレスコ</td><td>0815-25G</td><td>胚の埋め込み用</td></tr><tr><td>トリカイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>胚の麻酔用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>UltraPure H2O 塩化カリウムに溶解した胚水(E3 Blue</td></tr>)<tr><td></td><td></td><td></td><td>の場合 UltraPure H2O</td></tr> 塩化<tr><td>カルシウム二水和物</td><td></td><td></td>に溶解した胚水(<td>E3 Blue)の場合、UltraPure H2</td></tr>O <tr>Magnesium<td>Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506に溶解した胚水(E3 Blue)の場合</td><td>胚水(E3ブルー)用、UltraPure H2O</td></tr><tr><td>メチレンブルーハイドレート</td>に溶解 <td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>胚水(E3ブルー)用、UltraPure H2O</td></tr><tr><td>100 mm培養チューブ</td><td>に溶解 フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-819-812</td><td>溶融寒天用</td></tr><tr><td>35 mmガラスカバースリップ底培養皿&nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&nbsp;</td><td>No.0 20 mmガラス 胚埋め込み用</td></tr><tr><td>#5ピンセット</td><td>デュモン</td><td>72701-D</td><td>胚の解剖用</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2ゲージ針</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>305167</td><td>寒天に胚を配置するため</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコンAZ100</td><td></td><td>胚のスクリーニングと埋め込みのために、どの解剖スコープでも共</td></tr><tr><td>焦点顕微鏡</td>を行います <td>ニコンA1+</td><td></td><td>タイムラプスイメージング用</td></tr><tr><td>共焦点ソフトウェア</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>画像の取得と処理用</td></tr></tbody></table>

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

有糸分裂は、生物の増殖および分化に重要です。プロセスは非常に動的であり、短い時間枠内で適切なクロマチン凝縮、微小管動原体結合、染色体分離、および細胞質分裂を達成するために、イベントを命じする必要があります。繊細なプロセスのエラーは、出生異常や癌を含む、ヒトの疾患につながることができます。ヒトの有糸分裂の疾患状態を調査する従来のアプローチは、多くの場合、ヒトの疾患を研究する自然な生理機能および有利な発達/組織特異的な文脈を欠いている細胞培養系に依存しています。このプロトコルは、高解像度、脊椎動物のシステムにおける染色体ダイナミクス、ゼブラフィッシュで、視覚化する方法を提供することで、多くの障害を克服します。このプロトコルの詳細が含ま分裂細胞の動的な画像得るために使用することができるのアプローチは以下となります。in vitro転写、ゼブラフィッシュの繁殖/収集、胚の埋め込 ​​み、およびタイムラプスイメージングを。最適化とMODIFこのプロトコルのicationsも模索されています。 H2A.F / Z-EGFP（ラベルのクロマチン）を使用し、mCherryを-CAAX（ラベルの細胞膜）のmRNAを注入した胚、AB野生型で有糸分裂、 オーロラの hi1045、およびesco2の hi2865変異体ゼブラフィッシュが可視化されます。ゼブラフィッシュにおける高解像度のライブイメージングは​​1つが統計的に有糸分裂欠陥や有糸分裂進行のタイミングを定量化するために、複数の有糸分裂を観察することができます。また、不適切な（ すなわち、会合欠損、染色体のmissegregation、 等 ）有糸分裂プロセス及び不適切な染色体結果（ すなわち、異数性、倍数性、小核、 等）を定義質的側面 ​​の観察が観察されます。このアッセイは、組織分化/開発の観測に適用され、変異体ゼブラフィッシュ及び薬理学的薬剤の使用に適していることができます。有糸分裂の欠陥が癌や発達障害になります大幅につながる方法の可視化疾患の病因の理解を高めます。

図2は、AB、野生型ゼブラフィッシュテールの広視野ビューを使用して、多くの細胞分裂を観察する能力を示しています。 7上の有糸分裂細胞は、14分間の時間枠（ 動画1）に結像されます。 2時間の時間経過の中で、40以上の有糸分裂のイベントが捕捉しました。平均して、50分裂する細胞は、ABとAUR BはM / m個の胚（ 図2B）で30分裂細胞で観察されました。撮像された細胞の数を考慮して、撮像された細胞の数に有糸分裂細胞の割合は、（ 図2C）を算出しました。このデータは、AURのB / M胚において有糸分裂を通過する細胞のより低い数（ 図2B）が、撮像される細胞の少ない数が存在しないことを示唆しています。このようなイベントの統計的に有意な数を取得する能力は、統計的検出力に役立ちます。 ...

有糸分裂はすべての生物にとって重要であり、欠陥はしばしば癌や発達障害を引き起こします。このイメージングプロトコルとゼブラフィッシュをモデルシステムとして使用することで、研究者は生きた脊椎動物の有糸分裂と、有糸分裂プロセスに欠陥がある場合に生じる多数の欠陥を視覚化することができます。

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

本手順の全体的な目的は、蛍光標識されたクロマチンおよび細胞膜タンパク質を用い、高解像度共焦点顕微鏡でキャプチャすることで、生体ゼブラフィッシュ胚における有糸分裂中の染色体分離の忠実度をモニタリングすることです。この手法は、有糸分裂の欠損がどのようにして発生上の欠陥や、生体脊椎動物における腫瘍形成につながるのかといった、有糸分裂分野における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、生体脊椎動物において有糸分裂を観察できるため、生理学的に妥当なデータを収集できることです。成体ゼブラフィッシュを交配させ、卵にH2A. F/Z-EGFPおよび/またはpCS2 mCherry-CAAX RNAを注入した後、イメージングの約2時間前に、蛍光解剖顕微鏡を用いてGFP陽性胚を特定します。鮮やかな緑色のGFP発現胚を、E3 blue培地を入れた新しい10×15 mmのペトリ皿に移します。E3 blueにおける1%低融点アガロースのストック溶液を沸騰させる。融解したアガロース3 mLを17 × 10 mmの培養チューブに分注する。使用するまで、培養チューブを42 °Cのウォーターバスに入れてアガロースを保温しておく。15 mMのトリカイン、スクリーニング済みの胚、低融点アガロース、E3 blue、35 mmガラスカバースリップ底培養ディッシュ、および解剖用光学顕微鏡を用意します。次に、5番ピンセットを用いて、3つの胚から慎重に卵膜を取り除き、麻酔をかけるために胚を別の容器に移します。その後、転送ピペットを用いて、胚と5 mLの培地が入ったディッシュに15 mMトリカインを3滴加えます。1%の融解したアガロースが入ったチューブに、15 mMのトリカイン溶液を3〜4滴加します。胚が十分に麻酔されたら、先端を1 cmカットしたP20 Pipetmanを用いて、麻酔済みの胚をカバーガラス底ディッシュに移します。過剰なE3 blueトリカイン溶液は除去してください。胚の上に低融点アガロース・トリカイン溶液を5〜10 µLずつゆっくりと滴下します。このとき、胚同士が接近して漂流しないよう、一滴ずつ離して滴下してください。次に、21ゲージの1.5インチ針を用いて、アガロース内の胚を慎重に目的の向きに調整します。倒立顕微鏡を使用する場合は、関心領域ができるだけカバーガラスに近づくように配置してください。位置がずれる可能性があるため、各胚に戻って、必要な位置に保持されているかを確認する必要がある場合があります。アガロースが凝固する間に、理想的な位置になるまでこの操作を数回繰り返す必要がある場合があります。数分後、凝固したかどうかを確認するため、針を用いてアガロースの一部を少量壊してみます。滴から剥がれるようになったら、低融点アガロースを追加して、埋め込まれた胚の上にドーム状に盛り上げ、カバーガラス全体を覆います。アガロースが凝固する間に、イメージング中に埋入した胚の上に滴下するための、15 mM トリカインを5滴加えたE3 blue培地を3 mL準備します。生存ゼブラフィッシュ胚の5D共焦点イメージングを行うには、イメージングソフトウェアを起動し、顕微鏡を60倍、開口数（NA）1.4の対物レンズに設定します。レンズに浸油を塗布し、顕微鏡ステージ上のスライドホルダーに培養皿を設置します。軸コントローラーを使用して、目的の胚を対物レンズの中心に合わせ、レンズを上げて培養皿に接触させます。寒天に埋め込まれた胚の上に、E3 blueおよびトリカイン溶液を注ぎます。次に、アイポートアイコンをクリックして、接眼レンズを通して胚を観察します。Eye Port選択を無効にし、[View]、[Acquisition Controls]、[A1 Scan Area]の順に選択して、A1 Scan Areaツールを開きます。GFPチャネルを選択してスキャンを再開し、カバーガラスに近い関心領域にフォーカスを合わせます。スキャンを停止し、GFPおよびmCherryチャネルを選択して、ライン平均化オプションを「normal」に設定します。次に、[View]、[Acquisition Controls]、[ND Acquisition]を選択し、A1 ND Acquisitionツールを開きます。スキャンを開始してください。その後、軸コントローラーを使用して、スキャン領域に可能な限り多くのゼブラフィッシュが入るように胚を配置します。Zスタックの上限を、細胞がフォーカスから外れる位置に設定します。この際、細胞の増殖や移動を考慮し、サンプルの上部に3 µmの余裕を持たせてください。次に、下限を細胞が見えなくなる位置に設定し、Z間隔のステップサイズを2 µmに設定します。本実験では、以下に示す通りに、イメージングレーザー出力、HVまたはゲイン、およびオフセットレベルをそれぞれ調整してください。パラメータを設定したら、サンプルの光毒性や光退色を引き起こす可能性のある不要なレーザー曝露を防ぐため、スキャンを停止します。次に、最高の画質と最短のスキャン時間を実現する2Xラインアベレージングのアイコンを選択します。実験に必要な適切な時間間隔と時間を設定してください。野生型の細胞分裂において、有糸分裂の期間を決定するには、2時間の間、2分間隔で撮影すれば十分です。ここで実証するように、紡錘体形成チェックポイントが30分以上にわたって活性化する分裂では、蛍光を維持するため、4時間の間、4〜5分間隔で撮影することがより適切です。取得中にファイルを自動的に保存するには、「ファイルに保存」ボックスにチェックを入れ、ファイル名を指定してください。最後に、すべてのパラメータが正しく設定されているか再確認し、Run Nowをクリックします。取得完了後、ファイルを3次元形式で表示するには、Volume Thresholdアイコンをクリックしてください。この図は、AB野生型ゼブラフィッシュの尾部の広い視野を用いて、多くの細胞分裂を観察できることを示しています。細胞分裂をアスタリスクで示しています。対応する動画をここに示します。平均して、ABでは50個の分裂細胞が、aurora B変異体では30個の分裂細胞が観察されました。aurora B変異胚で撮影された有糸分裂細胞数が減少していることを考慮し、撮影された細胞数に対する有糸分裂細胞の割合を算出した。その結果、aurora B変異胚において有糸分裂を行う細胞数自体が少ないのではなく、撮影された総細胞数が少ないことが示唆された。有糸分裂の時間を定量化するため、1回の細胞分裂に要した時間間隔の数に、各Zスタック間の時間間隔を乗じた。このグラフに示されるように、平均分裂時間は、AB野生型で25分、aurora B変異体で58分であった。野生型胚で観察されるように、各有糸分裂期を区別することができます。しかし、aurora B変異体胚では、有糸分裂の停止や細胞質分裂の不全などの有糸分裂欠損が観察され、その結果、二核細胞となり、続いて微小核が形成されます。これは、この変異体で測定された分裂時間の延長を裏付けるものです。この手法を習得すれば、胚のスクリーニングから共焦点顕微鏡のパラメータ設定まで、1時間で完了させることができます。本手順を実施する際は、関心領域、時間経過、時間間隔、およびZ深度に関する実験の背景を十分に考慮することが重要です。これにより、効率を最大限に高めるとともに、光退色や光毒性を防ぐことができます。本手順に続き、観察された有糸分裂異常の原因についてさらなる疑問を解消するための染色体スプレッドなどの他手法を併用したり、薬剤処理を用いて有糸分裂の進行、持続時間、または細胞運命への影響を評価したりすることが可能です。本技術の開発により、生物学分野の研究者がゼブラフィッシュを用いて、発生生物学および癌生物学の観点から有糸分裂を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュ胚の埋込方法、有糸分裂のライブイメージングの撮影方法、および有糸分裂の頻度、持続時間、細胞運命の解析方法について十分に理解することができます。高出力レーザーや蛍光光の使用は目に悪影響を及ぼす可能性があるため、本手順の実施中は、レーザーを直接視認しないなどの予防策を常に講じることを忘れないでください。

observing-mitotic-division-and-dynamics-in-a-live-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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