エタノールへのリグノセルロースの生物変換のための堅牢なペントース発酵酵母の進化のための技術

この適応進化手順の全体的な目標は、未毒の加水分解物中のヘキソース糖とペントース糖をより迅速に発酵させて経済的に回収可能なエタノールにすることができる、天然のキシロース発酵酵母scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124の堅牢な株を導き出すことです。この方法は、複雑な修飾を持つ菌株へのロードマップを提供することにより、リグノセルロースをエタノール産業に前進させ、微生物阻害剤を含む加水分解物中の糖の発酵を可能にします。ここで、ターゲットを絞った進化の主な利点は、キシロースを発酵させることができる天然酵母から堅牢な菌株が成形されるため、工業用のサッカロミセス菌株を設計する必要がなくなることです。

私たちは、単一の酵母株が、AFEX前処理トウモロコシ茎葉や希酸前処理スイッチグラスなど、さまざまな種類の加水分解物に対して堅牢である可能性が低いことに気づきました。scheffersomyces stipitisが有性生殖サイクルを経る能力は、開発されたさまざまな系統を、これらのさまざまな形質を持つ株の交配を通じて単一のより堅牢な株に組み合わせることができるため、本研究でのさらなる利用に有益です。この手順を実演するのは、私の研究室の生物科学技術者である共著者のStephanie ThomsonとMaureen Shea-Andershです。

この濃縮手順を開始する前に、125ミリリットルのフラスコでNRRL Y-7124株の予備培養を行い、酵素糖化アンモニア繊維拡張前処理トウモロコシストーバー加水分解物(AFEX CSH)の希釈シリーズを準備します。リピーティングピペットを使用して、96ウェルマイクロプレートにウェルあたり15マイクロリットル、加水分解物希釈あたり8ウェルを充填します。ウェルあたり数マイクロリットルのプレカルチャーを接種して、620ナノメートルの初期吸光度、またはA620が0.1

マイクロプレートをプラスチックの箱に入れ、湿らせたペーパータオルで湿度を確保し、摂氏25度で24〜28時間静的にインキュベートします。次に、マイクロプレート読み取り分光光度計を使用して、最も濃縮された加水分解物希釈で1.0を超えるA620に物理的に成長した培養物を特定します。同定したウェルをマイクロチューブにプールし、充填プレートに分配します。

充填プレートから新しい加水分解物希釈シリーズの各ウェルに1〜5マイクロリットルを移して、初期A620を0.1以上にし、以前と同様にプレートをインキュベートします。マイクロプレート読み取り分光光度計でマイクロプレート内の培養物の成長をモニターします。適応培養物のグリセロールストックを定期的に調製する。

クライオファイルにコロニーを形成した最大加水分解物濃度の4つの井戸をプールし、20%滅菌グリセロールと1対1で混合します。細胞をマイナス80°Cで凍結します。12%グルカンAFEX CSHの成長が24時間で一貫して見えるようになるまで、この濃縮手順を繰り返します。

この手順を開始するために、酵母麦芽ペプトンデキストロース、またはYM寒天への適応培養物の選択されたグリセロールストックをストリークします。次に、成長後、ストリークを使用して、3つのマイクロプレートウェルのそれぞれに50マイクロリットルの3%または6%グルカンAFEX CSHを接種します。マイクロプレートを摂氏25度で24時間インキュベートします。

プールは、コロニー形成された井戸を最高の加水分解物強度で複製し、力強い成長を遂げます。そしてYMまたは6%glucan AFEX CSH寒天への希釈版。プレートを摂氏25度のインキュベーターで24〜48時間インキュベー

グリセロールストック培養物として凍結する成長を示す最高希釈プレートから5つの単一コロニーを選択します。各コロニーをYMプレートにストリークし、24時間インキュベートします。無菌ループで、細胞の発達したストリークを少量の10%グリセロール混合に移して細胞を懸濁し、2〜3個のクライオファイルに分配して摂氏マイナス80度で凍結します。

単純な6%グルカンAFEX CSHバッチ培養で分離株をテストするには、グリセロールストックからストリークした48時間プレートから細胞をpH 7リン酸カリウム緩衝液に移し、細胞懸濁液を調製します。各細胞懸濁液の光学密度を測定した後、追加のバッファーで容量を調整して、A620が10になるようにします。各懸 ?? 液の1マイクロリットルを使用して、50マイクロリットルの3%グルカン加水分解物の4つのウェルのそれぞれを初期A620の0.2に接種します。.

マイクロプレートを24時間インキュベートします。次に、2つの24時間マイクロプレートウェルを移し、pH 5で6%グルカンAFEX CSHの25ミリリットルのプレカルチャーを接種します。シリコンスポンジクロージャーでフラスコを閉じ、摂氏25度、150RPMで24時間インキュベートします。

6%グルカンAFEX CSHプレカルチャーを使用して、同様の25ミリリットルの成長カルチャーを、最初のA620が0.1であるのに重複して接種します。増殖培養物を摂氏25度、150RPMで24時間インキュベートします。最適な定義培地のバッチ培養、またはODMで分離物のジオキシシック欠乏をテストするには、混合糖を使用して、75ミリリットルのODMの前培養物に125ミリリットルのフラスコに125ミリリットルのフラスコにキシロース1リットルあたり150グラムを接種します。

摂氏25度、150RPMで24時間インキュベートします。プレカルチャーを使用して、pH 6.5でグルコース1リットルあたり75グラム、キシロース1リットルあたり75グラムを含むODMで0.1のA620に接種します。フラスコを摂氏25度、150RPMで振る。

連続培養液を接種する24時間前に、125ミリリットルのフラスコにエタノールを含まないODMで代表的なAFEX CSH耐性コロニーのプレカルチャーを調製します。5〜10ミリリットルのAFEX CSH耐性分離物プレカルチャーを使用して、ジャケット付き100ミリリットルのスピナーフラスコに100ミリリットルのODMを接種し、初期A620を0.5にします。培養保持量を25°Cに保ちます。

200 RPMで攪拌し、滅菌可能なpH電極、pHコントローラー、および温度制御された循環水浴を装備します。最初に、エタノール曝露により細胞増殖が遅くなるため、培養発酵がpHを5.4に低下させると、ポンプがキシロース1リットルあたり100グラムとエタノール1リットルあたり50グラムをpH 6.3 ODMに供給するように、pH作動ポンプをセットアップして、さらなるpH低下を止めます。容量を100ミリリットルに維持し、廃液ポンプで培養面を連続的にすくい取ります。

収集された廃液量を測定し、48〜72時間ごとに連続培養からサンプルを採取して、原稿に記載されているように、生細胞濃度、製品、および基質を分析します。その時点で最も普及していた濃縮度の高いコロニーである30〜100コロニーを形成する緩衝サンプル希釈液の生存率プレートからコロニーを分離することにより、グリセロールストックを定期的に保存します。プレートに5ミリリットルの10%グリセロールを浸して、重複するクライオファイルを調製できるようにします。

エタノール1リットル当たり25グラムを超える存在下でキシロース上で1時間当たり0.01を超える特定の速度で培養物が着実に増殖できる場合は、1時間当たり約0.01の低希釈率で連続培養飼料を100ミリリットルの保持容量まで開始する。時間が経つにつれて、飼料中のエタノールを1リットルあたり50グラムに向けて上げます。連続培養を再開するための接種物への紫外線照射は、突然変異率を早めるための選択肢です。

グリセロールストック中の高度な個体群を捕捉します。単一細胞コロニーを単離する前に、エタノールの存在下でキシロース発酵が改善されたグリセロールストック集団が、テキストプロトコルに記載されているように同定されます。これらの優れた集団を使用して、プレートに縞模様を付けます。

縞模様のプレートは、5に等しいA620の緻密な緩衝細胞懸濁液を調製するために使用されます。次に、細胞懸濁液を使用して、96枚のディープウェルプレートで前培養を接種します。摂氏25度、400 RPM、1インチの軌道で48時間インキュベートします。

次に、各前培養を使用して、酸前処理スイッチグラス加水分解物液中に16の1ミリリットルの複製培養物を初期A620に接種し、ODMとキシロース1リットルあたり50グラムを混合し、エタノールチャレンジ1リットルあたり20、30または40グラムを提供するのに十分なエタノールを接種します。摂氏25度、400 RPM、1インチの軌道で48時間インキュベートします。異なるグリセロールストックごとに、成長とキシロースの使用を可能にする最高のエタノール濃度の培養井を収穫します。

各細胞株をYM寒天培地に播種して、グリセロールで保存する一般的な単一コロニーを取得します。細胞株ごとに10コロニーを選び、それぞれをYM寒天プレートにストリークしてグリセロールストックを調製します。AFEX CSHでの適応後、親株と適応集団との間のODMでの発酵性能の比較により、適応集団はキシロースをより効率的に使用して、エタノールをより迅速かつ大量に製造することが明らかになりました。

キシロースおよび高レベルのエタノールを含有するODM上での連続培養選択により、エタノール耐性を改善するために、耐エタノール性を向上させるための加水分解物耐性コロニーをさらに開発した。すべての適応集団は、エタノール1リットルあたり40グラムの存在下でキシロース代謝を誘導する能力において親を上回っていました。これらのグラフは、PSGHLの各製剤の親株に対するキシロースの取り込み率とエタノール収量の観点から評価された優れた耐性分離株の性能をまとめたものです。

キシロースリッチPSGHLの一次スクリーニングから選択した最良の株を、その後、3つの完全な加水分解物でスクリーニングし、各加水分解物内の各分離物の発酵について相対性能指数(RPI)を計算しました。次に、各分離株の合計全体的なパフォーマンス指数を計算しました。5つの分離株(3つ、14、27、28、33)は、全体的なRPIが60を超えており、加水分解物と栄養条件の変動をすべて組み合わせて最も頑健であるとランク付けされました。

このビデオを見た後、ターゲットを絞った進化プロセスでscheffersomyces stipitis NRRL Y-7124のようなキシロース発酵酵母に挑戦する方法、濃縮、分離、および非毒素化加水分解物中の混合糖をより効果的に発酵させるより堅牢な誘導体を評価する方法を知る必要があります。一度習得すると、このテクニックは1日平均約1時間の毎日の時間投資で使用できます。進化プロセスの大幅な変化は、わずか4か月で文書化できます。

この手順を試みている間は、摂氏マイナス80度で凍結するグリセロールストックを準備することにより、進行する個体群を定期的に救うことが重要です。これにより、個体数の回復、定期的な評価、分離、または進化プロセスの再開が可能になります。さまざまな突然変異を管理するには、一連の表現型について、プロセス固有の条件下で酵母を定期的にスクリーニングすることを忘れないでください。

動力学的パラメータに基づいて、全体的な無次元相対性能指数(RPI)を計算することで、加水分解物の種類や栄養素の補給などの発酵条件の変動に対するひずみランクと堅牢性を評価できます。進化過程の各段階から生じる優れた酵母は、ゲノムシーケンシングの候補となり、阻害剤耐性などの改善の性質を減少させ、ジオキシンラグを理解し、次世代の生体触媒株の設計に利用することができます。