ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは）

この手順の全体的な目標は、選択的な培養条件によってヒトの骨髄から中血管新生前駆細胞またはMPCを単離することです。私たちは、それらの中原性および血管新生性の両方の可能性をテストしています。中遺伝子形成前駆細胞は、臨床応用に最適化されたmesen-ki-ma-stro-mo細胞培養により、低確率で同定されています。

FBSがヒト血清に置き換えられるとき。この技術は独特で、実際、血管新生の発芽や同期MSC培養の生成に適した多数のalli-pol-ifiedNPCの非常に一貫した単離を可能にします。これは、タルグラム血清中のMCS培養物の消化がトリップした後、結合したままの目玉焼き形状の細胞がほとんどなく、FPS処理後にMCに分化したときに発見されました。

ヒト骨髄単核細胞またはMNCを単離するには、まず5〜10ミリリットルの新鮮な骨髄をDPBSで総体積50ミリリットルまで希釈し、細胞溶液を反転して混合します。次に、25ミリリットルの細胞を2つの新しい50ミリリットルの円錐管に均等に分配し、各チューブに25ミリリットルの新鮮なDPBSを追加して、反転による2回目の混合を行います。次に、細胞を室温で休ませて、ミネラルの骨片と脂肪を溶液から分離させます。

10分後、パスチュアーピペットを使用して浮遊脂肪を慎重に除去し、ミネラル骨片ペレットを乱すことなく、個々の70ミクロンフィルターで細胞懸濁液をろ過します。2つの50ミリリットルチューブのそれぞれに室温1.007グラム/ミリリットルの密度勾配培地の上に希釈骨髄のMNC層20〜25ミリリットルを分離し、遠心分離によって細胞を分離します。次に、滅菌パスチュアーピペットを使用して、新しい50ミリリットルのチューブに入る面にある細胞の白っぽいリングをプールします。

単離した単核細胞を新鮮な培地で400倍G、室温で5分間洗浄します。次に、ペレットを5〜10ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁します。MPCを分離するには、疎水性T75フラスコを摂氏37度と二酸化炭素5%の新鮮な培地15ミリリットルで平衡化します。

30分後、フラスコあたり10〜7個のヒト骨髄単核細胞を4〜6回播種し、48時間インキュベーションする。2日目に、培地と非接着細胞をフラスコから廃棄し、15ミリリットルの新鮮な培地を細胞に供給します。培養物をインキュベーターに6〜8日間戻します。

インキュベーションの終わりに、付着細胞を新鮮なDMEMで洗浄します。次に、2ミリリットルの動物を含まないプロテア剥離溶液で細胞をインキュベートし、摂氏37度で5〜15分間インキュベートします。細胞がフラスコの底から浮き上がったら、10ミリリットルの新鮮な培地を加えて反応を止め、遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを1〜2ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁します。

MPCプレートを組織培養処理したT75培養フラスコに細胞の10〜4回を2回カウントした後、T75培養フラスコで細胞を新鮮な培地の15ミリリットルで一晩接着します。翌朝、培養培地を200マイクロリットル/平方センチメートルのミサンコルストロム細胞またはMSC増殖培地と交換し、さらに7〜10日間細胞を培養します。培養物がMSCで継代2の新しい合流点に達するまで、1平方センチメートルあたり10〜3倍でコンフルエンス継代培養に達したとき、その後、前に実証したように細胞を収集するためにプロテア消化を行います。

プレートを1平方センチメートルあたり10〜4細胞の2回に10個ずつ、組織培養で処理した6枚のウェルプレートと新鮮な増殖培地。培養物を再び合流するように成長させた後、2つのウェルを分化なしとしてマークし、拡張培地を更新します。2つのウェルを骨ブラストとしてマークし、その培地をMSC分化のために特別に設計された標準的な骨形成培地の平方センチメートルあたり200マイクロリットルと交換します。

次に、2つのウェルをアディポサイトとしてマークし、培地をMSC分化用に特別に設計された標準的なアディポジェニック培地の平方センチメートルあたり200マイクロリットルに置き換えます。細胞が分化するまで、細胞を細胞培養インキュベーターに2〜3週間戻します。次に、細胞外のカルシウム沈着物と細胞脂質液滴の蓄積の蛍光検出に進みます。

3Dスフェロイドを作製するには、シャーレ蓋の内面に分離したばかりのMPC懸濁液を20マイクロリットルの滴を大量に播種します。すべての滴を慎重にセットしたら、DPBSが入ったシャーレベースに蓋をして液滴の蒸発を防ぎ、プレートを細胞培養インキュベーターに一晩置きます。翌朝、摂氏4度の24ウェル培養プレートの各ウェルに300マイクロリットルのアロクワットの標準的な細胞外マトリックスタンパク質を加え、マトリックスタンパク質を摂氏37度で30分間ゲル化します。

ゲル化したECMタンパク質に、700マイクロリットルの標準的な血管内皮細胞増殖因子が豊富な内皮細胞増殖培地を添加します。MPCが3Dスフェロイドに凝集したら、ペトリ皿の蓋を慎重に反転させ、滅菌パスツールピペットを使用してスフェロイドを穏やかに収穫します。最後に、スフェロイドを培養ウェルに播種し、プレートをインキュベーターに戻します。

形態学的には、MPCは、多くのフィリポディアを示す平らで薄い周辺に囲まれた厚いコア領域を持つ独特の目玉焼きの形状を特徴としています。細胞境界の外側の極性伸長もよく観察されます。MSC増殖培地でのMPC培養は、増殖する平坦で多分岐した細胞への急速かつ部分的な分化をもたらし、未分化のMPCが依然として検出可能です。

さらなる継代後、培養は指数関数的に増殖するMSC様細胞の単層をもたらす。その過程で、MPCはF-アクチンをストレスファイバーに再編成し、ネスチンの発現は少数の希少細胞に限定されます。新たに単離されたMPCのFlows-itom-etryは、CD31およびCD45を発現するが、mis-en-com-al関連抗原CD90およびCD73を欠く細胞の95%以上を示しています。

これらの最新の抗原は、MSCに完全に分化した後にのみ高度に発現します。分化培地を少なくとも2週間供給すると、これらの細胞は、カルシウム沈着物で示されるように骨芽細胞に容易に誘導され、脂肪滴の蓄積によって明らかな脂肪酸が骨芽球に誘導されることが確認されます。分化前細胞培養のMSCの性質を確認します。

MPCタイピングは、発芽血管創生アッセイでさらに確認され、細胞は血管内皮増殖因子刺激の24時間後に3Dスフェロイドから無数の細胞外マトリックスタンパク質ゲルに侵入する能力を示します。1週間後、侵入細胞はさらに長い距離を移動し、メサンジェニック分化後の2回目の継代MSCで失われる侵入能力です。一度習得すると、MSC培養は1時間で確立でき、これに適切に取り組めば、1週間未満で100万から200万のMPCを提供できます。

この手順を試みる際には、ヒトCRバッチを培養に使用する前に、その性能を評価することが重要です。現時点では、当社のMPC分離プロトコルは、さらなるダウンストリームアプリケーションのために高再現性のほぼ純粋なMC培養を得るための唯一のものです。開発後、この技術は、細胞ベースの治療の分野でMPCを骨格組織再生に適用する可能性を探求する研究への道を開きました。