真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製

真核細胞からのゲノムワイドな染色体外環状DNAの精製。こんにちは、Rasmusです。ここでは、環状DNA精製法の全容について説明します。

第一部では、酵母細胞の培養および回収を行います。次に、3つのステップで環状DNAの精製および増幅を行います。まず、カラム分離によって環状DNAを精製し、濃縮します。

次に、エキソヌクレアーゼでDNAを処理して残りの線状DNAをすべて消化し、最後にphi-29ポリメラーゼを用いてDNAサークルを増幅します。このプロトコルの第5部では、DNAサークルのシーケンシングを行い、リードをSaccharomyces cerevisiaeのリファレンスゲノムにマッピングします。このビデオの最後に、いくつかの代表的な結果を示します。

今後の研究への展望と、本手法を用いる利点について説明します。パート1は細胞の回収です。スターター培養液を30°Cで振盪しながら最大密度まで増殖させます。最大密度はおよそ200 million cells/mLであり、24〜48時間後に到達します。

増殖した培養物をFalconチューブに移し、3分間遠心分離してペレット化します。上清を除去します。大きなペレットをTEバッファー中でボルテックスし、再度遠心分離してペレット化します。

パート2、カラム精製です。このステップでは、細菌のゲノムDNAから高度に精製されたプラスミドを得ることができる市販のカラム精製キットを使用します。酵母にこのキットを使用する前に、細胞壁を破壊する必要があります。

これは、洗浄した細胞ペレットをキットのL-1バッファーで再懸濁することで行います。細胞懸濁液をマイクロセントリフュージチューブに移し、全容量の3分の1のガラスビーズを加えます。サンプルを最大速度で10分間ボルテックスし、2,000 rpmで30秒間遠心分離してビーズを除去します。

上清を新しいチューブに移します。この方法では、高度に希釈したプラスミドを3つの異なる比率で上清に添加します。サイクルに高度に希釈したプラスミドを組み込むことを提案します。

これは内部リファレンスガイドとして利用できます。これにより、DNAの精製および増幅の品質チェックを行うことができるほか、これらのスパイクインプラスミドを用いて、細胞あたりの非環状DNAの半定量的推定を行うことができます。他の環状DNAの配列解像度に影響を与えるため、添加するプラスミドは高度に希釈したものに限定してください。

スパイクしたプラスミドを含む細胞懸濁液をキットのL-2溶液で処理し、キットのプロトコルに従います。カラムにロードした後、カラムを2回洗浄して、タンパク質、脂質、および染色体DNAを除去します。これにより、溶出画分において染色体外環状DNAが高純度に濃縮されます。

パート3、線状DNAの消化についてです。このステップでは、エキソヌクレアーゼを使用して残存する線状DNAを消化します。ATP依存性エキソヌクレアーゼは、環状DNAを消化することなく、線状の二本鎖および一本鎖DNAを特異的に標的とします。

線状DNAに対するエキソヌクレアーゼの特異性は、DNase処理を29時間行った後のゲル電気泳動によって確認されました。結果から、ゲノムDNAは消化される一方で、プラスミドDNAは赤色の矢印で示されるように残存していることがわかります。酵母は最大1,500キロベースの長さに達する16本の染色体を有しています。

したがって、エキソヌクレアーゼ消化を促進するために、希少切断エンドヌクレアーゼを用いて、アクセス可能なDNA末端の数を増加させます。制限酵素NotIを使用する場合、図に示すように、各染色体は最大7回切断されます。カラム精製したDNAを、ヒーティングブロックを用いて37°Cで一晩NotI処理します。

NotIを熱不活化した後、切断されたDNAを製造者のプロトコルに従い37°Cでエキソヌクレアーゼで処理します。エキソヌクレアーゼ処理後、酵素を70°Cで30分間熱不活化します。追加のATPとエキソヌクレアーゼを用いてすべての線状染色体DNAを消化するには、数日かかる場合があります。すべての線状DNAが完全に消化されていることを確認するため、ACTIなどの内部参照遺伝子を用いたPCRまたはqPCR法によりサンプルを分析します。

パート4、DNAの増幅。このステップでは、phi-29ポリメラーゼを用いて環状DNAを濃縮および増幅します。反応は、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドとphi-29を用い、30 °Cで進行します。

このポリメラーゼは高い忠実度と校正活性を備えており、偏りのないDNA増幅を可能にします。各ポリメラーゼは、ローリングサークル複製により、最大100 kilobasesのDNAを合成できます。また、このポリメラーゼは非常に高いプロセッシビティを持ち、DNAを最大10⁹倍まで増幅します。

パート5、シーケンシング。ハイスループット次世代シーケンシングプラットフォームのプロトコルに従い、DNAを平均300 base pairsのサイズにソニケーションし、141 nucleotideのシングルエンドリードとしてシーケンシングします。シーケンスリードは、Galaxyの無料データベースを用いて、Saccharomyces cerevisiaeのリファレンスゲノムにマッピングします。

シーケンスデータはGalaxyにアップロードされ、部分的なリードのマッピングが可能なショートリードアライナーであるBowtie2を用いてリードのマッピングが行われます。パート6では、代表的な結果について説明します。シーケンシングおよびSaccharomyces cerevisiaeのリファレンスゲノムへのマッピング後、Galaxyソフトウェア内のゲノムブラウザでリードを可視化することができます。

例えば、画面に示されているように、1 kbを超えるコヒーレントリードを含む領域として、環状由来のDNAをカウントすることができます。1 kbを超えるコヒーレントリードを含む第4染色体上の領域の一例として、ヘキソース輸送体遺伝子6および7が存在する領域が挙げられます。酵母細胞集団にこの手法を適用すると、この遺伝子座にマップされたリードが頻繁に見つかり、リードカバレッジからパラログのヘキソース輸送体遺伝子間にDNAサークルが形成されたことが明確に示唆されます。

ヘキソース輸送体遺伝子間に高い配列相同性が認められるため、不適切な相同組換えがこのDNAの環状化を引き起こすと我々は考えています。環状DNA変異のモデルは、DNA修復プロセスが不完全に行われた場合に生じます。例えば、反復配列内で二本鎖切断が発生すると、同一染色体上の相同配列が相同組換えによるDNA修復のテンプレートとして利用される可能性があります。

切除、ストランド侵入、DNA合成、およびすべての接合部の解消を経て、ゲノムからDNAサークルがループアウトすることで、染色体上のDNA欠失が引き起こされます。エキソヌクレアーゼおよびphi-29ポリメラーゼでDNAを処理した際の効果は、プロピジウム йоウ化物染色を用いて可視化できます。ゲノムDNAの染色コントロールは左の画像のように見え、プラスミドDNAは右の画像のように見えます。

400 nanogramsのゲノムDNAを29時間エキソヌクレアーゼ処理した後、左の画像に示すように、DNAの大部分が消化されます。この結果は、右のゲル画像に示すゲル電気泳動によって確認されます。72時間のエキソヌクレアーゼ処理の後、phi-29ポリメラーゼによるDA合成を行うことで、依然として数百万コピーのDNAを同定することが可能です。

同様に、400 ngのゲノムDNAとさらに100 ngのプラスミドDNAを29時間エキソヌクレアーゼ処理すると、ゲノムDNAの大部分が消化されます。しかし、ゲル画像に示されているように、プラスミドDNAは消化されません。72時間エキソヌクレアーゼ処理したサンプルをphi-29ポリメラーゼで処理すると、増幅されたDNAの大部分が染色されたプラスミドとして現れます。

まず、環状DNAについて遺伝子のスクリーニングを行ったところ、数百種類もの異なるタイプのDNAサンプルが見つかり、非常に驚きました。酵母集団においてDNAサークルがいかに一般的であるかという結果に本当に驚かされましたし、この手法は多くの種類の研究に活用できると考えています。当然ながら、その一つとしてヒト組織の調査などが挙げられます。

遺伝子は、環状要素や酵母、さらには腫瘍細胞においても増幅されることが知られています。一般的に、体細胞を観察し、そこにどのような種類の環状DNAが存在し、この環状化がどのような影響を及ぼすのかを調査することは非常に興味深いと考えています。老化細胞においては、加齢に伴い環状DNAが蓄積し、環状DNA上に存在する遺伝子が増加することが予想されます。

さらに、DNA環状化の分子メカニズムについて検討したいと考えています。そのための有効なアプローチは、相同組換えおよび非相同末端結合に欠損がある変異体を用いて酵母で解析することです。これらの変異体を研究することで、変異体の種類によってDNA環状化のプロファイルが異なることが予想され、酵母を用いた研究からDNA環状化についてより多くの知見を得られることが期待されます。したがって、他の手法と比較して、本手法は非常に感度が高く、実際におよそ10,000個に1個の細胞からDNA環を検出できる可能性があります。

また、詳細にわたって行われた試験研究から分かっている限りでは、変異アレルは通常、検出可能になるまでに集団の1〜10%の割合に達する必要があります。そして、この手法を用いれば、他の手法とは異なり、形成されたDNAサークルの事前知識を持つ必要はありません。あるいは、DNAサークルがある程度結合していれば、シーケンシングや染色体染色による増幅として容易に検出することが可能です。

ええ、やはり最大の利点は感度にあり、この方法で多くの興味深い取り組みができることを期待しています。