前立腺癌および他の年齢に関連した病状または代謝疾患における生物物理トリガーとして基底膜剛性を研究する方法

このモデルの全体的な目標は、進行糖化と製品への曝露による基底膜の剛性と厚さが、転移性前立腺がんの初期および進行段階に対応する浸潤細胞の挙動をどのように調節できるかを調査することです。この方法は、加齢に伴う病状分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、基底膜の硬さと厚さの増加ががんの進行にどのように寄与するか、また糖尿病のような代謝障害にも寄与するかなど。

この技術の主な利点は、臨床現場でヒト前立腺腫瘍で測定された剛性のレベルを模倣するための簡単な方法を提供することです。この技術の意味は、基底膜の硬化が分子および細胞の変化をどのように促進するかについての理解を深めることにより、前立腺がんの治療と診断にまで及びます。この方法に不慣れな人は、モデルが学際的であるため、苦労するかもしれません。

化学、物理学、生物学の技術を結集。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、前立腺の基底膜の硬さが既知の形質転換上皮細胞のde novo侵襲性行動を促進するという仮説を立てたときでした。この方法のビデオデモンストレーションは、学際的なステップを説明する必要があるため、非常に重要です。

基底膜の架橋、それに続く3D細胞培養を含みます。まず、氷の表面を均一に用意し、それを使用して8ウェルチャンバーのスライドガラスを摂氏4度に冷却します。次に、200マイクロリットルのピペットチップの端を切り取り、チップも摂氏4度に冷却します。

冷めたら、チップを200マイクロリットルの容量のピペッティングエイドに置きます。そして、それを使用して、40マイクロリットルの氷冷BMマトリックス溶液を、冷却された8ウェルチャンバーガラススライドの各ウェルに移します。次に、チャンバースライドを摂氏37度で30分間置き、基底膜の重合を促進します。

液体再構成された基底膜を乱さないように、インキュベーターのドアを非常に慎重に閉めてください。ちょうど30分後、調製したグリコールアルデヒド溶液250マイクロリットルを加えて、重合し再構成された基底膜を覆います。次に、250ミリリットルの滅菌PDSを天然の再構成基底膜ゲルに添加することにより、ネガティブコントロールを調製します。

また、基底膜ゲルに添加する前に、50ミリモルのシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは250ミリモルのアミノグアニジンをグリコールアルデヒド溶液に添加することにより、2つの追加のコントロールを準備します。次に、ゲルを摂氏37度で6時間インキュベートして、半硬質のゲルを作製します。または、14時間かけて硬いゲルを作ります。

インキュベーション後、ゲルから溶液を慎重に取り出し、各ゲルに250マイクロリットルの1モルグリシンエチルエステルを加えます。そして、それらを摂氏37度で1時間インキュベートします。各ゲルを500ミリリットルのPBSで10回洗浄し、グリコールアルデヒド溶液とグリシンエチルエステルの痕跡をすべて取り除きます。

次に、脱水を防ぐために400マイクロリットルのPBSを追加し、再構成した基底膜ゲルを摂氏37度で一晩インキュベートします。続行する準備ができたら、再構成した基底膜ゲルからPBSを取り出し、各ウェルに250マイクロリットルの氷冷二重蒸留水を追加します。ゲルを摂氏4度で16〜24時間インキュベートし、マトリックスが完全に液化していることを確認します。

次に、液化した基底膜を1.5ミリリットルのチューブに移し、分光光度計を使用して溶液の蛍光発光を測定します。次に、溶液を遠心分離し、得られた上清を取り除きます。ペレットを500マイクロリットルあたり20ミリグラムの臭化シアンと70%ギ酸を含む溶液に再懸濁します。

サンプルを室温で一晩インキュベートします。次に、1ミリリットルの使い捨てシリンジを使用して、再懸濁した基底膜ゲルを分子量カットオフが3.5キロダルトンの透析カセットに移します。カセットを500ミリリットルのガラスビーカーに沈め、500ミリリットルの二重蒸留水を入れます。

そして、磁気攪拌棒で水をかき混ぜます。このセットアップを摂氏4度で一晩置き、臭化シアンとギ酸の痕跡をすべて取り除きます。1ミリリットルの使い捨て注射器を使用して、ダイヤルされた溶液をカセットから1.5ミリリットルのチューブに移します。

次に、溶液を12%ポリアクリルアミドゲル上で分析します。ゲルを銀染色液で染色し、臭化シアンマトリックスペプチドの電気泳動パターンを可視化します。PBSで覆われた基底膜ゲルから始めて、0.1ミリモルの塩化カルシウムを含む300マイクロリットルのPBSで、ゲルをさらに2回すすぎます。

そして0.5ミリモルの塩化マグネシウム。室温で5分間。次に、PBSを取り外し、再構成された各基底膜ゲルを覆うために300マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを追加します。

ゲルを室温で30分間インキュベートし、再構成した基底膜成分を固定します。次に、固定剤を取り除き、75ミリモルの塩化アンモニウムと0.5ミリモルの塩化マグネシウムを含む300マイクロリットルの急冷溶液を追加します。溶液を室温で5分間インキュベートし、溶液を取り出してさらに4回すすぎを繰り返します。

最終すすぎ後、再構成した基底膜ゲルに300マイクロリットルの免疫蛍光緩衝液を添加して、非特異的反応を防ぎます。ゲルを溶液中で室温で2時間、振とうプラットフォーム上でインキュベートします。次に、免疫蛍光ブロッキングバッファーを取り出します。

さらに、ブロッキングバッファーで希釈した300マイクロリットルの一次抗体を添加します。再構成した基底膜ゲルを摂氏4度で16時間インキュベートします。翌日、一次抗体を取り出し、300 μLの免疫蛍光緩衝液でゲルを3回洗浄します。

各バッファー添加後、室温で振とうプラットフォーム上でゲルを10分間振とうします。次に、バッファーを取り出し、ブロッキングバッファーで希釈した蛍光標識二次抗体300マイクロリットルを加えます。サンプルを振とう台に置き、ゲルを室温で2時間インキュベー

二次抗体を取り出します。サンプルを免疫蛍光緩衝液ですすぎ、続いてPBSですすぎ、次にサンプルを2回目に固定して急冷します。最後に、ゲルをマウントし、顕微鏡を使用して緻密なバンドルの形成を分析します。

前立腺房を形成するには、300マイクロリットルの完全KSFMで5, 000個のRWPE-1細胞を希釈し、基底膜溶液の2%を添加します。前立腺腫瘍細胞凝集体の場合、300マイクロリットルのRPMI-1640培養培地に2,500個のPC3細胞を希釈し、基底膜溶液の2%を添加します。再構成した基底膜ゲルをPBSで一晩インキュベートした後、500マイクロリットルの培地で2回すすいでください。

細胞を播種する前に。細胞を、天然および進行糖化最終産物で硬化させた再構成基底膜に穏やかに播種します。そして、培養物をインキュベーターに慎重に配置して、成長するアシニとスフェロイドが均一に分布するようにします。

アシニ形成細胞については、基底膜溶液の2%を含む新鮮な培養培地と2日ごとに培地を交換します。細胞が正常な腺房恒常性に必要な成長因子を持っていることを確認するため。培養で6日後、前立腺上皮細胞は、天然の再構成基底膜上に腺房を形成します。

そして、上皮細胞の均一なスフェロイドに組織化されています。これらのアシニは、頂端から基底の極性、および可視の管腔空間を持つ高度に組織化されたPECの特性も持っています。硬化したメンブレンで6日間培養すると、細胞の構造が破壊されます。

そして、形が回転楕円体から多角形に変わります。さらに、これらのアシニは非常に無秩序です。そして、先端を基底極性に失い、管腔が小さいか存在しない

これは、良性前立腺肥大症の影響を受けた前立腺に由来する細胞にも当てはまります。前立腺腫瘍細胞を測定したところ、細胞は硬く再構成された基底膜上でより長く存在し、また、より速く移動し、細胞の持続性が増加していることがわかりました。このビデオを見れば、上皮細胞と腫瘍細胞の挙動に対する基底膜の硬化の影響をモデル化する方法を十分に理解できるはずです。

この手順を試行する際には、基底膜の硬化が望ましいレベルに誘導され、個々のアシニまたはs-スフェロイドが適切に形成されることを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、腫瘍学の分野の研究者が前立腺の基底膜硬化によるがん細胞浸潤の誘導を探求する道を開きました。このプロトコールに続いて、細胞ライセートのイムノブロッティングのような他の方法を実施して、基底膜の硬さによって調節されるシグナル伝達経路に関連する追加の疑問に答えることができます。

シアノ水素化ホウ素ナトリウム、臭化シアン、ギ酸の取り扱いは非常に危険である可能性があり、ヒュームフードでの作業中に白衣、手袋、フェイスシールド、マスクを着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。