真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製

Eurkaryotic細胞からの染色体外環状DNAのゲノムワイド精製。こんにちは、ラスムスです。ここでは、環状DNA精製法の全体像についてご説明します。

最初の部分では、酵母細胞が培養され、収穫されます。その後、環状DNAを精製し、3つのステップで増幅します。まず、DNAサークルが精製され、濃縮されるカラム分離によって

次に、DNAをエキソヌクレアーゼで処理して残りのすべての直鎖DNAを消化し、最後にphi-29ポリメラーゼを使用してDNAサークルを増幅します。このプロトコルの第5部では、DNAサークルが配列決定され、リードがSaccharomyces cerevisiae参照ゲノムにマッピングされます。このビデオの最後には、代表的な結果をいくつか紹介します。

今後の研究の展望と、この手法を使用する利点について説明します。パート1、細胞回収。スターター培養物は、最大密度(1ミリリットルあたり約2億細胞)まで攪拌しながら30度で増殖させ、24〜48時間後に到達します。

成長させた培養物をFalconチューブに移し、遠心分離により3分間ペレット化します。上清が取り除かれます。大きなペレットはTEバッファーでボルテックスされ、遠心分離によって再ペレットされます。

パート2、カラム精製。このステップでは、ゲノム細菌DNAから高度に精製されたプラスミドを生成する市販のカラム精製キットを使用します。このキットを酵母と一緒に使用する前に、細胞壁を破壊する必要があります。

これは、洗浄した細胞ペレットをキットのL-1バッファーに再懸濁することによって行われます。細胞懸濁液を微量遠心チューブに移し、ガラスビーズを全容量の3分の1に添加します。サンプルを最高速度で10分間ボルテックスし、毎分2,000回転で遠心分離して30秒間ビーズを除去します。

上清は新しいチューブに移されます。この方法では、高度に希釈したプラスミドを上清に3つの異なる比率で添加します。私たちは、高度に希釈されたプラスミドをサイクルに含めることを提案します。

これは、内部リファレンスガイドとして機能します。これは、DNAの精製と増幅の品質チェックに使用できるだけでなく、プラスミドのこれらのスパイクを使用して、細胞あたりの非環状DNAの半量推定を行うことができます。高度に希釈したプラスミドは、他の環状DNAの配列分解能に影響を与えるため、添加する必要があります。

スパイクプラスミドを含む細胞懸濁液をキットのL-2溶液で処理し、キットのプロトコールに従います。カラムをロードした後、タンパク質、脂質、染色体DNAをカラムを2回洗浄して除去します。染色体外環状DNAは、溶出液画分に高度に濃縮されています。

パート3、線形DNA消化。このステップでは、エキソヌクレアーゼを使用して、残りの直鎖DNAを消化します。ATP依存性エキソヌクレアーゼは、環状DNAを消化することなく、線状二本鎖および一本鎖DNAを特異的に標的とします。

直鎖状DNAに対するエキソヌクレアーゼの特異性は、DNase処理の29時間後のゲル電気泳動によって確認されました。その結果、赤矢印で示したように、プラスミドDNAは残存する一方で、ゲノムDNAは消化されることがわかりました。酵母は16の染色体を含み、長さは最大1, 500キロベースです。

そのため、エキソヌクレアーゼの消化を促進するために、希少な切断エンドヌクレアーゼを使用して、アクセス可能なDNA末端の数を増やします。ATEベースの制限酵素NotIを使用する場合、各染色体は示されているように最大7回切断されます。カラム精製したDNAをNotIで37°Cの加熱ブロックで一晩処理します。

NotIを熱不活性化した後、切断されたDNAは、メーカーのプロトコルに従って37度のエキソヌクレアーゼで処理されます。エキソヌクレアーゼ処理後、酵素は70度で30分間熱不活性化されます。追加のATPとエキソヌクレアーゼによってすべての直鎖状染色体DNAを消化するのに数日かかる場合がありますすべての直鎖状DNAが完全に消化されることを確実にするために、サンプルはACTIなどの内部参照遺伝子を使用してPCRまたはqPCR法で分析されます。

パート4、DNAの増幅。このステップでは、phi-29ポリメラーゼを使用して環状DNAを濃縮および増幅します。反応は、ランダムな六量体オリゴヌクレオチドとphi-29を使用して30度で行われます。

ポリメラーゼは高い忠実度とプルーフリーディング活性を備えており、偏りのないDNA増幅を保証します。各ポリメラーゼは、ローリングサークル複製により、最大100キロベースのDNAを合成できます。また、ポリメラーゼは、DNAを10倍から9倍まで増幅する非常に処理能力の高いDNAです。

パート5、シーケンシング。ハイスループット次世代シーケンシングプラットフォームのプロトコルに従って、DNAを平均300塩基対のサイズに超音波処理し、141ヌクレオチドシングルエンドリードとしてシーケンシングします。配列リードは、Galaxyフリーデータベースを使用して、出芽酵母の参照ゲノムにマッピングされます。

シーケンシングされたデータはGalaxyにアップロードされ、パーシャルリードのマッピングを可能にするショートリードアライナーBowtie2を使用してリードがマッピングされます。パート6、代表的な結果。シーケンシングを行い、出芽酵母のリファレンスゲノムにマッピングした後、Galaxyソフトウェア内のゲノムブラウザでリードを可視化することができます。

例えば、環状起源のDNAは、画面に示されているように1キロベースを超えるコヒーレントリードを含む領域としてカウントできます。1キロベースを超えるコヒーレントリードを含む4番染色体上の領域の例としては、ヘキソーストランスポーター遺伝子6と7がある領域があります。この方法を酵母細胞の集団に使用すると、マッピングされたリードがこの遺伝子座で頻繁に見られ、リードカバレッジは、パラログヘキソーストランスポーター遺伝子間に形成されたDNAサークルを明確に示唆しています。

ヘキソーストランスポーター遺伝子間の配列相同性が高いため、違法な相同組換えがこのDNAの環状化につながると提案します。循環型DNA突然変異のモデルでは、DNA修復プロセスが不完全に実行される場合です。例えば、反復配列で二本鎖切断が発生した場合、同じ染色分体上の相同体配列を相同組換えによるDNA修復の鋳型として使用することができます。

切除、鎖浸潤、DNA合成、およびすべての差止命令の解決後、DNAサークルがゲノムからループアップし、染色体上のDNA欠失を引き起こす可能性があります。DNAをエキソヌクレアーゼとphi-29ポリメラーゼで処理した場合の影響は、ヨウ化プロピジウム染色剤を用いて可視化できます。ゲノムDNAの染色コントロールは左の画像のように、プラスミドDNAは右の画像のように表示されます。

400ナノグラムのゲノムDNAを29時間エキソヌクレアーゼ処理した後、左の画像に示すように、DNAの大部分が消化されます。この結果は、右のゲル画像に示すようにゲル電気泳動によって確認されます。72時間のエキソヌクレアーゼ処理とそれに続くphi-29ポリメラーゼによるDA合成の後でも、数百万のコピーのDNAを同定することができます。

同様に、400ナノグラムのゲノムDNAとさらに100ナノグラムのプラスミドDNAのエキソヌクレアーゼ処理を29時間行った後、ゲノムDNAの大部分が消化されます。しかし、プラスミドDNAはゲル画像で示されているようには消化されません。72時間エキソヌクレアーゼ処理したサンプルのファイ-29ポリメラーゼ処理後、増幅されたDNAの大部分は染色されたプラスミドとして現れます。

そこで、まず環状DNAの遺伝子をスクリーニングしたところ、数百種類のDNAサンプルが見つかったことに本当に驚きました。はい、酵母集団にDNAサークルがどれほど一般的であるかを発見したことは本当に驚きました、そして私たちはこの方法が多くの種類の研究に使用できると信じています。明らかに、1つは人間の組織を見ることです。

遺伝子は、非環状元素や酵母、さらには腫瘍細胞でも増幅できることがわかっています。一般的に、体細胞を見て、そこでどのような種類の環状DNAが見つかるのか、そしてそれがどのような影響を与えるのかを調査することは興味深いことだと思います。循環型化。老化細胞には、加齢とともに蓄積する円があり、環状DNA上により多くの遺伝子が見つかることが予想されます。

そしてさらに、DNAの循環化の分子メカニズムを見てみたいと思いますが、明らかなことは、相同組換えに欠陥があり、非相同の変異体を持つ酵母を調べることですこれらの変異体を研究する際には、DNAの循環化がプロファイル化されたと期待しています。さまざまなタイプの変異体と何が違うのか、そしてうまくいけば、酵母の研究からDNAの循環についてもっと学ぶことができるでしょう。したがって、他の方法と比較して、この方法ははるかに感度が高いです。実際には、10, 000個の細胞のうち約1つでDNAサークルを見つけることができるかもしれません。

そして、私が知る限りでは、非常に長い時間をかけて行われた試験の研究から。変異対立遺伝子は通常、検出される前に人口の1〜10%の割合に到達する必要があります。そうですね、この技術では、形成されたDNAサークルについての予備知識を持つ必要はありません、技術とは異なり、またはDNAサークルはある程度結合している必要があり、その後、シーケンシングまたは染色体染色によってそれらを増幅として簡単に検出できます。

ええ、ですから、主な利点は感度だと思いますし、この方法で多くの興味深いことができることを願っています。