Name: ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶヒト骨髄からMesangiogenic前駆細胞（MPC）を単離する方法。選択的培養条件により高収率で再現性のある単離が可能で、MSC様細胞の分化能と血管新生能を評価します。再生医療研究への応用に有用です。

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著者は、特に骨髄サンプルと人間の骨前駆細胞の彼の専門知識を提供するための、ピサの大学、博士パオロ・パーチ、外科、医療・分子病理学とクリティカルケア医学の部門に感謝したいと思います

注：書面による同意後、HBMサンプルは人工股関節置換のための整形外科手術中に得られました。直ちに大腿骨頚部骨切り術の後にヘパリンの500 UIを含む20 mlシリンジをリーマ大腿前に、新鮮なBMを吸引するために使用されました。プロトコルは、任意のBM源に広く適用可能と考えられるべきです。 ヒト骨髄単核細胞（HBM-多国籍企業）の1の単離<ol><li>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）を適用し、50ミリリットルに新鮮なBMの10ミリリットル、反転により混合する - 5を希釈します。同様に、二つの新しい50mlコニカルチューブに25ミリリットルを配布し、各チューブにD-PBSの25ミリリットルを追加し、反転により混合します。 </li><li>管は、溶液からの鉱物骨片と脂肪の分離のために、室温で10分間放置します。 </li><li>慎重に滅菌パスツールピペットで浮遊脂肪を除去し、ミネラル骨片ペレットを乱すことなく、70μmのフィルターを通して細胞懸濁液をフィルタリングします。 </li> &lt;リー&gt;は不連続密度勾配遠心分離のための培地を15ml（1.077グラム/ ml）を用いて4 50mlチューブを設定します。この媒体は、室温であることを確認します。 </li><li>密度勾配媒体の上に希釈されたBMの25ミリリットル - 静かに20を置きます。層の混合を防止するために、チューブ壁に細胞懸濁液のトリクルをさせる、慎重にこの操作を実行します。 </li><li>無効ブレーキを室温で30分間、400×gでの密度勾配遠心分離を行います。 </li><li>滅菌パスツールピペットを使用して、2つの相の間に位置する細胞の白っぽいリングを収集し、新しい50 mlチューブに移します。 </li><li>新鮮な培養培地で細胞を洗浄する：フェノールレッドを含まない、低グルコース（1,000mgの/ l）のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％（v / v）のプールしたヒトAB型血清（PhABS）、2mMのL-グルタミンおよび抗生物質（DMEM / 10％PhABS）。 5分間400×gで遠心分離します。 </li><li>新鮮なDMEM / 10％PhABSの10ミリリットル - 5で上清を吸引し、再サスペンドペレット。 </li><li>細胞数に進んでください。トリパンで1希釈：1で白血球の数を決定します。血球計数器にこれを適用し、位相差顕微鏡下で観察します。細胞数から小さく、完全に丸みを帯びた赤血球およびブルー染色死細胞を除外します。 注：非常MPC回復でのパフォーマンスのためPhABSバッチをスクリーニングすることをお勧めします。異なる起源のほとんどの血清がMSC様細胞の割合が高いとMPCの文化をもたらした米国源からPhABSは、最良の結果を与えています。 </li></ol> HBM-多国籍企業からのMPCの2の単離<ol><li>新鮮なDMEM / 10％PhABS 15mlで疎水性のT-75フラスコを設定し、pH及び温度を30分間、5％CO 2中37℃でプレインキュベートすることにより平衡化させ。 </li><li>シード4 -フラスコあたり6×10 7 HBM-多国籍企業とは48時間、5％CO 2中で37℃でインキュベートします。 </li><li>フラスコから培地および非接着細胞を吸引し、廃棄します。新鮮なDMEM / 10％PhABSの15ミリリットルを加え、37℃でインキュベート5％のCO 2。培地を48時間ごとに変える、8日 - 6のための文化を維持しています。 オプション：MPC収量を増加させるために、2.3から非接着細胞を新しい培養フラスコに再播種し、一次培養物について記載されるように維持することができます。 </li><li>吸引し、は、フラスコから培地を捨て、新鮮なDMEMで洗浄し、溶液を取り外す動物自由プロテアーゼの2ミリリットルを追加します。 （長時間のインキュベーションを避けるため）15分 - 5 37℃でインキュベートします。 </li><li> 5分間400×gで細胞懸濁液と遠心分離機を吸引、新鮮なDMEM / 10％PhABSの10ミリリットルを追加します。 </li><li>吸引し、上清を廃棄し、1にペレットを再懸濁 - 新鮮なDMEMの2ミリリットル/ 10％PhABS。ステップ1.10で説明したように細胞数に進んでください。 注：試薬を取り外すように、トリプシン/ EDTAを使用しないでください。 MPCが耐性トリプシンされています。文化の形態学的スクリーニングは、細胞収穫前に、非常に紡錘状MSC様細胞の存在を評価するために推奨されます。 MSC様細胞の場合、かなりの量でdはetected、選択的に汚染された細胞を除去することにより、細胞生成物の純度を高めます。そうするために、トリプシン消化は、2分間のトリプシン/ EDTA 2mlの0.05％を添加することにより、前のMPCの収穫に行うことができます。 DMEM / 10％PhABSの5ミリリットルで二回洗浄培養は、その後、上記のように治療をプロテアーゼに進みます。 </li></ol> 3.セル特性評価<ol><li>フローサイトメトリー<ol><li>洗浄液中に10 5の新たに分離した細胞の二連のサンプルを設定する：D-PBS、0.5％（v / v）のウシ血清アルブミン（BSA）および0.02％（w / v）のアジ化ナトリウムを補充しました。 5分間400×gで遠心分離します。 注意：アジ化ナトリウムは有毒です。 </li><li>洗浄溶液の200μl中のペレットを再懸濁し、蛍光色素（ &quot;TEST&quot;）と結合した抗CD90、抗CD45、抗CD73および抗CD31抗体を追加します。並列にアイソタイプコントロール（「CTRL」）を設定します。 注：染色する抗体の量は、滴定またはアコーによって決定されるべきです製造元の指示に鼎。 </li><li> 4℃で30分間サンプルをインキュベートします。 </li><li> 5分間400×gで遠心分離します。洗浄液500μlの中で細胞を再懸濁し、7 9 10サイトメータ多色の流れに少なくとも5×10 4のイベントを取得します。 </li><li>ドットプロットで結果を分析し、象限を設定するには、「CTRL」記録されたイベントを使用します。 注：MPC文化としての文化を定義するためにCD73 陰性 CD90の陰性の CD45 + CD31 +細胞の割合が95％の上にあるべきです。 98％ -いくつかの特定のアプリケーション、 すなわち 、遺伝子発現解析のために、回復カットオフは97に増加されなければなりません。 </li></ol></li><li>ネスチン検出およびF-アクチンの組織分析<ol><li>培養チャンバースライド上のプレート新たに単離したMPC（2万/ cm 2）でした。細胞は5％CO 2中で37℃で一晩インキュベートすることによって接着することを可能にします。 </li><li>洗浄液とFiの中で細胞を洗浄4％×15分間、室温で（w / v）のパラホルムアルデヒド。固定液を除去するために、洗浄液を追加し2分間インキュベートし、注ぎます。 </li><li>二回の洗浄を繰り返します。 </li><li> D-PBSで透過化細胞を室温で15分間、0.05％（v / v）のトリトンX-100を補いました。 </li><li>タンパク質を含まないシグナルエンハンサー（室温で30分）または標準ブロッキング溶液によって反応を停止する（D-PBSで3％を補った（w / vで）BSA）。 </li><li>ブロッキング溶液/シグナルエンハンサーを削除します。 </li><li> 7 / mlの追加抗ヒトネスチン一次抗体の（w / vの）と加湿チャンバー内で4℃で一晩インキュベートします。並行して、特定のない蛍光信号を評価するために、アイソタイプコントロール抗体を使用しています。 </li><li> D-PBSを加えることによって、スライドを洗浄し、2分間のままにして注ぎます。二回繰り返します。 </li><li>蛍光色素結合二次抗体を2μg/ mlの（w / vの）を追加し、暗所で1時間4℃でインキュベートします。 </li><li>ウォッシュは、上記のようにスライドします。 </li><li>蛍光ファロイジン（5 UI / ml）を追加し、30メートルをRTで残します暗闇の中でとD-PBSで3回洗浄します。 </li><li>チャンバ壁を除去し、核を検出するための退色防止試薬および4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を補充した水性マウンティング培地中でスライドをマウントします。イメージング7 9 10に進んでください。 </li></ol></li></ol> MPCの4 Mesengenic分化<ol><li>プレート2×10 4 / cm 2のTC処置T75培養フラスコ中で新たに単離したMPC、細胞を5％CO 2中、37℃でDMEM / 10％PhABSに一晩接着させ。 </li><li>間葉系幹細胞の増殖（MSC-RS媒体）用に設計された標準的な減少血清培地、約200マイクロリットル/ cm 2と、を含むDMEM / 10％PhABSを交換してください。通常、誘導から7〜10日から、（P1-MSCを）コンフルエンスまで細胞を増殖させます。 2日ごとに培地リフレッシュ。 </li><li>吸引し、は、フラスコから培地を捨て、新鮮なMSC-RS培地で洗浄し、溶液を取り外す動物自由プロテアーゼの2ミリリットルを追加します。 37インキュベート76; 5のためのC - 15分（長時間のインキュベーションを避けるため）。 </li><li> 、新鮮なMSC-RS培地10mlを加え、5分間400×gで細胞懸濁液と遠心分離機を吸引</li><li>新鮮なMSC-RS培地2ml - 1で上清を吸引し、再サスペンドペレット。ステップ1.10で説明したように細胞数に進んでください</li><li> 5×10 3細胞/ cm 2から3を播種することによって、それらのサブカルチャーに進んでください。 （P2-MSCを）コンフルエンスまで細胞を増殖させます。 </li><li>ステップ4.3から説明したように、プロテアーゼ消化によって細胞を回収し、4.5に進み、第3章で説明したように特性評価に進みます。 注：CD73 + CD90 + CD45 陰性 CD31の陰性細胞の割合よりも低い95％が部分的にしか分化を示し、さらに培養継代を必要とするであろう。 </li><li> 6ウェルTC処理プレート中の2×10 4個 / cm 2でプレートP2-MSCおよびMSC-RS培地でコンフルエントになるまで成長します。 </li><li> 「いいえサ &quot;としてマーク2つのウェルとMSC-RS媒体をリフレッシュ。 </li><li>マーク2も「骨」などの、具体的にMSCの分化のために設計され、標準的な骨形成培地200μl/ cm 2の培地を交換してください。 </li><li>マーク「脂肪」として、2つのウェル、具体的にMSCの分化のために設計され、200μlの標準/脂肪生成培地のcm 2の培地を交換してください。 </li><li>メディア全体をそれぞれ48時間を変更することにより、5％CO 2中で37℃で培養を維持します。 注：非常にテスト再現するための標準的な市販の差別メディアを使用することをお勧めします。細胞内の脂肪滴の蓄積は、脂肪生成誘導された細胞において明らかである間に差別条件の下2/3週間後、カルシウム沈着は、骨形成誘導培養に表示されます。 </li><li> D-PBSで洗浄後、培養培地を吸引し、廃棄します。 </li><li>室温で15分間、パラホルムアルデヒド（w / v）の4％の1ミリリットルを追加することにより、文化を修正しました。 </li><li>固定液を除去するためにD-PBSを追加し、2分間インキュベートし、注ぎます。繰り返し洗濯二回。 </li><li> 2つの「骨」と1「いいえ差分を「染色ヒドロキシアパタイト特定の蛍光溶液中に井戸をマークされ、2つの「脂肪」と1「いいえ差分は「200 nMのナイルレッド溶液中に井戸をマークしました。室温11,12で30分間インキュベートします。 </li><li>染色ソリューションを削除し、二回D-PBSで洗浄します。 </li><li> D-PBSを削除し、D-PBSを追加50％（v / v）のグリセリンを補充し、イメージング7 9 10に進みます。 </li></ol> 5. MPCスフェロイド萌芽アッセイ<ol><li> 3Dスフェロイドを生成するには、シャーレのふたの内側に新たに単離したMPC懸濁液（1.5×10 4細胞/ドロップ）の20μlの滴を置きます。 注：取扱滴が自分の破裂につながる可能性としては、それが過剰でそれらを置くことは非常にお勧めです。 </li><li>慎重に吊り蒸発を低下防止するために、D-PBSを含むペトリ皿を要約するために蓋を使用します。 5％CO 2で37℃でインキュベート一晩の細胞が3Dスフェロイドに集約することを可能にします。 </li><li>プレ冷蔵24ウェル培養プレート中で標準的なECMタンパク質の300μlのアリコートを加えることにより、ネズ​​ミの細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の厚いゲルをセットし、37℃で30分間インキュベートします。 </li><li>慎重にペトリ皿のふたを転倒し、静かに滅菌パスツールピペットを用いて、スフェロイドを拾います。 </li><li> 、ECMタンパク質ゲルにスフェロイドを置く標準VEGF豊富な内皮細胞増殖培地の700μlのアリコートを添加し、5％CO 2中、37℃でインキュベートします。 </li><li> 24時間後と7日間の培養で、4倍​​の倍率での3D培養物の写真を撮ります。最後の侵入細胞と回転楕円体のエッジとの間の半径方向の距離を測定することにより、画像解析ソフトウェアを適用するスフェロイドから発芽評価します。少なくとも20の異なる方向に沿って対策を繰り返します。平均距離は、ときに50ミクロン以上陽性とみなされます。 </li></ol>

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著者には競合する金銭的利益やその他の利益相反はありません。

過去数十年間で、MSC は、さまざまな骨/関節、免疫、神経、心血管、胃腸、および血液疾患の治療への応用の可能性について広範囲に研究され、前臨床評価されてきました14,15。多くの異なる組織からの多能性MSCの簡単かつ安価な単離は、有意な免疫原性の欠如とともに16、これらの細胞を細胞ベースの治療に適用される最も興味深い細胞集団の1つにすることに貢献しています。それにもかかわらず、起源組織の頻度が非常に低いことは、診療所でのMSCの適用に大きな制限を表しており、注入または移植の前に 、in vitro でこれらの細胞の増殖を余儀なくされます。 
拡張されたMSC培養により、高グレードの不均一性と変動性が明らかになり17-19 、MSCの生産と特性評価プロトコルについてコンセンサスに達することが困難になっています。さらに、最近の調査では、広範囲の組織に複数の in vivo MSC祖先が存在することが示唆されており、これが培養の不均一性に寄与しています10,20。実際、特定の培養条件は、骨髄(hBM-MNC)や脂肪組織(間質血管画分)などの「粗い」未処理のサンプルにさまざまな割合で存在するMSC前駆細胞の特定の亜集団を選択または単に促進する可能性があることが提案されています2。したがって、MSC開始細胞集団の変動性と、適用される多数の異なる濃縮/単離および培養プロトコルは、実行可能なMSCベースの治療法の定義に対する大きな障害となっています。
MSC培養の不均一性に影響を与える重要な要因は、血清補給です21。私たちの手では、hBM-MNC からの初代培養における FBS を PhABS に置き換え、疎水性プラスチックへの高密度播種と組み合わせることで、MPC5,6 という名前の明確な生物学的特徴を持つ新しい高接着性細胞集団が単離されました。FBS初代培養に少量のPhABSを添加すると、MPCの単離も可能になり、ヒト血清中にMPC誘導剤が存在することが示唆されることが観察されました6。現時点では、MPC分離/特性評価プロトコルは、ほぼ純粋なMPCを取得するために利用できる独自の方法です。プロトコルは慎重に調整されており、さらなる適用前のMPC調製物の品質スクリーニングの再現性が高いです。
MPCはMSC生産の供給源として使用できるため、未分画出発物質の使用によってもたらされるばらつきを制限できます。報告されたMPC メセンジェニック分化を特徴付ける複数のステップの正確な定義は、9で報告された間葉系細胞増殖を可能にするでしょう。それにもかかわらず、この最新の条件は、高度に精製されたMPC集団のみを適用して実現することができ、その結果、ここで説明するプロトコルによって得られた細胞産物の特性評価は、非常に重要な結果です。この単離法により、一般に約95%の純度でMPCを回収できることが報告されています。しかし、ドナー/患者のばらつきと、適用されたヒトプール血清の異なるバッチに関連するばらつきは、選択的な条件下で、かなりの割合のMSC様細胞がMPCと一緒に共単離される可能性があります。 
これらの「汚染された」MSC様細胞が、骨髄22に記載されている他の異なるin vivo前駆細胞から生じるのか、それとも制御されていない自発的なMPC分化から生じるのかは明らかではありません。いずれにせよ、MPC産物中のMSC様細胞の割合が一定であるため、これらの細胞をMSC増殖の均質な出発物質として適用する可能性が無効になります。したがって、ここでは、トリプシン消化に対するMPC耐性に基づいて、MPC産物の純度を高める、簡単で安価な方法が提案されています。蛍光または磁気細胞選別でCD73および/またはCD90の枯渇を実行することで、MPC培養物の精製において同等またはそれ以上の結果が得られる可能性がありますが、プロセス時間が大幅に延長され、コストが増加します。
さらに、MPCは多能性関連マーカーとネスチンの発現を示し、すべてメセンジェニック分化中に急速に失われました7。発芽アッセイにより、マウスECMタンパク質ゲルに侵入するMPC能力が明らかになりました。まとめると、これらの結果は、MPC が血管新生の可能性を保持している、より未熟な前駆細胞と見なす必要があることを示しています。それにもかかわらず、MPCの中胚葉分化の可能性に関する当初の熱意は実際には衰えつつあります。実際、MPCに関する7年以上の研究の後、中胚葉および血管新生の可能性は広く説明されています5-9が、中胚葉起源の他の細胞への分化はまだ不足しています。したがって、ここでは、これらの細胞を「メサンジオゲン前駆細胞」として、頭字語MPCを維持しながら、新しい、より厳密な定義を提案します。
また、MSC血管新生の可能性に関するほとんどの論争は、MPCおよびMSCの亜集団がさまざまな割合で構成される拡張培養物の不均一な組成に関連している可能性があると考えています23。
最後に、MPC は血管新生もサポートできるため、組織再建に適用可能な CBMP の実装にも重要な役割を果たす可能性があります。実際、再生に関する将来の研究では、新しく形成された組織の成長が付随する血管新生によってサポートされるべきであることを考慮に入れる必要があります。MPCにおけるメセンジェニックポテンシャルと血管新生ポテンシャルの共存は、これらの興味深い細胞を含む新しい治療アプローチの再生ポテンシャルを大幅に改善する可能性があります。

間葉系幹細胞（MSC）は、それらの多系列分化能及び増殖因子/サイトカインを分泌するだけでなく、免疫調節1において役割を果たすことが造血を支持する能力、に関連する臨床的価値があります。 MSCベースの治療用細胞の生産とアプリケーションの定義では医薬品（CBMP）治療3ベースのセルの安全性と有効性のための具体的な国際規制に特に注意して、大規模な臨床および前臨床研究2の対象となっています。ヒトMSCは、ウシ胎児血清（FBS）、およびウシトリプシンのような動物由来のサプリメントおよび試薬を含む培地中で広範囲に培養されます。したがって、細胞操作に関連した感染リスクと並んで、患者はまた、プリオンの暴露ならびに細胞収穫とtransplan後も持続可能性タンパク質、ペプチドまたは動物由来の他の生体分子に結合された免疫学的なリスクに直面してテーション4。 この問題を回避するために、我々は、プールされたヒトAB型血清（PhABS）でFBSを置き換え、ヒト骨髄（HBM）動物を含まない培地中で由来MSCを培養しました。これらの条件下では、成長のMSCと一緒に、我々は、新規な細胞集団を同定しました。これらの細胞は、形態学的およびMSCからの表現型に異なっていたと独特の遺伝子発現プロファイルと同様に特徴的な成長/接着特性を示しました。彼らはmesengenicと潜在的な血管新生の両方に保持され、したがって、 中胚葉前駆細胞 （MPCは）5と命名しました。その後、我々は純度6の高品位でのMPCを生成するために、選択的かつ再現可能な培養条件を定義することができました。 我々はさらにのMPCの形態学的および生物学的特性を調べました。 MPCが、正ネスチンサイクリングで遅い、のKi-67陰性、および長いテロメア5によって特徴付け染色体であることを示しました。彼らはplurを表明しましたipotency関連転写は、因子Oct-4およびNanogのではなく、MSCのマスターレギュレータのRunx2とのSox9 7。間葉系マーカーCD73、CD90、CD166を欠く表現型が、MPCのは、MSCよりも低いレベルでエンドグリン（CD105）を発現しました。 MPCはまた、具体的ポドソーム状構造8を維持する接着PECAM（CD31）の一貫性の発現を特徴とする分子、インテグリンαL（のCD11a）、αM（CD11bの）、αX（CD11cの）だけでなく、インテグリンβ2（CD18）の特徴的なパターンを示しました。標準的なMSC増殖培地では、MPCが速やか9シグナリング Wnt5 /カルモジュリン細胞の活性化を特徴と中間段階を介してのMSCに分化しました。ネズミの細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の三次元培養におけるスフェロイドから発芽する能力によって実証されるようのMPCはまた、血管形成特性を保持していました。血管新生の可能性は急速にmesengenic系統に沿ってMPCの分化後に失われました。 ここでは、プロの提示しますトコールは、単離するとHBMの血液サンプルから高度に精製されたMPCを特徴付けるために最適化されました。 MPC mesengenicと血管新生の分化のための再現性のあるプロトコルも記載されています。

<table><tbody><tr><td>マトリゲル基底膜マトリックス</td><td>BDバイオサイエンス(サンノゼ、カリフォルニア州-米国)</td><td>354230</td><td>マウスECMタンパク質 ストック濃度:100%(9 - 12 mg / ml) 最終濃度:100%</td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)</td><td>シグマ(セントルイス、ミズーリ州、米国)</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m Filters</td><td>Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM&nbsp;</td><td>GE Healthcare (スウェーデン、ウプサラ)</td><td>17-5442-03</td><td>不連続密度勾配遠心分離用培地</td></tr><tr><td>プール型ヒトAB型血清(PhABS)</td><td>LONZA (Walkersville MD-USA)</td><td>14-490E</td><td>最終濃度:10%</td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp;MA USA)</td><td>35050-038</td><td>安定化 L-グルタミン ストック濃度: 100x 最終濃度: 2 mM</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td> <td>Sigma (米国ミズーリ州セントルイス)</td> <td>A8412</td><td>ストック濃度: 7.5% 最終濃度: 0.5%</td></tr> <tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma (米国ミズーリ州セントルイス)</td> <td>S8032</td><td>最終濃度: 0.02%</td></tr> <tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (連鎖球菌ペン)</td><td>Gibco (グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)</td><td>15070-063</td><td>Antibiotics ストック濃度:5,000 UI/mlペニシリン、5,000 &#956;g / mlストレプトマイシン 最終濃度:50 UI / mlペニシリン、50 &#956;g/ml ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>T-75 懸濁培養用フラスコ</td><td>Greiner Bio-one&nbsp;(ドイツ・フリッケンハウゼン)</td><td>658 190</td><td></td></tr><tr><td>T-75培養フラスコTC処理</td><td>Greiner Bio-one&nbsp;(ドイツ・フリッケンハウゼン)</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>ThermoFisher (ウォルサム&nbsp;MA USA)</td><td>12563-011</td><td>Animal-free proteases detaching solution ストック濃度:1x 最終濃度:1x</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp;MA USA)</td><td>15400-054</td><td>Phenol red free ストック濃度:0.5% 最終濃度:0.25%</td></tr><tr><td>anti-CD90 APC抗体&nbsp;(CD90)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-095-402</td><td>最終濃度: 1:40</td></tr><tr><td>抗CD45 APC-Vio770抗体 (CD45)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-096-609</td><td>最終濃度: 1:40</td></tr><tr><td>抗CD73 PE抗体 (CD73)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-095-182</td><td>最終濃度: 1:40</td></tr><tr><td>抗CD31 PE Vio-770抗体 (CD31)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach、ドイツ)</td><td>130-105-260</td><td>最終濃度:1:40</td></tr><tr><td>マウスIgG1 APC抗体</td><td>MiltenyiBiotec (ベルギッシュグラートバッハ、ドイツ)</td><td>130-098-846</td><td>最終濃度:1:40</td></tr><tr><td>マウスIgG2a APC Vio770抗体</td><td>MiltenyiBiotec (ベルギッシュグラートバッハ、ドイツ)</td><td>130-096-637</td><td>最終濃度:1:40</td></tr><tr><td>マウスIgG1 PE抗体</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach、ドイツ)</td><td>130-098-845</td><td>最終濃度:1:40</td></tr><tr><td>マウスIgG1 PE Vio-770抗体</td><td>MiltenyiBiotec(BergischGladbach、ドイツ)</td><td>130-098-563</td>最終<td>濃度:1:40</td></tr><tr><td>低グルコースダルベッコの修飾イーグル培地&nbsp;(DMEMの)</td><td>サーモフィッシャー(ウォルサム、&nbsp;MA USA)</td><td>13-1331-82</td><td>フェノール レッドフリー 最小必須 medium ストック濃度: 1,000 mg/L グルコース</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;(FBSの)</td><td>サーモフィッシャー(ウォルサム、&nbsp;MA USA)</td><td>10500</td><td>ストック濃度:0.2 mg/ml 最終濃度:2 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Prolong Gold 退色防止試薬と 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインド</td>ール <td>Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp;米国)</td><td>P-36931</td><td>水性封入剤 + DAPI 最終濃度:1x</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma (米国ミズーリ州セントルイス)</td><td>P6148</td><td>固定剤 最終濃度:4%</td></tr><tr><td>LAB-TEK 2 ウェルチャンバースライド</td><td>Sigma (米国ミズーリ州セントルイス)</td><td>C6682</td><td></td></tr><tr><td>抗ネスチン抗体 [クローン 10C2]</td><td>Abcam (英国ケンブリッジ)</td><td>ab2035</td><td>ストック濃度:1 mg / ml 最終濃度:7 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>アレクサ フルーア 555 ファロイジン</td><td>サーモフィッシャー (ウォルサム、&nbsp;MA USA)</td><td>A34055</td><td>ストック濃度:200 UI/ml 最終濃度:5 UI/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Euroclone (ミラノ、イタリア)</td><td>EMR237500</td><td>最終濃度:0.05%</td></tr><tr><td>MesenPRO RS Medium&nbsp;(MSC-RSミディアム)</td><td>サーモフィッシャー(ウォルサム、&nbsp;MA USA)</td><td>12746-012</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 アンチマウス SFX キット</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp;MA USA)</td><td>A31619</td><td>ヤギ抗マウス二次抗体+シグナルエンハンサー ストック濃度:2 mg/ml 最終濃度:2 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>Kartell 実験器具&nbsp;(イタリア/ノヴィリオ(MI)</td> )<td>329</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS アディポディフ&nbsp;Media</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-091-679</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS OsteoDiff&nbsp;Media</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)</td><td>130-091-678</td><td></td></tr><tr><td>Osteoimage Bone mineralization Assay</td><td>LONZA (Walkersville MD-USA)</td><td>PA-1503</td><td>Hydroxyapatite specific fluorescent staining solution</td></tr><tr><td>50 ml ポリスチレン円錐管</td><td>Greiner bio-one (Kremsm&uuml;nster Austria)</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp;マサチューセッツ州米国)</td><td>N1142</td><td>脂質用蛍光染色溶液 ストック濃度:100 mM 最終濃度:200 nm</td></tr><tr><td>グリセリン</td><td>シグマ(米国ミズーリ州セントルイス)</td><td>G2289</td><td>最終濃度:50%</td></tr><tr><td>ポリスチレンシャーレ</td><td>シグマ(米国ミズーリ州セントルイス)</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>TC処理</td>済み <td>Greiner Bio-one GmbH(ドイツ、フリッケンハウゼン)</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>内皮増殖培地、EGM-2 BulletKit&nbsp;(EGM-2)</td><td>LONZA (Walkersville MD-USA)</td><td>CC-3162</td><td>VEGFが豊富な内皮細胞増殖培地</td></tr><tr><td>Leica Qwin Image Analisys Software</td><td>Leica (Wetzlar, Germany)</td><td></td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

ヒト骨髄から単離することmesangiogenic前駆細胞（mpcは）

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

臨床応用のためにヒト骨髄(hBM)由来間葉系間質細胞(MSC)を単離することを目的とした調査研究では、ヒト血清添加培地での増殖のために特別に選択された新規細胞集団を特定しました。これらの細胞は、MSCとは異なる形態学的、表現型、および分子的特徴によって特徴付けられ、私たちはそれらを中胚葉前駆細胞(MPC)と名付けました。MPCは丸く、厚く非常に反射するコア領域があります。それらは、プラスチックに対する強力なトリプシン耐性接着を示します。MPCの拡張に失敗すると、MPCのサイクルが遅いことが直接明らかになりました。これは、Ki-67のネガティブさによっても示唆されている通りです。一方、MSC増殖用に設計された標準培地でMPCを培養すると、指数関数的に増殖するMSC様細胞の集団が生まれました。MPCは、間葉系分化能力を示すだけでなく、血管新生能を保持し、その多系統祖の性質を確認しました。ここでは、フローサイトメトリー(CD73、CD90、CD31、およびCD45)、ネスチン発現、およびF-アクチン組織によってhBM-MPCを単離および特性評価するための最適化された高再現性プロトコルについて説明します。MPCの中間性および血管新生分化のためのプロトコルも提供されています。ここでは、これらの細胞のより適切な命名法も提案し、「Mesangiogenic Progenitor Cells」と改名しました。

ここで説明する選択的培養条件はHBM-多国籍企業の1.0％として、新規な接着性と、ほぼ単型細胞集団の単離を可能にしている（0.5から2.0×10 5から6 HBM-多国籍企業-新鮮BMサンプルの10ミリリットル）5,6 。 MPCは5のように、静止状態、のKi-67陰性細胞を丸め、 -私たちは、これらの大（直径60μmで40）を同定しました。形態学的には、それらはより高い倍率（ 図1 A.1中の白矢印）での糸状仮足の多くを示すフラットな薄い周囲に囲まれた厚いコア領域と独特の目玉焼き-形状によって特徴づけられます。外側のセル境界の極性の伸長は、多くの場合（ 図1 A.1の黒矢印）が観察されます。このような形態は、標準的なMSC培養で報告された典型的な紡錘状間葉系間質細胞の外観とは明らかに異なります。フローサイトメトリーメートルしばらくCD31およびCD45を発現するために新たに単離したMPCの95％以上を示しました。esenchymal関連マーカーCD90とCD73 13は検出不能であった（ 図1 A.2）。私たちは、MPCのための4つの抗原のこの制限されたセットが示すものとして考えています。 MPCのさらなる顕著な特徴は、細胞内で検出されないポドソームのような構造（ 図1 A.3における赤）とネスチンの強烈な表現（ 図1 A.3で緑）、の数を明らかに点線のF-アクチン分布していますアイソタイプ対照抗体で染色した（データは示さず）。 メディア指数関数的に成長しているMSC様細胞（ 図1 B.1）への迅速な分化MSC拡張の結果を得るために設計された標準のRSでのMPCを培養します。 2継代細胞は、最終的には、CD73 + CD90 + CD45 陰性 CD31の陰性 （ 図1 B.2）にCD73 陰性 CD90 陰性 CD45 + CD31 +からその表現型を切り替えた後。プロセスにおいて、MPCは再orgaがストレスファイバーにnize F-アクチンネスチン発現は、いくつかのまれな細胞（ 図1 B.3）に閉じ込めなるが。明確なMSC様表現型へのMPC mesengenic分化は異なる細胞形態によって明らかにされた二つの別個のステップを介して行われます。 MSC RS培地で1週間MPC様細胞の残留集団後も（ 図2（a）におけるP1-MSCの）平坦な多角形の多分岐細胞のコンフルエントな層内で検出可能です。さらに、通路は、（ 図2のAにP2-MSCの）紡錘状MSC様細胞のほぼ単相培養物を得るために必要とされます。従って、それらのMSCの性質を確認し、少なくとも2週間選択培地に移したとき、これらの指数関数的に増殖する細胞は容易に骨芽細胞や脂肪細胞に分化することができます。骨形成誘導培養物において、カルシウム沈着は、測色アリザリンS染色または特異的な蛍光色素（ 図2 Bで緑）のいずれかによって検出することができます。脂肪生成誘導細胞の後（ 図2 Bに赤）のいずれかの比色オイルレッドや蛍光ナイルレッド染色によって明らかにされたように脂肪滴の蓄積を示しています。 MPCタイプは、血管新生アッセイを発芽によって確認しました。 MPCが24時間のVEGF-刺激（ 図2 C）後の3Dスフェロイドから（マイクロメートル50以上）は、マウスのECMタンパク質ゲルに侵入する能力を示しました。 600μmの距離 - 細胞に侵入し、一週間後に300で検出されました。逆に、侵入能力はmesengenic分化（ 図2 D）後にP2-MSCの中で失われました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54225/54225fig1.jpg" /> 図1. 新たに単離したMPCが特徴的な機能を持っている。DMEM / 10％PhABSで培養HBM-多国籍企業の7日間は、MSCから容易に区別できる静止状態のMPC（A）の人口（B）を生じさせます</stronグラム&gt;形態（A.1、B.1、スケールバー= 100μm）で、表現型（A.2、B.2）、F-アクチン分布（A.3で赤、B.3）の観点から、とネスチン表現（A.3、B.3、スケールバーの緑色の= 20ミクロン）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54225/54225fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54225/54225fig2.jpg" /> 図2 のMPCは 、in vitroでの 標準MSCおよび表示萌芽血管新生に分化する 。MSCの拡張のために設計された市販のRS媒体を含むDMEM / PhABSの交換はMPCはのmesengenic誘導をトリガします。文化の中で1週間後、いくつかの残留のMPCはまだMSC-RS媒体のさらなる通路がコンフルエントMSC様細胞の集団（P2-MSCは、スケールバー= 100μm）とにつながりながら、検出可能な（P1-のMSC）です。 Pカルシウム沈着（Bにおける緑）、脂肪滴の蓄積（Bで赤、スケールバー= 200μm）とによって明らかにされたように2-MSCは末端それぞれ、適切な刺激下での骨細胞や脂肪細胞に分化します。 MPCがP2-のMSC（D、スケールバー= 1.0ミリメートル）との違いで、マウスのECMタンパク質ゲル（C）におけるスフェロイドから発芽一貫性を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54225/54225fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、ヒトの骨髄(hBM)から中胚葉前駆細胞（MPCs）を単離するための最適化された、再現性の高いプロトコルについて説明します。MPCは、フローサイトメトリーおよびネスチン発現によって特徴付けられました。その結果、血管新生能を保持しながら、指数関数的に増殖するMSC様細胞培養を生じさせる能力が示されました。

ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは）

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

この手順の全体的な目的は、選択的な培養条件を用いてヒト骨髄からメサンギウム形成前駆細胞（MPC）を単離することです。ここでは、それらのメサンギウム形成能および血管新生能の両方を検証します。臨床応用に最適化された間葉系ストローマ細胞の培養において、メサンギウム形成前駆細胞は低い割合で同定されます。FBSをヒト血清に置き換えた場合についてです。この手法は特筆すべき点があり、実際、血管新生の出芽に適した大量のall-pol-ified NPCsの非常に安定した単離と、同期化したMSC培養の作製を可能にします。私たちは、MCS培養の消化後、少量のtalgrum血清の中では少数の目玉焼き状の細胞のみが接着し、FBS処理後にMCへと分化したことから、この現象を発見しました。ヒト骨髄単核細胞（MNC）を単離するには、まず5〜10 mLの新鮮な骨髄をDPBSで全量50 mLになるまで希釈し、転倒混和して細胞溶液を混ぜ合わせます。次に、25 mLずつに分注して2本の新しい50 mLコニカルチューブに移し、それぞれに25 mLの新鮮なDPBSを加えて、再度転倒混和します。その後、細胞を室温で静置し、骨のミネラル断片と脂肪を溶液から分離させます。10分後、パストゥールピペットを用いて浮遊した脂肪を注意深く取り除き、骨片ペレットを乱さないように、個別の70 micronフィルターで細胞懸濁液をろ過します。MNC層を単離するため、2本の50 milliliterチューブに室温の1.007 grams per milliliter密度勾配媒質を入れ、その上に希釈した骨髄を20-25 millilitersずつ加え、遠心分離によって細胞を分離します。次に、滅菌済みのパストゥールピペットを使用して、界面にある白色の細胞リングを回収し、新しい50 milliliterチューブにまとめます。分離した単核細胞を、新しい培養液で400 ×g、室温にて5分間洗浄します。その後、ペレットを5〜10 mLの新しい培養液で再懸濁します。MPCを分離するために、疎水性T75フラスコに15 mLの新しい培養液を入れ、37 °C、5 % CO2の条件下で平衡化させます。30分後、1フラスコあたり10⁷個のヒト骨髄単核細胞を4～6回播種し、48時間培養します。2日目に、フラスコから培地と非接着細胞を除去し、15 mLの新鮮な培養培地を添加します。その後、培養物をインキュベーターに戻し、6～8日間培養します。インキュベーション終了後、付着細胞を新鮮なDMEMで洗浄します。次に、2 mLの動物不使用プロテアーゼ剥離溶液を加え、37 °Cで5〜15分間インキュベートします。細胞がフラスコ底面から剥がれたら、10 mLの新鮮な培養液を加えて反応を停止させ、遠心分離により細胞を回収し、ペレットを1〜2 mLの新鮮な培養液で再懸濁します。MPCプレートの細胞数をカウントした後、1cm²あたり2×10⁴個の細胞を組織培養処理済みのT75培養フラスコに播種し、細胞培養インキュベーター内で15mLの新鮮な培地を用いて一晩接着させます。翌朝、培養液を1cm²あたり200µLのMSC増殖培地に交換し、さらに7〜10日間培養します。培養細胞がコンフルエントに達したら、MSCの継代2回目で再びコンフルエントになるまで、1cm²あたり3〜5×10³個の細胞密度で継代培養し、その後、既報の手法に従ってプロテアーゼ消化を行い、細胞を回収します。組織培養処理済みの6ウェルプレートに、1 cm²あたり10⁴個の細胞を播種し、新鮮な増殖用培地を加えます。培養細胞が再びコンフルエントになるまで育成した後、2つのウェルを「非分化」としてマークし、増殖用培地を更新します。さらに2つのウェルを「骨芽細胞」としてマークし、培地をMSC分化専用の標準骨分化誘導培地（200 µL/cm²）に交換します。次に、2つのウェルを脂肪分化部位としてマークし、培地をMSC分化用に特別に設計された標準的な脂肪分化誘導培地 200 µL/cm² に交換します。細胞を細胞培養インキュベーターに戻し、細胞が分化するまで2～3週間培養します。その後、細胞外カルシウム沈着および細胞内脂質滴蓄積の蛍光検出を行います。3Dスフェロイドを作製するため、新鮮に単離したMPC懸濁液を20 µLずつ、大量の液滴としてペトリ皿の蓋の内側に播種します。すべての液滴を配置した後、懸垂滴の蒸発を防ぐため、DPBSが入ったペトリ皿の底部に蓋を慎重に被せ、プレートを細胞培養インキュベーター内で一晩置きます。翌朝、4 °Cに保った24ウェル培養プレートの各ウェルに、標準的な細胞外マトリックスタンパク質を300 µLずつ分注し、37 °Cで30分間静置してマトリックスタンパク質をゲル化させます。ゲル化したECMタンパク質に、標準的な血管内皮増殖因子（VEGF）含有内皮細胞増殖培地を700 µL加えます。MPCが3Dスフェロイドに凝集したら、ペトリ皿の蓋を慎重に反転させ、滅菌済みパステールピペットを使用してスフェロイドを穏やかに回収します。最後に、スフェロイドを培養ウェルに播種し、プレートをインキュベーターに戻します。形態学的に、MPCは、多くの糸状仮足を伴う平坦で薄い周辺部に囲まれた厚いコア領域を持つ、特徴的な目玉焼きのような形状によって定義されます。また、外細胞境界の極性伸長もしばしば観察されます。MSC増殖培地でのMPC培養では、増殖性の平坦で多分岐した細胞への迅速ながらも部分的な分化が起こり、未分化のMPCが依然として検出可能な状態で残ります。さらに継代を行うと、培養細胞は指数関数的に増殖するMSC様細胞の単層となります。この過程で、MPCのF-Actinはストレスファイバーへと再編成され、Nestinの発現はごく少数の稀な細胞に限定されます。 freshly isolated MPCのフローサイトメトリーでは、95%以上の細胞がCD31およびCD45を発現し、間葉系関連抗原であるCD90およびCD73を欠損していることが示されています。これらの最新の抗原は、MSCへの完全な分化後にのみ高度に発現します。分化誘導培地で少なくとも2週間培養した際に、カルシウム沈着によって示される骨芽細胞、または脂質滴の蓄積によって明らかになる脂肪細胞へと容易に誘導されることで、これらの細胞の間葉系性質を確認できます。これにより、前分化させた細胞培養物のMSCとしての性質を確認します。MPCのタイピングは、出芽血管新生アッセイによってさらに確認されます。このアッセイにおいて、細胞は血管内皮細胞成長因子の刺激を受けた24時間後、3Dスフェロイドからミリアン細胞外マトリックスタンパクゲルへ侵入する能力を示します。1週間後には、侵入細胞はさらに長い距離を遊走しますが、この侵入能は間質細胞分化後の継代2回目MSCでは失われます。習得すれば、適切に処理することでMSC培養を1時間で確立でき、1週間以内に100万から200万個のMPCを得ることが可能です。本手順を実施する際は、ヒトCRバッチを培養に使用する前に、その性能を評価することが重要です。現時点では、当社のMPC単離プロトコルが、後続のアプリケーションに向けて再現性の高い、ほぼ純粋なMC培養を得るための唯一の方法です。この技術の開発により、細胞ベースの治療分野の研究者が、骨組織再生にMPCを適用する可能性を探索する道が開かれました。

isolating-mesangiogenic-progenitor-cells-mpcs-from-human-bone-marrow

Research

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自己血清を用いたヒト間葉系幹細胞（hMSCが）を培養し、異種材料と他の負の効果により拒絶反応のリスクを低減します。また、新鮮なのhMSCを配信することができ、中胚葉前駆細胞のサブセットを回収することができます。自家フィブリン塊でのhMSCの埋め込みは、取り扱いが容易で効果的な外科的移植を可能にします。...

自家条件で間葉系幹細胞の培養および配信：整形外科アプリケーションのためのスマートなアプローチ

腎臓血管周囲間質細胞 (kPSCs) の消化酵素と NG2...

ひと腎臓血管周囲間質細胞の新規臨床等級分離法

このプロトコルの目的は、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞を分離することです。一部のアプリケーションは虚血性疾患の治療、心血管のリスクを持つ患者を識別するためのバイオ...

ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離

ここでは、分離し、マウスの腹腔肥胖細胞を養うプロトコルを提案します。2 つのプロトコルの機能特性評価についても述べる: リリースされた β-ヘキソアミダーゼの比色定量に基づく細胞内 Ca2...

腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金

骨格筋生検組織から得られたヒト原発性筋前駆細胞(hMpAc)を分離、培養、特徴付け、分化する技術を提示する。これらの方法によって得られ、特徴付けられたhMpPCは、その後、ヒトの筋形成および骨格筋再生に関連する研究の質問に対処するために使用することができる。...

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

この方法は、マウス大腿骨、脛骨、および骨盤骨からのMEPおよびMKpのフローサイトメトリーによる精製を記述する。...

マウスメガ核球前駆細胞の分離

本プロトコルは、マウス由来の非常に均質な骨髄間葉系幹細胞(BMSC)を精製、増殖、および特徴付けるための費用対効果の高い方法を説明しています。このアプローチにより、高い増殖と分化の可能性のある大量のBMSCの取得が容易になり、マウスモデルをサポートし、前臨床研究を前進させることができます。...

マウス由来骨髄間葉系幹細胞の精製、増殖、およびフローサイトメトリーに基づく表現型解析

学ぶヒト骨髄からMesangiogenic前駆細胞（MPC）を単離する方法。選択的培養条件により高収率で再現性のある単離が可能で、MSC様細胞の分化能と血管新生能を評価します。再生医療研究への応用に有用です。

ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは）

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