Name: 前立腺癌および他の年齢に関連した病状または代謝疾患における生物物理トリガーとして基底膜剛性を研究する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: 学ぶ前立腺がんにおける基底膜剛性の影響。AGEsによる硬化と厚さの変化が浸潤性細胞行動に与える影響を模擬する手法を解説。化学・物理・生物学を統合した多領域アプローチで、がん進行の理解と治療診断の改善に貢献する。

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BPH-1細胞について、Simon Hayward氏(Vanderbilt University Medical Center)に感謝します。また、Thomas Cox氏とJanine Erler氏(コペンハーゲン大学バイオテクノロジー研究イノベーションセンター)には、レオロジー測定の支援をしていただきました。MR-Tは、Worldwide Cancer Research(旧The Association of International Cancer Research)(JSに助成金08-0803)、英国大使館モンテビデオ、およびAgencia Nacional de Investigacion e Innovacion(UK_RH_2015_1_2からMR-T)によって資金提供されました。三菱商事は、Prostate Cancer UK(Grant S14-017 to JS and GS)の支援を受けました。KWは、中国奨学金評議会から資金提供を受けました。MAMは、サウジアラビア文化局から資金提供を受けました。

<ol><li>Timpl, R., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+assembly+of+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Supramolecular assembly of basement membranes.</a> Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).</li>
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<li>To, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-induced+morphological%2C+biomechanical%2C+and+compositional+changes+in+ocular+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes.</a> Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).</li>
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<li>Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+responsive+adult+human+prostatic+epithelial+cell+lines+immortalized+by+human+papillomavirus+18%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18.</a> Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).</li>
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<li>Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+prostatic+carcinoma+cell+line+%28PC-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Urol%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3).</a> Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).</li>
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<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%3A+a+10-year+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).</li>
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<li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li>
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<li>Caley, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+Endo180+requires+stromal-derived+LOX+to+promote+metastatic+prostate+cancer+cell+migration+on+human+ECM+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces.</a> Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).</li>
<li>Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+uPAR+requires+Endo180+for+rapid+directional+sensing+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis.</a> J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).</li>
<li>Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes+generate+localized+Rho-ROCK-MLC2-based+contractile+signals+via+Endo180+to+promote+adhesion+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly.</a> J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).</li>
<li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+Outcome+and+EMT+Suppression+Mediated+by+a+Lectin+Domain+Interaction+of+Endo180+and+CD147%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147.</a> Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
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<li>Hoyt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+elasticity+properties+as+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer.</a> Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).</li>
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<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+viscoelastic+properties+of+human+prostate+correlated+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology.</a> Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

純粋なRBMゲル6でのMECから3D腺腺房の世代のためのプロトコルは、私はRBM行列にコラーゲンを4mg / mlのタイプの添加により、以前の研究で変更されました。コラーゲンの添加は175±37 1589年に±380パスカルから増加RBMゲルの弾性率が得られました。剛性のこの9.1倍の増加がのMEC 21の成長、生存、遊走および分化を変調しました。 - （ - ） - RBMゲルに添加されたI型コラーゲンの非酵素的架橋を促進するためにリボースプロトコルがDでの処理工程を含むことにより再び変更されました。剛性の結果として得られる15倍の増加は、それらの侵襲的挙動22を促進するためのMECの発癌性形質転換と協同することが見出されました。 RBMゲルにI型コラーゲンを追加する実験的アプローチは、間質との間の物理的な障壁後のヒトの組織に発生したコラーゲン繊維とのMECの直接的な相互作用を容易にし、そして、BMが提供する上皮は、タンパク質分解を受けます。純粋なRBMゲルGLAで前処理でのPECから3D腺腺房を生成することにより、現在のプロトコルは、BM剛性自体がその侵襲性の挙動（ 図3）をトリガする方法を研究する道を開きます。このプロトコルで誘導されたBM剛性のレベルは生理的関連性を持っています。 6時間および14時間、50 mMのGLAとのインキュベーションは、それぞれPBS（ 表1）で処理されたRBMゲルで122±55パスカルに比べて175±90および322±160に純粋なRBMゲルの弾性率を増加させました。 RBM剛性のこの1.7から3.2倍の増加が、正常な前立腺またはBPH組織23-26と比較して、悪性で観察された剛性の2.5〜3.4倍の増加を再現します。最近の刊行物13で概説したようにPEC腺房におけるAGEとRBM剛性の蓄積によって誘導される形態学的変化は、ARからの統計学的に有意なシフトを定量化することができます多角形状にounded、管腔/総腺房面積、およびAGE-豊富なRBM（ 図3）にacinaから移行突出した細胞を減少させました。免疫ブロッティングも硬いRBM（ 図3）対正常に成長したPECに（E-カドヘリン13の例えば損失）と収縮挙動（ 例えば 、リン酸化ミオシン軽鎖-2、pMLC2 13）EMTのマーカーを評価するために使用することができます。さらに、免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡を用いて評価BM（ 例えばラミニン、コラーゲンIVおよびAGE蓄積13）を視覚化するために適用することができ、細胞の頂端対基底極性（ 例えば 、頂端EEA1の局在：早期エンドソーム抗原1;及びGM130：130 kDaのシス-ゴルジマーカー13）および接着分子の細胞パターン（ 例えば E-カドヘリンの局在化、細胞-細胞接合部13）（ 図3）。 <img aLT =「図3」SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; 図3：ここで紹介するさまざまなプロトコルの概要図は（硬いRBMを分析する方法、硬いRBM上に細胞を播種するためにどのように、グリコールアルデヒド（メイラード反応）で再構成基底膜（RBM）を準備し、補強する方法を示していますメイラード反応の程度）とAGEリッチRBMにより誘導される細胞および分子の変化を分析するために使用され得る手順。 AGE、糖化最終産物; BM、基底膜; DAPI、4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール; EEA1、早期エンドソーム抗原1。 GAPDH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ。 GLA、グリコールアルデヒド; GEE、グリシンエチルエステル; GM130、130 kDaのシスゴルジマーカー; P-MLC2（Thr18 / Ser19）、ミオシン軽鎖-2部位でリン酸化は18とセリン19トレオニン; RBM、再構成基底膜; SDS-PAGE、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動。 RWPE1腺房スケールバーのため= 10ミクロン; PC3腫瘍細胞のためのスフェロイドのスケールバー=100μmです。この図は、基準13から変更されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> - （ - ） - リボースRBMの架橋剤として選択され、Dは場合トラブルシューティング手順が必要となります。 - （ - ） - 72時間リボース、以前にRBM /コラーゲンゲル22について記載したように、RBMゲルの脱水及び収縮をもたらしプロトコルの開発中には、1 MのDでの処置がことがわかりました。 Dの低濃度の評価 - （ - ） - リボース及び短い処理時間がこの制限を克服するのを助けることができます。 RBM剛性の高いレベルが望まれる場合、プロトコルの将来のアプリケーションの潜在的な制限が発生する可能性があります。より長いインキュベーション時間およびGLAのより高い濃度がRBMゲル剛性の高いレベルを誘導するために使用されている場合には、する必要があります<html>以前に13を説明したように、これらの処理条件は、細胞の生存および増殖に影響を与えるかどうかを評価します。また、血清とRWPE-1細胞のインキュベーションは避けるべき血清または血清含有材料への表現型EMT様移行および露出を誘導することに留意すべきです。実験は短い性RNA（siRNA）オリゴヌクレオチド、干渉のトランスフェクションを含む場合、例えば、手順は、低血清トランスフェクション培地に細胞を切り替えることなく、KSFM中で増殖させたRWP​​E-1細胞を使用して最適化されるべきです。この欠点は、一時的なsiRNAを使用してモデルに近づくときに達成遺伝子サイレンシングのレベルを損なう可能性があります。いくつかのタンパク質標的に対しては、調整可能な遺伝子サイレンシングおよびタンパク質レベルにおける所望の減少を誘導可能なshRNAベクターを使用することが賢明でしょう。間質細胞または腫瘍細胞関連リシルオキシダーゼ（LOX）17による酵素架橋を組み込む適応はまた、将来のモデルに組み込むことができます。 jove_contentは &quot;&gt;このプロトコルは、プロ侵襲のPECにAGE-依存BM剛性によってトリガメカニズム（RWPE-1、BPH-1）および浸潤性のPTC（PC3）における抗転移目標の評価の今後の研究を促進します。BPHことを考えます代謝障害27であると考えられ、このプロトコルはまた、代謝性疾患および前立腺癌のリスクを増加させたとの間のリンクの私達の理解向上に向けての道を開く。AGEsのへの曝露によって誘導さBMの剛性が他の癌における侵襲性のトリガーとすることができることを考えます種類は、それが他の臓器（ 例えば 、乳癌、結腸、卵巣、膵臓）から正常上皮細胞と腫瘍細胞を組み込んで同様のモデルを設定するためのプロトコルを使用する対象としています。 一緒にタイミングとプロトコル内の重要なステップは、 図4に要約されている。最初のステップの間に、そのPOLを防止するために解凍しながら4℃でRBMのストック溶液を維持するために不可欠ですymerization。彼らは4℃に冷却されるまで、ピペットチップは、RMストック溶液の中に置くべきではありません。次のステップのために、それらはRBM液を塗布する前に、チャンバースライドを4℃に平衡化していることを確認することも重要です。できるだけ早くRBM溶液の温度が4℃を超えて上昇されるように、ゲルを形成する不可逆的な重合を受けます。必須のRBMは、それがあっても、細胞培養及び顕微鏡分析に適した表面を形成することを保証するために、重合段階中に妨害されません。メイラード反応（シアノ水素化ホウ素ナトリウムとamingoguanidine）の阻害剤の有無にかかわらずGLAとのインキュベーションの期間は、RBMゲルはどうなるか硬いかを決定します。堅い条件が必要とされるかどうかは（ 表1）半堅い条件が必要な場合GLAで6時間のインキュベーションを使用することをお勧めし、14時間のインキュベーションされます。 GLAの代替インキュベーション時間または濃度が異なるレベルならば使用することができます剛性が望まれます。この場合、RBMゲルのレオロジー解析は必須の工程として組み込まれる必要があります。 GEEとのインキュベーションおよびPBSでのその後の洗浄工程によりメイラード反応をクエンチする工程に続いて、RBMゲルはすぐに使用することができ、または前の細胞培養のためのそれらの使用を最大48時間、4℃で保存しました。細胞培養物を設定したら、2日ごとに（任意の処理を含む）培地を変更することが重要です。調査対象のパラメータに応じて3-12日間の3D細胞培養を維持することをお勧めします。 3D PECについては、6日後、および3D PTCスフェロイド分析のための培養液を分析することをお勧めします腺房は、最初のインスタンスでの培養の3日後にお勧めします。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> 図4：重要なステップとタイミングとプロトコルの簡単な概要示さフロワット図が示された重要なステップとタイミングでグリコールアルデヒド（メイラード反応）で再構成基底膜（RBM）を準備し、補強する方法を示しています。プロトコルが停止することができ、及びRBMゲルが格納ポイントも示されています。 RBM、再構成基底膜; GLA、グリコールアルデヒド; GEE、グリシンエチルエステル; ON、一晩。 PBS、リン酸緩衝生理食塩水。 RT、室温が。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

基底膜(BM)は、上皮細胞の層を間質1から分離することにより、安定した組織境界を維持する特殊な細胞外マトリックス(ECM)のシートです。BM中のコラーゲンIVの隣接する三重らせん間の共有結合架橋は、超ねじれたらせんの不規則なネットワークを確立することにより、それらの横方向の結合を安定させます2。これらのIV型コラーゲン格子は、ラミニンや他のBM成分との相互作用の足場として機能します1。BMの構造的配置は、腺上皮3の正常な発達に必要な機械的強度と剛性を提供します。
老化と病気の間に、BMは徐々に厚くなり、硬くなります3,4。例えば、眼球BMの弾性率(E)は、正常集団では50歳から80歳の間に3倍に増加し、この硬化は糖尿病5のような代謝障害ではさらに悪化します。BMの構造的および生体力学的変化によりBMの剛性が増大するのは、ECM成分であるIV型コラーゲンとラミニンが、終末糖化産物(AGEs)にさらされた後に非酵素的に架橋されたときに起こります。
ここで説明した方法の目的は、転移性前立腺癌(PCa)への切り替えの文脈で、AGE曝露によるBM硬直が前立腺上皮細胞(PEC)と前立腺腫瘍細胞(PTC)の浸潤性をどのように促進するかを調査するためのモデルを確立することでした。これを行うために、再構成されたrBMゲル6中の乳腺上皮細胞(MEC)から3D腺房を生成するために使用されていた以前の方法が、rBMゲルをグリコールアルデヒド(GLA)で前処理する追加のステップを含むように適合された。GLA誘起架橋および前処理されたrBMゲルの硬化を評価するためのいくつかの技術について、測光分析、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS PAGE)、共焦点顕微鏡法、レオメトリック分析などについて説明します。予め硬化したrBMでの培養用に選択された前立腺細胞型には、以下が含まれる:RWPE-1、正常な前立腺に由来するPECs7;BPH-1、BPH8の影響を受けた前立腺に由来するPEC;PC3、前立腺がん(PCa)患者の椎骨に位置する二次腫瘍に由来する転移性PTC9。
前立腺の病理学の研究を前進させることに加えて、GLAによる治療によるrBMゲルの硬化のためのプロトコルは、BMの硬さが他の加齢関連の病状や代謝障害にどのように寄与するかを調査するために適応させることができます。例えば、このモデルは、適切な細胞タイプの取り込みにより、乳房、結腸、卵巣、膵臓などの臓器のBM硬化によって転移性がんがどのように誘発されるかを調べるために直接適用できます。さらに、このプロトコルは、硬いBMが糖尿病関連の微小血管疾患、網膜症、腎症、神経障害における疾患進行の生体力学的メカニズムをどのように促進するかを調査するために適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>I - 単層培養用材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BPH-1</td><td>CaP細胞株データベース</td><td>PCaCL-132</td><td>連絡先: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td></tr><tr><td>完全なケラチノサイト無血清培地&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17005-0753</td>で<td>温まらないでください。C使用前の</td></tr><tr><td>子牛胎児血清&nbsp;</td><td>First Link UK Ltd</td><td>02-00-850</td><td>-20 & ordm;アリコートPC3</td></tr><tr><td>のC&nbsp;</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>CRL-1435</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(ダルベッコA)錠剤</td>オ<td>キソイド</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640培地&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td>37 & ordmで暖かい。使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>RWPE-1&nbsp;</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>CRL-11609</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>II - 3D培養用材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>アミノグアニジン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>396494</td><td>目、呼吸器系、皮膚に刺激を与える</td></tr><tr><td>チャンバースライド、8ウェル&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td><td>TKT-210-816M</td><td></td></tr><tr><td>培養マトリックス再構成基底膜(rBM)還元成長因子抽出物&nbsp;</td><td>AMS Biotechnology</td><td>3445-005-01</td><td>-80 & ordm の地下膜 (BM) の保管。アリコート中のC</td></tr><tr><td>臭化シアン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C91492</td><td>皮膚接触および吸入による毒性</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td></td></tr><tr><td>グリシンエチルエステル塩酸塩 (GEE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50060</td><td>目への刺激</td></tr><tr><td>グリコールアルデヒド二量体 (GLA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6805</td><td></td></tr><tr><td>シアノボロヒドリドナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>非常に可燃性。接触皮膚および吸入による毒性</td></tr><tr><td>シリンジフィルター 0.22ミクロン</td><td>アップルトンウッズ</td><td>BC680</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>III - メイラード反応を定量化する材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>D3571</td><td>感光性 -20 &ordm;アリコート中のC</td></tr><tr><td>クローニングシリンダー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L) Alexa Fluor 488 コンジュゲート</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>感光性</td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ IgG (H+L) Alexa Fluor 488 コンジュゲート</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>感光性</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td>-20 & ordm;アリコート</td></tr><tr><td>Vectashield封入剤のC&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗ペントシジン クローン PEN-12 mAb</td><td>TransGenic Inc</td><td>KH012</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>-20 & ordm;アリコート中のC</td></tr><tr><td>ウサギ抗ヒトコラーゲンIVポリクローナル抗体&nbsp;&nbsp;</td><td>Acris Antibodies</td><td>R1041</td><td>ストアは-20 & ordm;アリコートのC</td></tr><tr><td>ウサギの抗ラミニンA / C pAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-7292</td><td>-20 &ordmで保存。アリコート中のC</td></tr><tr><td>ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル(Triton-X100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート(Tween-20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>透析カセット Slide-A-Lyzer</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>66333<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>IV - 機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARG2制御回転レオメーター</td><td>T.A. Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert S100(倍率20倍)顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio S100顕微鏡用CO2制御加湿インキュベーションチャンバー</td><td>ソレント サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点軸軸 200M (40倍、倍率63倍) 顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オリンパス LH50A 位相差を使用したデジタルカメラ付き顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar Plus プレートリーダー分光光度計</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>企業</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>V - Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 1.47v</td><td>National Institute of Health,米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

前立腺癌および他の年齢に関連した病状または代謝疾患における生物物理トリガーとして基底膜剛性を研究する方法

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

ここでは、加齢に関連する病状および代謝障害（ 例えば、癌、糖尿病、微小血管疾患、網膜症、腎症および神経障害）の間に増加した厚さと基底膜（BM）の剛性に関連する生物物理学的微小環境を研究するために使用可能なプロトコルを記述する。モデルの前提は、メイラード反応を介して、糖化最終産物（AGE）の生成を促進するためのグリコールアルデヒド（GLA）で処理することによって再構成されたBM（RBM）行列の非酵素的架橋です。 AGEの生成、非酵素的架橋を確認するために使用され、GLAで剛性を向上させることができる実験技術の例としては、RBMが概説されて処理されました。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドにより測光分析によるそのAGE含有量および免疫蛍光顕微鏡法、その非酵素的架橋：これらは、決意のネイティブRBM（リン酸緩衝生理食塩水、PBSで処置した）および堅いRBM（GLAで処理された）の調製を含みますレオメトリーを用いてゲル電気泳動（SDS-PAGEの）だけでなく、共焦点顕微鏡、及びその剛性の増加。ここで説明する手順は、罹患したヒト前立腺組織に対して健康で行われる測定と一致して、3.2倍までRBMの剛性（弾性率、E）を増加させるために使用することができます。老化や病気の前立腺に関連した生物物理学的微小環境を再作成するには、3つの前立腺細胞型がネイティブRBMと硬いRBM上に導入された腺：RWPE-1、正常前立腺由来の前立腺上皮細胞（PECの）; BPH-1、良性前立腺肥大症（BPH）の影響を受け前立腺に由来するのPEC。そして、PC3、転移性細胞は、前立腺癌に由来する二次骨腫瘍由来します。複数のパラメータは大きさ、形状および剛性RBM対ネイティブのRWPE-1及びBPH-1によって形成された3D腺腺房の侵襲的特性、平均セル長、遊走速度および3D spherの細胞運動の持続性を含む、測定することができます。同じ条件下で、PC3細胞によって形成されたOID。経路およびタンパク質の細胞内局在を細胞シグナル伝達も評価することができます。

スティッフRBM上の3D前立腺腺房培養文化の中で6日後、のPECが正常な前立腺組織由来（RWPE-1）（ 図1A）およびBPH組織（BPH-1）上皮の均一な球状体に編成されている（ 図1B）は、ネイティブ（PBS処理）RBM上のフォーム腺房細胞。これらの腺房はまた、頂端ツー基底極性と可視管腔スペース13,20と高度に組織化されたPECの特徴を有しています。 剛性化（AGE-リッチ）RBM（GLAで処理された）上で正常前立腺組織（RWPE-1）（ 図1A）由来のPECとBPH組織（BPH-1）（ 図1B）によって形成された腺房が中断アーキテクチャ（シフトを持っています回転楕円体からの多角形に形状や細胞AGE-豊富なRBM）（ 図1A）に房からの移行/突出インチこれら<html>腺房も小さくまたは存在しない管腔空間13とその頂端ツー基底極性を失った非常に無秩序のPECを特徴とします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> 図1：ネイティブおよびスティッフ再構成基底膜（RBM）に3D腺腺房として成長した前立腺上皮細胞 （A）RWPE-1細胞の明視野画像は、PBS（ネイティブ）またはで処理されたRBMゲル上で6日に12時間まで増殖させ14時間（;堅いAGE-リッチ）のための50mMのグリコールアルデヒド; =50μmのスケールバー。パネルAに記載のように増殖させた（B）BPH-1細胞。スケールバー=50μmの。データは3つの独立した実験の代表である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html>表1 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; 表1：ネイティブ、セミスティッフとスティッフ再構成基底膜（RBM）上に成長した前立腺上皮RWPE-1房の特性 RWPE-1房がRBM上で成長させた14時間（ネイティブ）のために、PBSで前処理し、グリコールアルデヒド（GLA。 ）6時間（半堅い）または14時間（硬い）のためにGLA。腺房形状については、割合（％）は、円形の標準偏差（SD）を±、半多角形、および多角形の腺房（50腺房条件ごとに定量）5つの独立した実験から計算しました。相対的な腺房の大きさは、3つの独立した実験からの（ネイティブRBM = 100％）を算出しました。侵襲性のために、一つ以上の突出した細胞とSDの腺房±％は、3つの独立した実験から計算しました。倍数変化は、天然の状態の対応する値によって、半剛性または剛性の条件下で得られた平均値で割ることによって計算されます。 P値は、スチューデントのt検定（α= 0.05）を用いて計算しました。 ontent「FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt; AGE依存増加RBM剛性はPC3前立腺腫瘍細胞の遊走を促進します PC3細胞はAGE-リッチ（硬い）上に成長させたのに対し、ネイティブRBM上に成長したPC3細胞は互いに（ 図2A）から独立して、連続的な細胞-細胞接触を維持することによって、RBMの動きを移行します。培養PC3細胞における72時間がネイティブに巣（スフェロイド）を形成した後、スフェロイドからないと独立して（ 図2B）を移行硬い（AGE-リッチ）RBM上のPC3細胞に対し、RBMを（PBS処理します）。堅い（AGE-リッチ）RBM上のPC3細胞は、天然のRBM（ 図2C）上に成長させたPC3細胞よりも細長いです。硬いRBM上のPC3細胞は、天然のRBM（ 図2D）上に成長させたPC3細胞よりも速く移行します。硬いRBM上のPC3細胞は、天然のRBM（ 図2E）上に成長させたPC3細胞と比較して、持続性の減少を表示します。 <img aLT = &quot;図2&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：ネイティブおよびスティッフ再構成基底膜（RBM）に前立腺腫瘍細胞の移動 （A）14時間PBS（ネイティブ）または50ミリモルのグリコールアルデヒドで処理されたRBMゲル上で増殖させたPC3細胞の明視野画像（AGE-豊富な、堅いです） 。細胞は、明視野顕微鏡（10倍対物レンズ）を使用して画像化し、12時間時間あたり1画像の取得率は軌道を生成するために、細胞追跡が続きます。示されている画像は、0、3、6、9、及び12時間後の時点に相当します。単一細胞の軌跡は12時間の時点について示されています。スケールバー=100μmです。 （B）PC3細胞を、72時間、天然または硬いRBM上で培養し、パネル（A）に記載されるように画像化しました。スケールバー=100μmです。詳細は、2倍の倍率で選択した領域を示しています。 （C）平均±SDセル長さ（μm）;ネイティブRBMと硬いRBMとの間に有意な差（p = 1.2×10 -23）。 （ <str細胞軌道から計算オング&gt; D）平均値±SD速度（ミクロン/時間）。ネイティブRBMと硬いRBMた（p = 0.004）との間に有意差。 （スタートからの細胞軌道、細胞軌道のT =全長の末尾にDが=距離比D / T）細胞運動の（E）平均値±SD持続。ネイティブRBMと硬いRBMた（p = 0.0007）との間に有意差。 CE&gt; 10細胞を分析したパネルの場合、データは3つの独立した実験の代表である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、架橋および終末糖化産物（AGEsの）によって誘導された基底膜（BM）の剛性の増加は、病理学的関連性を持っている生物物理学的微小環境をモデル化するためのプロトコルを説明します。

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

このモデルの全体的な目的は、糖化最終産物の曝露による基底膜の剛性と厚さの変化が、転移性前立腺がんの早期および進行期に対応する浸潤細胞の挙動をどのように調節するかを調査することです。この手法は、基底膜の剛性と厚さの増加が、がんの進行や糖尿病などの代謝性疾患にどのように寄与するかといった、加齢に伴う病理学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この手法の主な利点は、臨床現場で測定されるヒト前立腺腫瘍の剛性レベルを模倣するための簡便な方法を提供することです。この手法の意義は、基底膜の剛性がどのように分子および細胞の変化を促進するかについての理解を深めることで、前立腺癌の治療および診断にまで及びます。このモデルは多角的な専門分野にわたるため、この方法に不慣れな方は習得に苦労する可能性があります。化学、物理学、および生物学の分野の技術を組み合わせています。私たちは、前立腺の基底膜の剛性が、既知の形質転換上皮細胞における新規の浸潤挙動を促進し得るという仮説を立てた際に、初めてこの手法を考案しました。学際的な手順を説明する必要があるため、本手法のビデオによる実演が極めて重要となります。基底膜の架橋およびそれに続く3D細胞培養について。まず、氷で平らな面を作り、それを用いて8ウェルチャンバーガラススライドを4 °Cまで冷却します。次に、200 µLピペットチップの先端を切り取り、そのチップも同様に4 °Cまで冷却します。冷却後、チップを容量 200 µL のピペッティングエイドに取り付けます。これを用いて、氷冷した BM マトリックス溶液 40 µL を、冷却済みの 8 ウェルチャンバーガラススライドの各ウェルに分注します。その後、基底膜の重合を促進するため、チャンバースライドを 37 °C で 30 分間静置します。液状に再構成した基底膜を乱さないよう、インキュベーターのドアを非常に注意深く閉じてください。正確に30分後、準備したグリコールアルデヒド溶液を250 microliters加え、重合した再構成基底膜を覆います。次に、天然の再構成基底膜ゲルに滅菌済みのPDSを250 mircoliters加えることで、陰性対照を準備します。また、基底膜ゲルに加える前に、50 millimolarのシアノホウ水素化ナトリウムまたは250 millimolarのアミノグアニジンをグリコールアルデヒド溶液に添加し、さらに2つの対照群を準備します。その後、ゲルを37 degrees Celsiusで6時間インキュベートしてセミスティフ（半剛性）ゲルを作成します。または、14時間インキュベートしてスティフ（剛性）ゲルを作成します。インキュベーション後、ゲルから溶液を注意深く取り除き、各ゲルに1 Mのグリシンエチルエステルを250 µL加えます。その後、37 °Cで1時間インキュベートします。各ゲルを500 µLのPBSで10回洗浄し、グリコールアルデヒド溶液およびグリシンエチルエステルの残渣をすべて取り除きます。次に、脱水を防ぐために400 µLのPBSを加え、再構成した基底膜ゲルを37 °Cで一晩インキュベートします。準備が整ったら、再構成した基底膜ゲルからPBSを取り除き、各ウェルに250 µLの氷冷した二回蒸留水を加えます。マトリックスが完全に液状化するように、ゲルを4 °Cで16〜24時間インキュベートします。次に、液状化した基底膜を1.5 milliliterチューブに移し、分光光度計を用いて溶液の蛍光放出を測定します。その後、溶液を遠心分離し、得られた上清を除去します。ペレットを、20 mg/mLのシアノゲンブロマイドと70%formic acidを含む500 µLの溶液で再懸濁します。サンプルを室温で一晩インキュベートします。次に、1 mL使い捨てシリンジを用いて、再懸濁した基底膜ゲルを分子量カットオフ3.5 kDaの透析カセットに移します。このカセットを、500 mLの二回蒸留水が入った500 mLガラスビーカーに浸します。マグネチックスターラーで水を撹拌します。シアノゲンブロマイドとギ酸を完全に除去するため、このセットアップを4 °Cで一晩静置します。1 mLの使い捨てシリンジを用いて、カセットから透析液を1.5 mLチューブに回収します。次に、12%ポリアクリルアミドゲルを用いて溶液を分析します。ゲルを銀染色し、シアノゲンブロミドマトリックスペプチドの電気泳動パターンを可視化します。PBSで覆われた基底膜ゲルを使い、0.1 millimolesの塩化カルシウムを含む300 µLのPBSで、さらに2回ゲルを洗浄します。そして、0.5 millimolesの塩化マグネシウムを加え、室温で5分間置きます。その後、PBSを除去し、再構成した基底膜ゲルの各々を覆うように、4%パラホルムアルデヒドを300 microliters加えます。再構成した基底膜成分を固定するため、ゲルを室温で30分間インキュベートします。次に、固定液を除去し、75 millimolesの塩化アンモニウムと0.5 millimolesの塩化マグネシウムを含むクエンチ液を300 microliters加えます。この溶液を室温で5分間インキュベートし、その後溶液を除去して、すすぎをさらに4回繰り返します。最終洗浄後、非特異的反応を防ぐため、再構成した基底膜ゲルに300 µLの免疫蛍光バッファーを加えます。ゲルをこの溶液に入れ、室温のシェイカー上で2時間インキュベートします。その後、免疫蛍光ブロッキングバッファーを除去します。次に、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体を300 µL添加します。再構成した基底膜ゲルを4 °Cで16時間インキュベートします。翌日、一次抗体を除去し、免疫蛍光バッファー300 µLでゲルを3回洗浄します。各緩衝液の添加後、シェイキングプラットフォームを用いて室温で10分間振とうします。その後、緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液で希釈した蛍光標識二次抗体を300 microliters添加します。サンプルをシェイキングプラットフォームに置き、室温で2時間インキュベートします。二次抗体を除去します。免疫蛍光バッファーでサンプルを洗浄し、続いてPBSで洗浄した後、2回目の固定およびクエンチ処理を行います。最後に、ゲルを封入し、顕微鏡を用いて密なバンドルの形成を解析します。前立腺腺の腺房を形成させるには、5,000個のRWPE-1細胞を、2%の基底膜溶液を添加した300 µLの完全KSFMで希釈します。前立腺腫瘍細胞凝集塊を作成する場合は、2,500個のPC3細胞を、2%の基底膜溶液を添加した300 µLのRPMI-1640培地で希釈します。再構成した基底膜ゲルをPBS中で一晩インキュベートした後、500 µLの培地で2回洗浄します。細胞を播種する前に、天然の再構成基底膜および糖化終末産物によって硬化した再構成基底膜上に、細胞を緩やかに播種します。その後、培養物を注意深くインキュベーターに入れ、成長する腺胞とスフェロイドが均一に分布するようにします。腺胞形成細胞については、基底膜溶液を2%含有する新鮮な培地を用いて、2日ごとに培地を交換します。これは、細胞が正常な腺胞の恒常性維持に必要な成長因子を得られるようにするためです。培養から6日後、前立腺上皮細胞は天然の再構成基底膜上に腺胞を形成します。そして、上皮細胞からなる均一な球状体として組織化されています。これらの腺房は、頂端側から基底側への極性を持つ高度に組織化されたPECの特性と、可視的な腔空間を備えています。硬化したメンブレン上で6日間培養すると、細胞の構造は破壊されます。また、形状が球状から多角形へと変化します。さらに、これらの腺胞は高度に不規則となり、頂端側から基底側への極性が消失しており、管腔腔は小さいか、あるいはほとんど存在しません。これは、前立腺肥大症に罹患した前立腺由来の細胞についても同様です。前立腺腫瘍細胞を測定したところ、硬い再構成基底膜上で細胞がより長くなり、遊走速度が速まり、細胞の持続性も向上していることが分かりました。このビデオを視聴することで、基底膜の剛性が上皮細胞および腫瘍細胞の挙動に及ぼす影響をどのようにモデル化するかについて、十分に理解できるはずです。この手順を実施する際は、目的とする基底膜の剛性を誘導し、個々の腺胞またはs-spheroidが適切に形成されるようにすることが重要です。この手法の開発により、腫瘍学分野の研究者が前立腺における基底膜の剛性によるがん細胞浸潤の誘導を探索する道が開かれました。本プロトコルの後、細胞溶解液の免疫ブロットなどの他の手法を用いることで、基底膜の剛性によって調節されるシグナル伝達経路に関するさらなる疑問を解消することができます。シアノホウ素化ナトリウム、シアノゲンブロミド、およびギ酸の取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は常にドラフトチャンバー内で作業し、白衣、手袋、フェイスシールド、および呼吸用保護具を着用するなどの予防措置を講じてください。

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がん研究

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