Name: メラトニンに対する低酸素/再酸素化誘発性の破壊の保護効果を研究するために、ヒト初代栄養膜細胞培養モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学ぶメラトニンの保護効果をヒト初代栄養膜細胞培養モデルで。低酸素・再酸素化条件下での酸化ストレスに対する作用機序と妊娠合併症のシグナル伝達経路を探索する方法です。

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カナダ自然科学工学研究評議会（NSERC（(no.262011-2009)からのCVへの助成金とMarch of Dimes Social and Behavioral Sciences Research）CVおよびJTSへの助成金：およびMinistère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec （FRQ（Nature et technologies）およびArmand-Frappier INRS財団からのLSFへの学生資格による支援を受けています。 Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATEのHCから、Canadian Institutes of Health Research(CIHR)とFRQ-SantéのAAHT、NSERCのJBPへ。Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) と Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT から EMAS へのフェローシップによって。

胎盤は、インフォ患者の同意と倫理委員会（CHUMサンリュック病院とINRS-研究所アルマン-フラピエの承認を得て、直ちにCHUMサンリュック病院、モントリオール、QC、カナダでの合併症のない妊娠からの自発的な膣分娩後に得ましたラバル、QC、カナダ）。 絨毛細胞栄養芽層細胞の1単離および精製<ol><li>ソリューションとメディア<ol><li> 4℃で1％の体積/体積の抗生物質（10,000単位/ mlペニシリンG、100 mg / mlでストレプトマイシン硫酸塩）とストアを含むダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（DMEM-HG）を補完することにより、トランスポートメディアを準備します。 </li><li> 10％ 体積/体積のウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM-HGを補充することにより一次培地を調製し、25 mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、1％ 体積/体積の抗生物質（10,000単位/ mlのペニシリンG、100 mg / mlでストレプトマイシン硫酸ナトリウム）し、4℃で保存します。 37°Cの前にウォームメディアつかいます。 </li><li>生理食塩水（0.9％重量/容量の塩化ナトリウム）の4 Lを準備します。 </li><li> 1×HBSS（pH7.4）中に25mMのHEPESを添加することによって改変ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を準備します。 </li><li>修正されたHBSS（1.1.4で調製した）で消化溶液、硫酸マグネシウム（MgSO 4）、塩化カルシウム（CaCl 2）、トリプシン、デオキシリボヌクレアーゼIV（DNアーゼIV）、および1％ 容量/容量の抗生物質（新鮮な4つのボトルを準備10,000単位/ mlのペニシリンG、100ミリグラム/ mlストレプトマイシン硫酸塩） を表1に示します。 </li><li>密度遠心分離メディア勾配を準備<ol><li> 10％の体積/体積 HBSS 10倍で密度遠心分離培地を補充することによって密度遠心分離培地溶液を準備します。 </li><li>密度遠心分離培地溶液で14アッセイチューブを準備し、 表2に記載されているように、HBSSを変更しました。 </li><li>精力的にグラデーションにその内容を追加する前に、各濃度の溶液（ステップ1.1.6.2）を混ぜます。優しく最高濃度（70％）で始まる、蠕動ポンプ（1ml /分）を有する50mLのガラス遠心管に濃度溶液を加えます。勾配の各層の適切な分離を維持するために、管壁に対するソリューションを排出することによって液滴を避けてください。 <ol><li>蠕動ポンプの非存在下では、パスツールピペットで非常に優しく層を適用します。 </li></ol></li></ol></li><li> 2％ 容量/抗真菌体積抗生物質/（10,000単位/ mlペニシリンG、100 mg / mlで硫酸ストレプトマイシン）で（材料の表を参照）ランニング緩衝液を補充することにより、最終的なランニングバッファーを準備します。 4℃で保存。 </li></ol></li><li>絨毛細胞栄養芽層の分離 注意：使用無菌手術用機器、ガラス製品、ピペット、フラスコなど <ol><li>絨毛細胞栄養芽層の分離の日に、37℃の水浴中で、及びFBS 70mlを（ステップ1.1.5）からの消化液を温めます。注：FBSの使用50mlを消化し、遮断します一度解凍した氷の上に置くことができる凍結工程（1.2.22）用の20ミリリットルを残り。 </li><li>出産後、できるだけ速やかに（ステップ1.1.1から）氷冷輸送媒体で実験室に（1時間未満）の胎盤をもたらします。 </li><li>液体ゴミ箱に輸送媒体と胎盤血を捨てます。胎盤の重量を測定し、冷生理食塩水に浸します。 </li><li>測定し、以下の機能解析：臍帯の長さを、臍帯ローカライズ;胎盤長さ、幅、形状（楕円形、円盤状）。膜の色;子葉構造病理。注：データは、結果セクションに提示されています。 </li><li> （コードの周りに追加の半径1cmの円とそのベースで、 すなわち ）その胎盤の挿入と一緒にへその緒を切ります。後で組織学的分析のために、組織学的、組織固定溶液（ホルマリンの10％）300mlに浸します。 </li><li> 5×5×5cmの立方体に全体胎盤をカット。生理食塩水ゾル中に完全に（4倍X〜1分）洗浄ution（0.9％）食塩水が透明になるまで、血液細胞を除去します。リンス液は捨ててください。 </li><li>時計皿では、血管や石灰化を除去するために胎盤膜およびミンチ組織を削除します。鉗子でしっかりと血管を持ち、Metzenbaumはさみバックを使用して組織を削除します。 <ol><li>ブフナー漏斗でみじん切り胎盤を置きます。生理食塩水緩衝液の約100ミリリットルですすいでください。細分化した組織の35グラムが得られる（プラスチック計量ボートとスケールを使用） - 30までミンチ続けます。 35グラムの準備 - 必要に応じて、3つの追加30まで得ることが胎盤の残りの部分をミンチ。この間、氷の上に秤量ボートにみじん切りの組織を置きます。 注：このステップは1時間に約45分かかります。 </li></ol></li><li>トリプシン処理フラスコに35グラムみじん切り胎盤組織 - 30を追加します。トリプシン処理フラスコに調製した消化溶液1（ 表1）の150ミリリットルを移し、よく混ぜます。 </li><li>でトリプシン処理フラスコを置きますこれ以上50未満サイクル/分の速度で30分間水浴を振って、手動で均質な消化のために5分ごとにトリプシン処理フラスコを混ぜます。 </li><li>最初の消化の終わりに、水浴からトリプシン処理フラスコを削除し、胎盤組織を沈降するために1分間それ（45°）を傾けます。 10ミリリットルの滅菌ピペットを用いて、上清の約80ミリリットルを除去し、廃棄します。組織を吸引することは避けてください。 </li><li>トリプシン処理フラスコに消化溶液2（ 表1）100mlのを転送します。よく混ぜ、ステップ1.2.9を繰り返します。 </li><li>第二の消化の終了時に、水槽からトリプシン処理フラスコを取り外し、1分間それを45°傾けます。 10ミリリットルの滅菌ピペットを用いて、80ミリリットルの上清を除去し、静かにセルストレーナー（100μmのメッシュ）で遠心分離管に移します。 FBSの2ミリリットルの遠心分離管がいっぱいになるたびに入ったビーカーに濾過した上清を転送します。 </li><li>記載したように、第3の消化を行います第二の消化（1.2.11および1.2.12）並行して75ミリリットル消化溶液3を用いて、消化2用の1.2.16.1にステップ1.2.15を実行します。 </li><li>消化溶液4（75ミリリットル）を用いた第3の消化とまったく同じように第四の消化を実行しますが、上清の最大量を収集します。消化3並列に1.2.16.1に、手順1.2.15を実行し、そして最終的に消化4。 </li><li> （消化2、3から4）上清13.5ミリリットルの部分に、1 15ミリリットル遠心管に各部分を等分。 22.8センチメートル長いガラスパスツールピペットで、非常に静かに、ゆっくりと別のレイヤーを作成するために、各チューブの底にFBSの1.5ミリリットルを配置します。 FBSおよび上清を混在させないでください。室温で1250×gで20分間ブレーキなしのチューブを遠心。 注： 図1に示すように遠心分離した後、4つの層は、チューブ内に表示されているトリプシンおよび栄養膜細胞の分離は、過剰な細胞消化を回避します。 </li><li>真空ポンプ、aspirと食べたし、上清（消化液）と2層の間に白っぽい膜を含むFBS層を捨てます。温かい細胞培養培地1ml（; NO FBSなしHEPESとステップ1.1.2）と（トロホブラストと赤血球​​層）ペレットを再懸濁します。 <ol><li>すべてのチューブから再懸濁した細胞を収集し、1チューブでそれらを組み合わせます。チューブはすべて消化の終わりまで室温で放置します。注：すべて消化した後、通常の収量は再懸濁された細胞（消化あたり1）の3つのチューブです。 </li></ol></li><li>暖かい細胞培養培地で15ミリリットルにボリュームを構成しています。室温で10分間、1250×gで遠心分離します。真空ポンプで上清を取り除きます。ペレットを吸引しないでください。 </li><li>優しく暖かい細胞培養培地の1ミリリットルで3つの管から得られたペレットを再懸濁します。 1チューブでその内容をプール。 8ミリリットルを得るためには、温かみの細胞培養培地でボリュームを完了します。 </li><li>非常に静かに分離卒業生に細胞懸濁液をレイヤーパスツールピペットでient。室温で507×gで30分間ブレーキなしで遠心します。 </li><li>遠心分離した後、バックライトでの勾配で細胞の異なる層を識別します。密度遠心分離培地の50％ - 層栄養膜を含むと40の間の細胞の混入を探します。真空ポンプで、上位層（&gt; 50％）を取り外します。 </li><li>パスツールピペットで関心のある層に位置して細胞を回収し、50mlの遠心管に移します。細胞培養培地で50ミリリットルにボリュームを構成しています。室温で1250×gで10分間遠心します。 </li><li>無菌条件下で、上清を捨て、FBS 20mlでペレットを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を数えます。氷の上で、無菌ジメチルスルホキシド（DMSO）の2.22ミリリットルを追加し、反転させる穏やかに混合します。極低温バイアルへの細胞懸濁液のアリコート1.5ミリリットルを、-80℃で一晩凍結し、液体窒素タンクに移します。 </li></ol></li> &lt;LI&gt;栄養膜精製<ol><li>製造元の指示に従ってすすぎとバッファを実行し、磁気浄化機器の新しいフィルターカラムを取り付けます。負の1、正1と正の2ポートをきれいにしてから、製造元の指示に従って、各ポートの下に50ミリリットルチューブを紹介する「クリーンプログラム」を実行します。 </li><li> 37℃の水浴中で迅速ステップ1.2.22で凍結した細胞を解凍。冷たいランニング緩衝液の20ミリリットルと穏やかに50ミリリットルチューブを再懸濁細胞に細胞を移します。 450×gで5分間、4℃のためのチューブを遠心。 </li><li>上清を捨てます。冷たいランニング緩衝液で洗浄ステップを繰り返します。生存率を測定する血球計数器を用いて細胞を数えます。遠心分離を繰り返して（5分、4℃で450×gでの場合）。上清を注意深く取り除きます。抗HLA-ABC抗体をマウスの1％ 容量/容量を含有する冷ランニング緩衝液1mlを追加します。 4℃で30分間インキュベートし、ミクシィ静かに5分ごとにngの。 </li><li>冷たいランニング緩衝液の6ミリリットルを追加します。 450×gで4℃で5分間遠心します。上清を捨て、このステップを繰り返します。抗マウス二次抗体結合磁気ビーズの10％ 容量/容量を含有する冷ランニング緩衝液1mlで再懸濁細胞。静かに5分ごとに混合、15分間4℃でインキュベートします。 </li><li>冷たいランニング緩衝液の6ミリリットルを追加します。 450×gで4℃で5分間遠心します。 5ミリリットルの冷ランニングバッファーで上清と再懸濁を捨てます。 </li><li>磁気精製装置を用いて栄養膜細胞を分離します。負のポートで細胞を回収し、冷ランニングバッファーの20ミリリットルを追加します。 注：栄養膜細胞は複雑なHLA-ABCが含まれていない、したがって、他の細胞型から分離し、負の1ポートに向けられています。 </li><li> 450×gで4℃で5分間遠心します。上清を捨て、ゆっくりと20ミリリットル暖かい初代培養培地で細胞を再懸濁します。 usin細胞を数えますGAの血球計数器は、生存率を決定します。 </li><li>プレート以下の密度で細胞：0.15×10 6細胞/ウェルで96ウェルプレート、1.6×10 6細胞/ウェルで24ウェルプレートおよび4.5×10 6細胞/ウェルで6ウェルプレート。 37℃で、5％CO 2でプレートをインキュベートします。 </li><li>および/ ​​または18を免疫細胞化学により16,17フローサイトメトリーによって栄養膜細胞の純度を確認してください。 注：免疫精製細胞の純度は、サイトケラチン7およびビメンチン17-19に対するFITC結合モノクローナル抗体を用いて決定しました。このプロトコルは、。Lanoixらにも詳述されている2008年7。 </li><li>少なくとも4時間後、未付着細胞を除去した後、8％O 2（ 図2およびセクション2を参照）で構成されて正常酸素室にプレートを転送するために温かい培地で細胞を2回洗浄します。 </li></ol></li></ol> 2.インビトロ Inductio酸素正常状態のnおよび低酸素/再酸素化<ol><li>インキュベータ室操作（セット・アップするための図2Aを参照）。 <ol><li>層流フード中で、乾燥を避けるために、インキュベーターチャンバーの底に滅菌水を含むペトリ皿を置きます。その後、チャンバーの優れた棚の上に先に調製した細胞培養プレートまたはフラスコ（ステップ1.3.10）を配置。 </li><li>フード外、ガスホース（ 図2A：図5a、b及びc）にチャンバー（入口ポート）を取り付けたガス（8％O 2または0.5％O 2）のチューブに到達する（ 図2A：7）。チャンバーの両方の入口および出口ポートを開きます。このとき、ガスレギュレータ（ 図2（a）は ：4）閉じたままにする必要があります。 </li><li>注意深くガス調整弁を開き（ 図2A：4）。完全にチャンバ内の空気を置換する25リットル/分の空気流で4分間のフラッシュ。 </li><li>チャンバーをフラッシュした後、次に入口をガスレギュレータを閉じ、OUチャンバーのtletポート。 </li><li>流量計の出口ホース（ 図2A：5C）抜い室の入口ポートからの37℃で細胞培養インキュベーター内でチャンバを置きます。 </li><li>ステップ2.1.3の後にガス1時間でチャンバーを充填することにより、培養培地中で、現在のプレート、フラスコ内に存在し、溶存空気を交換してください。 </li><li>繰り返して、他のガス組成のために2.1.6に2.1.1ステップ（ 例えば 、妊娠初期の栄養膜培養の9のための2％のO 2）。 </li></ol></li><li>酸素の割合（ 図2B-C）を確認<ol><li>チャンバ内（細胞なし）の細胞培養培地中の酸素の濃度を確認するために、酸素のアダプタに接続された酸素電極を使用します。電圧計に酸素電極を接続します。 </li><li>既知の酸素含有量（ 例えば 、0％でのガスの溶液を曝露することによって、同じ溶液（ すなわち 、細胞培養培地）で検量線を作成し21％酸素）。測定値は各濃度について安定化された後、チャンバー内の媒体中に電極を導入します。 注：酸素濃度10内の任意の偏りを回避するために、同じ深さですべての測定を行います。 </li></ol></li><li>栄養芽細胞で正常酸素および低酸素/再酸素化の誘導。 <ol><li>適切な細胞培養フラスコ、プレートまたはペトリ皿に一次栄養膜細胞を追加した後、必要に応じて治療を行います。 </li><li>並行して、チャンバ内に、特定の条件ごとに24時間（ 図3）を再生するために所望のガス混合物に細胞をさらします。 </li></ol></li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

哺乳類では、胎児の発育が十分な胎盤機能に直接依存しています。健康障害の発生起源は、その後の人生で明らかに病気の原因は早期開発に胎盤が胎児プログラミング30-32で機構的な役割を持っていることをさかのぼることができ仮説に基づいています。胎盤は胎児の成長と発展の重要なメディエーターである：それは、栄養移動を規制する有害な暴露から保護し、主要な内分泌機能を有しています。 Kliman らによる開発。実行可能な一次細胞栄養層を分離するための再現可能な技術のは、正常および異常な胎盤機能6の研究で画期的な出来事です。多くの研究者は、胎盤生理18,20,33,34を理解するために、in vitroで特定の条件を再現するために、この技術を適応しています。 Petroff らによって記載されたように 、多くの手順は、単離されたCYTOの精製および堅牢な収率を保証するために重要です栄養膜細胞18。例えば、消化ステップは、生存可能な単離された細胞栄養層のより多く、そ...

ヒト妊娠全体にわたって、単核幹細胞である胎盤栄養膜細胞は、急速に増殖し絨毛またはextravillous細胞栄養芽層細胞のいずれかに分化します。 Extravillous細胞栄養芽層が侵入し、子宮壁のらせん動脈を改造します。絨毛細胞栄養層は、他の一方で、多核合胞体（シンシチウム）1を形成するために、増殖し分化し、ヒューズを続けます。絨毛栄養膜の恒常性の維持は、胎児の幸福と健康な妊娠のために不可欠です。実際には、絨毛栄養膜は、酸素と栄養素の母体胎児の交換を可能にし、妊娠に不可欠なホルモンを産生します。また、合胞体栄養細胞は、母体の血液循環と直接接触している唯一の細胞型であり、本質的な物理的および免疫学的障壁を提供します。したがって、合胞体栄養細胞は恒常性維持のため、アポトーシスおよび交換を受けなければならないとAVOしますID胎盤病理2-5。 Kliman らによって開発された技術。1986年の6個のヒト胎盤からの一次絨毛細胞栄養層を分離するためには、絨毛栄養膜分化に関与する分子メカニズムの研究を可能にすることによって、胎盤の研究に革命をもたらしました。密度遠心分離メディア（ポリビニルピロリドン、またはパーコールによってコーティングされたコロイダルシリカ粒子）で分離に続いてトリプシンおよびDNアーゼによる逐次酵素消化に基づいて、この古典的な技術は、現在、絨毛栄養膜細胞を単離するためのゴールドスタンダードとして認識されています。技術は、磁気免疫精製、これらの細胞の表面上の特異的抗原の示差発現に基づいて、非栄養膜細胞から絨毛細胞栄養芽層を分離する手順によって最適化することができます。私たちは、原因絨毛細胞membran上のその発現の欠如にヒト白血球抗原ABC（HLA-ABC）を選びました電子7,8。 胎盤は、妊娠中の酸素レベルの劇的な変化を受ける器官です。妊娠初期では、酸素の比は、第二及び第三のトリメスターに生理学的に非常に低い（2％O 2）が、酸素の穏やかなレベルに増加する（8％O 2）です。 Tuuli ら 9は、胎盤絨毛内部の栄養膜環境のin vitroでの再生が酸素化レベルでの挑戦とばらつきがあっても表現型の変化につながる可能性があることを説明しました。したがって、妊娠8,9の第三期中の胎盤絨毛に見られる酸素分圧を模倣するために正常酸素として8％の酸素を採用することが示唆されます。 Chenら 10は、広く栄養膜細胞培養における酸素分圧に関連するいくつかの変数を検討し、細胞周囲環境の酸素レベルを決定することの重要性を実証しました。絨毛中の酸素の濃度が増加する傾向にあります脈管形成に起因します。常に胎盤絨毛増加の血流および過酸化水素（豊富な反応性酸素種）のレベルは、脈管11,12を制御する重要な信号です。妊娠合併症、脈管形成の欠如は、低酸素状態を生成し、そしてより重要なことには、酸素の間欠的な変形は、（低酸素/再酸素化と呼ばれます）。これらの条件は、胎盤と胎児の生存率13,14を損なう酸化ストレスの異常な増加につながります。次のように栄養膜細胞が低酸素/再酸素化のエピソードの間に生体内で受ける改変は、in vitroで模倣することができる。彼らは合胞体栄養細胞に分化するまで、絨毛細胞栄養層は、酸素正常状態（8％O 2）下に維持されています。次いで、それらを酸素正常状態（再酸素化）の追加の18時間、続いて4時間、低酸素条件（0.5％O 2）に供されます。この低酸素/再酸素化のアプローチを使用して、元のトロホブラスト特定の妊娠合併症で観察されているように、調節解除酸化還元状態と内因性アポトーシス8のレベルの増加をhibit。したがって、これは胎盤性低酸素症/再酸素化に関連した妊娠合併症に対処するために新たな予防・治療法を評価するインビトロモデルに有用です。 胎盤細胞は、例えば、酸化ストレスおよび胎盤機能不全15を回避する能力など、いくつかの重要な機能を有し、メラトニンを生成します。ここで、我々は、分子細胞および機能レベル8で胎盤栄養膜細胞におけるメラトニンの保護効果を実証するために使用される実験的なアプローチとセルモデルを提示します。

<table><tbody><tr><td>湾曲したメッツェンバウムはさみ</td><td>シャンドン</td><td>9212</td><td>手術器具(細胞分離)(2ユニット)</td></tr><tr><td>スプリンター鉗子ファイン41/2フィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>13-812-42</td><td>手術器具(細胞分離)(2ユニット)</td></tr><tr><td>はさみ4.5 Str解剖</td><td>フィッシャーブランド</td><td>08-940</td><td>手術器具(細胞分離)(2ユニット)</td></tr><tr><td>ガーゼスポンジ10 cm x 10 cm</td>カー<td>ディナルヘルス</td><td></td><td></td>361020733</tr><tr><td>長方形ガラスグラタンディッシュパイ</td><td>レックス</td><td>1105397</td><td>ガラス製品(2.8リットル)</td></tr><tr><td>ファンネルブフナー</td><td>クアーズテック社</td><td>10-356E</td><td>ガラス製品(直径114ミリメートル)</td></tr><tr><td>時計ガラス&nbsp;</td><td>pyrex</td><td>9985100EMD</td><td>ガラス製品</td></tr><tr><td>ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>組織組織固定液</td></tr><tr><td>トリプシン化フラスコ</td><td>ウィートン</td><td>355395</td><td>ガラス製品 (1 ユニット)</td></tr><tr><td>使い捨て培養チューブ</td><td>Kimble</td><td>73750-13100</td><td>ガラス製品</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス パスツールピペット (22.8 cm)</td><td>フィッシャーブランド</td><td>K63B1367820C</td><td>ガラス製品</td></tr><tr><td>250 ml ガラス ビーカー</td><td>フィッシャーブランド</td><td>KFS14005250</td><td>ガラス製品</td></tr><tr><td>キャップ付きガラス メディア ボトル</td><td>フィッシャーブランド</td><td>KFS14395250</td><td>ガラス製品 (8 ユニット)</td></tr><tr><td>50 ml コレックス チューブ&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>8422-A</td><td>(1ユニット)</td></tr><tr><td>15 ml ポリスチレン遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 ml ポリスチレン遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>10 ml セロジカルピペット</td><td>コーニング</td><td>11415038</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー 100 &mu;m ナイロン</td><td>コーニング</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>吸収ライナー</td><td>サイエンスウェア</td><td>1199918</td><td></td></tr><tr><td>500&nbsp;mlボトルトップフィルター</td><td>コーニング</td><td></td><td>ポア:0.22&nbsp;&マイクロ;m /ミディアムおよびHBSS調製</td></tr>2 <tr><td>mlのリオジェニックバイアルコー</td><td>ニング430488</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凍結容器、Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Pharmacia Fine Chemicals</td><td>P3モデル</td><td></td></tr><tr><td>振とうウォーターバス</td><td>フィッシャー</td><td>モデル127</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>ABM</td><td>4EKFS6CX-4</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーブランド</td><td>EC231-598-3</td><td>生理食塩水0.9%</td></tr><tr><td>ハンク緩衝塩溶液(Hbss)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td>数量:消化液1Lに対して9.25(1バイアル)</td></tr>ヒ<tr><td>ドロキシピペラジンエタンスルホン酸(Hepes)</td><td><a name="RANGE!B29">Life Technologies</a></td><td>15630-080</td><td>消化液1Lに対して25ml(1M)</td></tr> トリ<tr><td>プシンI型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>9,888 U</td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼIV型</td><td>ロシュ</td><td>10-104-159-001</td><td>402,000 U</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Baker</td><td>2500-01</td><td>800 mM</td></tr><tr><td>ダルベッコs Modified Eagle Medium High Glucose (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10564-045</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン 硫酸塩</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td>密度遠心分離培地勾配。容量:36 ml</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Acros</td><td>42383-0010</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Automacs マグネティックセパレーター&nbsp;</td><td>ミルテニー・バイオテック</td><td>003</td><td></td></tr>型<tr><td>オートマック&nbsp;コラム&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Automacs ランニングバッファー&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 Automacsリンス液&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx</td></tr><tr><td>抗ヒト HLA Abc 精製クローン W6/32</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-9983-82</td><td>抗マウス</td></tr><tr><td>抗体 抗マウス Igg Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130048401</td><td></td></tr><tr><td>マルチプル ウェル プレート -&nbsp; 6 ウェル ウィズ蓋</td><td>コーニング</td><td>3335</td><td>細胞結合面</td></tr><tr><td>マルチプルウェルプレート -&nbsp; 24 ウェル</td><td>蓋付き コーニング</td><td>3337</td><td>セル結合面</td></tr><tr><td>マルチプルウェルプレート -&nbsp; 96 ウェル 蓋付き</td><td>コーニング</td><td>3300</td><td>セル結合面</td></tr><tr><td>モジュラーインキュベーターチャンバー&nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>2つのセットは、正常酸素と低酸素/再酸素化条件を同時に生成するために必要です</td></tr><tr><td>シングルフローメーター</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SFM3001</td><td></td></tr><tr><td>50 mm インラインフィルター</td><td>Whatman</td><td>6721-5010</td><td>PTFE、細孔:1.0 & マイクロ;m</td></tr><tr><td>ガスレギュレータ</td>ー <td>プロスター</td><td>PRS301233</td><td>2個セットは、ノルモキシアと低酸素/再酸素化条件を同時に生成するために必要です</td></tr><tr><td>ガスホース クラスVi クリア 5/16&nbsp;</td><td>Parker</td><td>100-05070102</td><td>3個入り ~ 0.5 m</td></tr><tr><td>17 mm 調整可能ガスホースクランプ</td><td>タイラップ</td><td>THCSS-16</td><td></td></tr><tr><td>Normoxia ガスボンベ&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>サイズ K (3rd トリメスターの組成: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)</td></tr><tr><td>Normoxia ガス ボンベ&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>サイズ K (3rd トリメスターの組成: 5% CO2、0.5% O2、Bal. N2)</td></tr><tr><td>酸素微</td><td>小電極 INC</td><td>84477</td><td></td></tr><tr><td>酸素アダプター微</td><td>小電極 INC</td><td>3572</td><td></td></tr><tr><td>ROS 検出試薬: CM-H2DCFDA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C-400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-hCG ELISAキット&nbsp;</td><td>DRG internatinal</td><td>EIA-4115</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentin purified antibody</td><td>eBioscience</td><td>14-9897</td><td>宿主:マウス</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 7 (FITC) 抗体&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab119697</td><td>ホスト: マウス</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ Anti-mousse IgG H&L抗体</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A-11029</td><td></td></tr></tbody></table>

メラトニンに対する低酸素/再酸素化誘発性の破壊の保護効果を研究するために、ヒト初代栄養膜細胞培養モデル

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

このプロトコルは、絨毛の細胞栄養膜細胞が連続的な酵素消化を経て、密度遠心分離、培地勾配分離、免疫磁気精製によって胎盤からどのように単離されるかを説明しています。in vivoで観察されたように、初代培養中の単核絨毛性細胞栄養膜細胞は、72時間後に多核合胞体栄養膜細胞に分化します。正常酸素症(8%O2)と比較して、低酸素/再酸素化(0.5%/ 8%O2)を受ける絨毛性細胞栄養膜細胞は、子癇前症、早産、子宮内発育制限などの妊娠合併症でin vivoで観察されるものと同様に、酸化ストレスと内因性アポトーシスの増加を受けます。この文脈では、低酸素/再酸素化条件下で培養された一次絨毛栄養膜は、ヒト胎盤で変化するメカニズムとシグナル伝達経路をよりよく理解し、特定の妊娠障害から保護する効果的な薬剤の探索を促進するためのユニークな実験システムを表しています。ヒト絨毛栄養膜はメラトニンを産生し、その合成酵素と受容体を発現します。メラトニンは、その保護抗酸化作用により、子癇前症および子宮内発育制限の治療薬として提案されています。この論文に記載されている一次絨毛性細胞栄養膜細胞モデルでは、メラトニンは正常酸素状態の栄養膜細胞に影響を与えませんが、低酸素/再酸素化によって破壊された合胞体栄養膜細胞の酸化還元バランスを回復させます。したがって、初代培養中のヒト絨毛栄養膜細胞は、低酸素/再酸素化中の胎盤機能に対するメラトニンの保護効果の背後にあるメカニズムを研究するための優れたアプローチです。

経膣分娩で得られた正常期間胎盤から絨毛栄養膜細胞の単離と免疫精製は、1×10 8の生細胞が得られました。胎盤は、350グラムの重量を量った円盤状の形状と透明膜で4センチ、直径19センチ、でした。いいえ子葉奇形は検出されませんでした。臍帯は傍局在と56センチメートルの長さを有していました。純度は、ビメンチンおよびサイトケラチン7マーカーを用いたフローサイトメトリーによって評価しました。細胞の98％以上が免疫精製から得られた絨毛栄養膜細胞の純度を確認し、サイトケラチン7ビメンチンについて陰性および陽性でした。絨毛細胞栄養芽層細胞を1mMのメラトニンの存在下または非存在下で正常酸素条件下で96ウェル培養プレートに添加しました。絨毛細胞栄養芽層の生化学的分化は、以下のようにβヒト絨毛性ゴナドトロピン（β-hCGの）分泌のレベルを決定することによりモニターしました以前1,7,20,21説明。形態的分化とアポトーシスは、抗デスモプラキン及び抗カスパーゼ切断サイトケラチン18、中間フィラメント7,22を用いて免疫蛍光法に...

この原稿は、低酸素/再酸素化下で培養された免疫精製されたヒト絨毛性細胞栄養細胞のユニークなin vitroモデルを示しています。このモデルは、メラトニンなどの有望な治療法が、酸化ストレスの増加や胎盤機能の変化に関連する妊娠合併症に対する保護効果を研究するのに適しています。

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

この手順の全体的な目的は、低酸素または再酸素化条件下で培養された免疫精製一次ヒト絨毛細胞において、メラトニンの保護効果を検討することです。この手法は、低酸素および再酸素化下にある胎盤に伴う妊娠合併症に関連するメカニズムやシグナル伝達経路の理解に役立ちます。本技術の主な利点は、酸化ストレスの増加に関連する妊娠障害に対するメラトニンなどの有望な治療法の研究に適していることです。一般的に、この手法を初めて行う人は、組織の細切しや密度勾配遠心分離用培地の調製など、絨毛細胞栄養膜細胞の単離ステップに苦労します。この手法は妊娠第3期の栄養膜細胞に関する知見を得るのに有用ですが、妊娠第1期の胎盤や他種の胎盤など、他の系にも適用可能です。多くのステップは実際に見て学ばなければ習得が困難であるため、本手法を視覚的に示すことは重要であり、それによって再現性が向上し、習得時間を短縮することができます。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるAndree-Anne Hudon-Thibeault、Philippe Wong Yen、およびEugenia Assuncaoが行います。まず、臍帯を胎盤挿入部に沿って切断し、組織学的解析のために300 mlの組織固定液に浸漬します。その後、胎盤全体を立方体状に切断します。生理食塩水でキューブを繰り返し洗浄し、生理食塩水が透明になるまで血球を除去します。次に、胎盤膜を取り除き、組織を細切して、血管をさらに除去し、石灰化部位を露出させます。その後、血管を鉗子でしっかりと保持し、細切した組織を除去します。その後、細切した胎盤をブフナー漏斗に入れ、100 mlの生理食塩緩衝液で組織を洗浄します。細切した組織が30～35 g得られるまで細切を続け、氷上のウェイイングボートに移します。続いて、細切した胎盤組織をトリプシン処理用フラスコに加えます。次に、調製した消化液1を150 ml、トリプシン処理用フラスコに移し、十分に混合します。トリプシン処理用フラスコを振盪恒温水槽に30分間置き、消化を均質にするため、5分ごとに手動でフラスコを混ぜ合わせます。一次消化の終了後、トリプシン処理用フラスコを水槽から取り出し、45度の角度に傾けて1分間保持し、胎盤組織を沈殿させます。10 mlの滅菌ピペットを用いて、組織を吸引しないように注意しながら、上清を約80 ml取り除いて廃棄します。その後、100 mlの消化液2をトリプシン処理用フラスコに移し、十分に混ぜ合わせます。トリプシン処理用フラスコを振盪水槽に30分間置き、均一に消化させるため、5分ごとに手動でフラスコを混ぜ合わせます。2回目の消化が終わったら、トリプシン処理中のフラスコをウォーターバスから取り出し、45度の角度に1分間傾けます。上清を80 ml取り出し、100 µmメッシュのセルストレーナーを用いて遠心チューブに緩やかに移します。3回目と4回目の消化を行い、2回目、3回目、および4回目の消化で得られた上清を、15 ml遠心チューブに13.5 mlずつ分注します。次に、各チューブの底部に1.5 mlのFBSをゆっくりと慎重に加え、分離層を形成させます。室温で20分間、チューブを遠心分離します。その後、上清層とFBS層を、2つの層の間にある白い膜とともに吸引して廃棄します。ペレットを1 mlの温めた細胞培養培地で再懸濁します。すべてのチューブから再懸濁した細胞を回収し、消化1回につき1本のチューブにまとめます。次に、温めた細胞培養培地を加えて全量を15 mlにします。室温で10分間、細胞を遠心分離します。その後、バキュームポンプを用いて上清を除去し、ペレットを吸引しないように注意してください。続いて、1 mlの温めた細胞培養培地でペレットを穏やかに再懸濁します。すべての消化液が入ったチューブの内容物をまとめます。温めた細胞培養液を追加し、最終容量を8 mlにします。次に、細胞懸濁液を分離勾配の上に静かに重層し、室温で30分間遠心分離します。遠心分離後、バックライトを用いて勾配中の異なる細胞層を特定します。40%から50%の密度勾配分離用培地の間に存在する、栄養膜細胞および混入細胞を含む層を確認し、上層を真空ポンプで除去します。続いて、目的の層にある細胞を回収し、50 ml遠心チューブに移します。細胞培養培地を加えて50 mlに定量をし、室温で10分間遠心分離します。無菌条件下で、ステップ1.2.22で凍結した細胞を37°Cのウォーターバスで迅速に融解させます。融解した細胞を50 mlチューブに移し、20 mlの冷 running bufferで穏やかに再懸濁します。次に、チューブを4 °Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、冷えたランニングバッファーで洗浄ステップを繰り返します。その後、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を算出し生存率を決定し、再度遠心分離を行います。その後、上清を注意深く取り除き、1% (v/v) のマウス anti-HLA ABC 抗体を含む冷 running buffer 1 ml を細胞に加えます。細胞を 4 °C で30分間インキュベートし、5分ごとに穏やかに混合します。インキュベーション後、冷 running buffer 6 ml を加え、4 °C で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、この手順を繰り返します。次に、10% (v/v) の抗マウス二次抗体結合磁気ビーズを含む冷 running buffer 1 ml で細胞を再懸濁します。その後、細胞を 4 °C で30分間インキュベートし、5分ごとに再び緩やかに混ぜ合わせます。続いて、冷やしたランニングバッファーを 6 ml 加え、4 °C で 5 分間遠心分離します。上清を捨て、細胞を 5 ml の冷やしたランニングバッファーに再懸濁します。その後、磁気精製装置を用いてトロホブラスト細胞を分離し、ネガティブポートで細胞を回収します。20 mlの冷やしたランニングバッファーを細胞に加え、4 °Cで5分間遠心分離します。上清を捨て、生存率を決定するための細胞計数の前に、10% FBSを含む20 mlの温めた一次細胞培養培地で細胞を穏やかに再懸濁します。次に、細胞を播種し、37 °C、5% CO2の条件下でインキュベートします。少なくとも4時間後、温めた培養液で細胞を2回洗浄し、付着しなかった細胞を除去します。次に、プレートを8%O2で満たされた常酸素チャンバーに移します。フードの外で、チャンバーの入口ポートをガスホースに接続し、ガスのチューブに繋ぎます。チャンバーの入口ポートと出口ポートの両方を開き、ガスレギュレーターは閉じたままにします。その後、ガスレギュレーターのバルブを慎重に開き、25 liters per minuteの空気流量で4分間フラッシングし、チャンバー内部の空気を完全に置換します。チャンバーのフラッシング後、ガスレギュレーターを閉じ、続いてチャンバーの入口および出口ポートを閉じます。フローメーターの出口ホースをチャンバーの入口ポートから外し、チャンバーを37°Cの細胞培養インキュベーターに1時間置きます。25 L/minの流量で4分間ガスを再充填し、プレートやフラスコ内、および培養液に溶解している現在の空気を置換します。この図は、絨毛性トロホブラストの分化過程におけるβ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン分泌に対するメラトニンの影響を示しています。絨毛細胞栄養膜細胞から合胞体栄養膜細胞への生化学的分化は、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピンの値の上昇によって判定され、ここに示すように、細胞培養後72時間で最大値に達しました。8%酸素下で培養した細胞栄養膜細胞の分化に対するメラトニン処理の影響は、溶媒対照と比較して認められませんでした。ここでは、72時間の培養後に誘導した正常酸素または低酸素再酸素化条件下における、合胞体栄養膜細胞内の細胞内活性酸素種レベルに対する1 millimolar メラトニンの影響を示しています。メラトニン治療は、活性酸素種（ROS）のレベルを正常酸素レベルまで回復させることで、低酸素再酸素化による酸化ストレスの増大から合胞体化栄養膜細胞を保護します。このシェマは、初代合胞体化栄養膜細胞において、低酸素再酸素化に起因する酸化ストレスおよびミトコンドリアアポトーシスに対するメラトニンの広範な細胞間保護効果を示しています。この単離技術を習得すれば、8時間で完了させることができ、適切に実施すれば3時間で精製された栄養膜細胞を得ることが可能です。低酸素-再酸素化法を用いた細胞栄養性絨毛細胞の分離精製および初代細胞培養技術の開発は、妊娠合併症の理解を深め、胎盤および胎児の健康を改善するための道を切り開きました。この手順を行う際は、免疫精製の最後に、フローサイトメトリーなどを用いて絨毛栄養膜細胞の純度を評価することが重要です。このビデオを視聴することで、免疫精製された一次絨毛細胞外栄養膜細胞の単離方法と、低酸素・再酸素化条件下での培養方法について十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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メラトニンに対する低酸素/再酸素化誘発性の破壊の保護効果を研究するために、ヒト初代栄養膜細胞培養モデル

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