Name: 真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: 学ぶCircle-Seq法によるSaccharomyces cerevisiaeのeccDNAゲノムワイド精製と検出。エクソヌクレアーゼ処理とローリングサークル増幅を用いて、高感度に環状DNAを検出し、ゲノム安定性と進化の研究に応用可能です。

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技術支援を提供してくださったKenn D. MøllerさんとClaus Sternbergさん(DTU)、定量的PCR分析を提供してくださったTue S. Jørgensenさんに感謝します。

注：環状DNAの精製および配列決定法（サークルSEQ）の概要を図1に示されています。 1.栽培、細胞の収穫とプラズマ膜破壊<ol><li>酵母ペプトンデキストロースの50ミリリットル完全な栄養培地（YPD）にO / N培養物から（例えば、 サッカロマイセス・セレビシエのための）酵母細胞を接種します。 1-3×10 5細胞/ mlまたは約0.01 OD 600の光学密度の低い初期細胞密度で接種します。 <ol><li>細胞が約24〜48時間またはOD 600&gt; 10.0での光学密度の後、約1×10 10細胞の最大細胞密度に達するまで分（RPM）あたり150ラウンドで攪拌しながら30℃で細胞をインキュベートします。 注：より低い細胞濃度を使用することができるような培養時間は重要ではありません。 </li></ol></li><li>で遠心分離して細胞をペレット、50mlコニカルチューブに手狭文化を転送800×gで3分間、上清を捨てます。 </li><li> 3分間800×gでの遠心分離によって細胞を再ペレット化し、上清を捨て、10 mMのトリス-Cl、1 mMのEDTA、pH8.0の25mlの緩衝液でペレットを洗浄します。 </li><li>プラスミドカラム精製キットから供給された1.2ミリリットル再懸濁緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>オプションの手順：環状DNAエレメント20の精製の ​​ための対照として、高度に希釈されたプラスミドを追加します。 注：現在のデータセットにおいて、7.7μlのプラスミド混合物は、10 10個の細胞を含む各試料に適用しました。プラスミドストック混合物は、異なる濃度で3つのプラスミドから構成され; 0.01 ngの/サンプルの38 ngの/サンプルでのpBR322、pUC19の0.5 ngの/サンプルで、とpUG72。 </li><li>総懸濁液体積の3比はそれぞれ1での0.5mmガラスビーズを補充二つ2 mlのマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液を移します。 </li><li>形質細胞を破壊する10分間ボルテックス最大スピードで各チューブを膜。 30秒間268×gの遠心分離によってビーズをペレット化し、新しいチューブに2マイクロ遠心チューブから1.2ミリリットルを組み合わせた上清を移します。 注：代替0.6ミリリットルの再懸濁緩衝液中で細胞を破壊するためにザイモリアーゼを使用して、1.6から1.7に進みます。ザイモリエイスの十単位は35℃で1.5時間以内に5×10 7細胞を破壊することができます。 </li></ol> 2. EccDNA濃縮カラムクロマトグラフィーにより、 <ol><li>プラスミドのカラム精製のためのキットからのプロトコルに従ってください。簡単に言えば、穏やかに混合し、室温で3分間インキュベートする、1.2ミリリットルのアルカリ性溶液を用いて、各サンプルを処理します。 </li><li> 、1.2ミリリットル中和緩衝液を追加し、5分間9650×gで穏やかに遠心混ぜます。 </li><li> 1ミリリットルの平衡溶液で平衡化したカラムに溶液をロードし、液体が重力によってカラムを通って流れることを可能にします。 </li><li> 4ミリリットル洗浄液でカラムを洗浄。解決策は、樹脂を通過した場合には、慎重にそのように0.3ミリリットルの溶出を追加リューションは、0.35ミリリットルのカラム空隙容量のほとんどを交換します。 </li><li> 1ミリリットルの溶出液で新しいコレクションチューブにDNAを溶出し、0.8ミリリットル沈殿混合物を加えることによって、DNAを沈殿させます。 10分間、9650×gで遠心分離します。 </li><li> 5〜15分間、0.5ミリリットルの70％エタノール、5分間、9650×gで遠心分離、空気乾燥してDNAペレットを洗浄し、25μlの滅菌水で精製したDNAを溶解します。 注：水だけでDNAの短期間の保存が推奨されます。優先的には、ステップ3に直接進みます。 </li></ol>残りの線状染色体DNAの3消化<ol><li>オプションの手順：などのNotIなどのレア切断エンドヌクレアーゼで精製したDNAを扱う、エキソヌクレアーゼにより線状DNAの特定の消化を促進するために。 5μgのDNAについて、総容量50μlに1単位のNotI、5μlの10×消化緩衝液および滅菌水を使用しています。 16時間熱を5分間80℃で酵素を不活化し、37℃で反応をインキュベートします。 </li><li> 20を追加します。単位のエキソヌクレアーゼ（2μl）を、4μlのATP（25 mM）の、34μlの滅菌水および50μlの酵素で切断されたDNAに直接10μlの10×反応緩衝液は、ATP依存性エキソヌクレアーゼを使用して、100μlのの1×反応容量に到達しますキット。 </li><li> 5日以上、37℃における線一本鎖および二本鎖DNAの加水分解を行います。さらに4μlのATP（25 mM）の、0.6μlの10×反応緩衝液および1×反応容積で酵素DNA消化を続けるために24時間毎に、エキソヌクレアーゼ20単位を追加します。 </li><li>直鎖状DNAを除去した後、エキソヌクレアーゼ処理された溶液からの試料2μlを、アクチン遺伝子ACT1 20として染色体マーカーを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）によって染色体線状DNAの除去を確認しました。 <ol><li>各20μlの定量PCR反応容量は2μlのエキソヌクレアーゼ処理サンプルが含まれ、150 nmのACT1プライマー 5&#39;-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 &#39;および5&#39;-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 &#39;、2％（体積/体積）のジメチルスルホキシド、及び10μlの緑色蛍光マスターミックス。 </li><li>反応条件を使用します。 95℃で15秒間の45サイクル、60℃で30秒間、続いて95℃で3分。 注：この遺伝子におけるコピー数の変動が21-23有害であるのでeccDNAがACT1を運ぶべきではありませんので、ACT1は、直鎖状DNAに特に適しマーカーです。 </li><li>定量PCRによるDNAの消化の分析に代わるものは、標準的なPCR（4.3）またはヨウ化プロピジウム染色（4.4）です。 <ol><li> 2μlのエキソヌクレアーゼ処理したサンプルは、ACT1プライマー 5&#39;-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 &#39;および5&#39;-GAACGACGTGAGTAACACC-3&#39;を用いて、PCRテンプレートとして使用します。ポジティブACT1制御としては、50から100 ngのゲノムS.を使用テンプレートとしてセレビシエ DNA。 PCR反応条件。 95℃で30秒間の35サイクル、56℃で30秒、72℃で1分間、続いて95℃で3分。 </li><li>ゲルelectrophoreによりPCR反応を実行します。0.5μgの1％アガロース上でSIS / mlの臭化エチジウム。 0.8キロバイトACT1バンドを探してください。 </li></ol></li><li>直鎖状DNAの有無は、DNA増幅の前後のヨウ化プロピジウム染色により調べることができます。 <ol><li> 20 mMのヨウ化プロピジウム株式の千H 2 O-希釈液：1と1の体積：1で各DNAサンプルを混ぜます。 RTで10-20分間、暗闇の中で解決策を残し、663から738 nmおよび5〜30秒の露光時間で赤励起蛍光フィルターを使用して、100倍の倍率で蛍光顕微鏡でDNA染色を分析します。 DNA染色対照として、使用酵母および/またはO29増幅プラスミドからのゲノムDNAをO29に増幅します。 </li></ol></li></ol></li><li>熱は、30分間70℃でエキソヌクレアーゼ溶液を不活性化します。 </li></ol> 4. DNA増幅<ol><li>精製した増幅およびO29のDNAポリメラーゼ24-26アコードとステップ3.5）からeccDNAを豊かにポリメラーゼメーカーのプロトコルにる。 <ol><li>簡単に言えば、5μlの変性緩衝液でeccDNA富んだ5μLを混合します。 </li><li> RTで3分後、10μlの中和緩衝液を追加します。穏やかに混合し、29μlの反応バッファー及び1μlのO29のDNAポリメラーゼを含む30μlのマスターミックスを追加します。 （72時間まで）16時間以上30℃で反応をインキュベートします。熱は、3分間65℃でO29 DNAポリメラーゼを不活性化します。 </li></ol></li></ol> 5.配列決定およびデータ解析<ol><li> 300塩基対の平均目標ピークの大きさに集束超音波装置を用いて増幅eccDNAせん断。 450Wピーク強度パワー、60秒の処理、30％のデューティ・ファクタ、バーストあたり200サイクル、温度7°C：130μlのDNAサンプルに対して次の設定を使用します。 </li><li>断片化にバーコードのインデックスラベルおよびアダプタを追加ライブラリーを調製するための適切な方法を用いて、配列決定のためのライブラリーの合成のために読み込みます。 </li><li>141ヌクレオチドのシングルエンドはハイスループットシークエンシング・プラットフォーム上で読み込むように、たとえば、深いシーケンシングを実行します。 </li><li>地図は、調査中の酵母参照ゲノムに読み込み、許可する複数の領域にマッピングするために読み取ります。例えば、自由に利用できるワークフローシステム27,28とショート読み取りアライナーマッピングソフトウェア29を使用します 。 </li><li>連続した読み込みを使用して、推定eccDNAsの地域から読み取る識別し、例えば、7つ以上の連続は、隙間20なし（&gt; 1キロバイト）を読み出します。 注：ソフトウェアが対象のゲノム領域にマッピングされた探索には27,28利用可能な読み取ります。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

サークルのSeq法は、配列レベルの分解能を持つ酵母細胞からeccDNAのゲノムスケールの検出を可能にします。この方法は、集中的な渦やピペット操作を必要とし、次のステップでエキソヌクレアーゼ消化につながるeccDNAの破損を制限するために、重力によってカラム分離を使用していない軽度のeccDNAの精製です。この方法のこれらの機能は、遺伝子配列を含む大きなeccDNAsを検出するために重要であり得ます。サークルのSeqは、完全な遺伝子（ データセット1）を含む多数のeccDNAsを検出しました。また、86-kbの酵母ミトコンドリアDNAを検出しました。したがって、このプロトコルは、大環状DNAエレメントの精製を容易にします。最小限にDNA抽出工程の数を維持するeccDNA損失のリスクを低減し、歩留まりを最大にします。制御の結果に基づいて、スパイク-にプラスミド、サークルのSeqは2,500細胞から単一の環状DNAを検出し、高感度です。さらに、このような2μなど豊富な内因性​​のプラスミドを除去します;プラスミドまたはミトコンドリアDNAを大幅に感度を向上させる可能性があります。酵母培養物からの2μの硬化は、30に記載されています。また、2μとミトコンドリアDNAの除去は、そのようなのSwaIとして、レア切断エンドヌクレアーゼを用いて達成されることがあります。しかし、制限酵素ステップは、関心のある他のeccDNAsを標的とし、総eccDNA収量を制限することができます。 eccDNA検出のための重要なステップは、適切な深さに線形DNA（ステップ3）、DNA配列決定（ステップ5）を除去しました。細胞集団からeccDNAsの大部分を記録するには、深いシーケンシングは、20を必要になる場合があります。環状DNA接合がペアエンドがdiscordantlyそのマップを読み込みもたらすことが期待されているようペアエンド配列決定は、eccDNA検出の一層の信頼を提供する必要があります。これらの不一致は、環状DNA構造の発見を支援し、潜在的にさらなるeccDNA検出フィルタとして使用することができます。 サークルのa-SeQ法は、3つの独立したSを使用して検証しました。 セレビシエ CEN.PK集団。検出されたシーケンスは、以前eccDNAs、内在性プラスミドを報告し、スパイク-にプラスミドおよび推定eccDNAs（ データセット1）の何百も含まれています。これらの知見は、Sから前のサークルのSeqデータセットをサポートセレビシエ S288C 20。 CEN.PKとS288C集団に共通するいくつかのeccDNAsの発見は、これらの遺伝子座は、として円形の要素（ 図4）が存在する傾向があることを示しています。我々は以前、他の歪みの背景にある[GAP1 円 ]の証拠が発見されていないものの、CEN.PK背景8中の窒素限られた条件の下で濃縮されている[GAP1 円 ]ことが示されています。 CUP1-1 RSC30、ASP3-1、COS111、およびHXT6 HXT7からeccDNAの発見S288CとCEN.PKの両方での遺伝子座はDNAの環状化のための素因が詐欺であることを示唆しています酵母株の間でお召し上がりいただけます。 [HXT6 / 7 円 ]、[ASP3-1 円 ]、[COS111 円 ]、および[CUP1-1 RSC30 円 ]が細胞に選択的利点を付与する場合は、表示されるために残っているか、彼らの存在は、単にの高レートの影響である場合DNAの環状化。 まとめると、結果は、サークル-seqがキロベースのサイズeccDNAsを検出するのに適している、完全な遺伝子とeccDNAsを識別するための利点を有していることを示しています。サークルのSeqは、酵母からeccDNAsの全ゲノムスケールの画面を有効に高感度な方法です。サークルのSeq法は、遺伝子欠失および増幅を生成する際にeccDNAの役割を解明することを目的とした研究の新しいフィールドを開くことができます。 DNAアーキテクチャと構造が大きく、高等真核生物への真核生物、酵母から保存されていることを考えると、サークルのSeq法は、原理的には、applicablすべきです若干の修正を加えて、すべての真核細胞に電子。メガベースサイズeccDNAsを精製する能力を示すことがまだあるが、現時点では、この方法は、任意の制限があるとは思われません。また、ローリングサークル増幅法31を使用O29 DNAポリメラーゼの使用は、eccDNA定量がより困難に小さいeccDNAsに向かってバイアスを生成します。サークルのSeqはヒト体細胞からの二分の環状DNAの研究に適して、完全な遺伝子を運ぶのに十分な大きeccDNAsを検出します。癌原遺伝子がこれらの要素32-37上で増幅されたときにダブル分は、癌に貢献することができます。生殖系列細胞におけるeccDNAsの研究は、家畜、例えば、生殖細胞系突然変異率を測定し、精子の品質を評価するために使用することができます。このように、サークルのSeqは、遺伝的変異は、コピー数多型の形で発生する速度への洞察を得て、遺伝子が関与する疾患の新規理解につながる可能性を秘めている著作数の変動38-40。

それは、細胞の大集団中の単一DNA分子の変化を同定する必要があるため、早期にまたは一過染色体の増幅を検出することは困難です。染色体コピー数変動（CNVを）は、一般的に変化1,2を生成メカニズムの証拠としてのみ、最終的なCNV構造を残して、彼らの確立された後も検出されています。 CNV形成の初期段階で体外の環状DNA（eccDNA）を検出し、回収することゲノム再編成で進行中のプロセスを解明することがあります。 以前に、eccDNAのデノボ発見は、電子顕微鏡写真を図3に示すように 、中期染色体4、または二次元ゲル電気泳動5のギムザ染色でした。これらの方法は、環状DNAの配列についてはほとんどあるいは全く情報を提供します。ターゲットを絞ったサザンが6,7ブロッティングなどの技術、逆PCR 8、またはその場での hybridizatio 蛍光nは9は 、特定の eccDNA要素についての証拠を提供します。これらの方法はいずれも、細胞集団内のすべての既存eccDNAタイプの配列を提供しません。 細胞のプールにおけるゲノムの相違は、ゲノム配列決定および/ ​​またはタイリングアレイ10,11によって特徴付けることができます。従来のDNA精製方法によって削除または増幅の検出は、通常、突然変異対立遺伝子は、細胞集団12,13の少なくとも0.1から1パーセントを表していることが必要です。非中心eccDNAsは、それらの動原体の欠如および複製におけるDNA合成の潜在的な欠如を、細胞培養物中で一層一過性であることが期待されます。最もeccDNAsは、おそらく少量であり、それらの配列がゲノムに似ているので、このように、代替のDNA抽出方法はeccDNAsを検出するために必要とされます。 いくつかの環状DNA精製技術は、染色体および環状DNAとの間の構造的な違いを利用します。例えば、高速ultracentrifug塩化セシウム勾配でationが、ヒトのHeLa癌細胞株14から350から3000塩基対（bp）の大eccDNAsを単離するために使用されます。しかし、高速度は沈降速度15とeccDNA収率を変える、スーパーコイル環状DNA構造の骨格を壊すか、ニックすることができます。 Duttaさんと共同研究者は、デノボ 、マウス組織からだけでなく、鶏の文化やヒト細胞16,17から環状DNAのゲノムスケールの同定のための方法を開発しました。彼らの方法は、プラスミド精製と酵素反応やDNA抽出のいくつかのラウンドに続いて、スクロース超遠心分離することによりホモジナイズした組織からの核の抽出です。そのプロトコルは、主に200-400 bpのeccDNAs、と呼ばれるmicroDNAsを識別します。 Duttaさんと共同研究者はまた、 サッカロマイセス・セレビシエからmicroDNAsの精製を試みたが、この酵母種16からmicroDNAを記録することができませんでした。 我々はのための新規な方法を開発しましたサークルのSeqと呼ばれる酵母からeccDNAのデノボ検出。この方法は、全遺伝子を運ぶのに十分な大きさと86キロベース（kbの）ミトコンドリアDNA（mtDNAの）と同じ大きさの環状DNA分子のためのゲノム規模の調査を可能にします。サークルのSeq法は、真核生物の酵母細胞用に最適化と深いシーケンシングと組み合わせて、十分に確立された原核生物のプラスミド精製法18,19から開発されました。サークルのSeqアプローチ、1756異なるeccDNAs、すべてのより大きな1キロバイトを使用して、10 Sから検出されましたセレビシエ S288C集団20。サイズカットオフは、全体の遺伝子を運ぶのに十分な大きさでしたeccDNAに集中することを選択しました。サークルのSeqは高感度でした。それは、セル20の数千内の単一eccDNAを検出しました。現在の研究では、サークルのSeqは、別のSの3つの生物学的複製物から294 eccDNAsを分離し、同定するために使用されましたセレビシエ酵母株、CEN.PK.データはeccDNAが共通の遺伝的elemeであることが明らかになりましたS.でNT セレビシエ株。

<table><tbody><tr><td>バクトペプトン</td><td>BD Difco</td><td>211677</td><td>代替品が使用できます。</td></tr><tr><td>ブリリアントIII SYBRグリーンPCRマスターミックス&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>600882</td><td>qPCR解析用。代替製品を使用できます。</td></tr><tr><td>デキストロース(D-グルコース)</td><td>カールロス</td><td>HN06.4</td><td>代替製品を使用できます。</td></tr><tr><td>ディスラプタービーズ、0.5 mm</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-BG05</td><td>形質細胞膜を破壊するガラスビーズ。代替製品を使用できます。</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Carl Roth</td><td>2218.2</td><td>DNA/RNAを検出するためのアガロースゲル染色剤。</td></tr><tr><td>GeneJet プラスミドミニプレップキット</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーK0502</td><td>細菌からのプラスミド精製。代替製品を使用できます。</td></tr><tr><td>NotI、FastDigest</td><td>Life Technologies-&nbsp;サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国</td><td>FD0594</td><td>エンドヌクレアーゼ。代替製品を使用できます。&nbsp;</td></tr><tr><td>プラスミドミニAXキット&nbsp;</td><td>A&A Biotechnology, Poland</td><td>010-50</td><td>eccDNAの精製に使用されたプラスミド精製キット。&nbsp;</td></tr><tr><td>プラスミドセーフATP依存性DNaseキット</td><td>Epicentre, USA</td><td>E3105K</td><td>ATP依存性エキソヌクレアーゼキット。代替製品を使用できます。</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich、USA</td><td>81845</td><td>代替製品を使用できます。</td></tr><tr><td>pUG6 プラスミド</td><td>EUROSCARF, ドイツ</td><td>P30114</td><td>マーカー遺伝子: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP.</td></tr><tr><td>QIAGEN ゲノムチップ 100/G&nbsp;</td><td>Qiagen, USA</td><td>13343</td><td>酵母からのゲノムDNA精製.代替製品を使用できます。</td></tr><tr><td>REPLI-g Mini Kitプロトコル&nbsp;</td><td>Qiagen, USA</td><td>150023</td><td>phi29ポリメラーゼによるeccDNAの増幅.</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>BD Difco</td><td>210929</td><td>代替品が使用できます。</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme)</td><td>Nordic BioSite, Sweden</td><td>Z1004-3</td><td>代替製品が使用できます。</td></tr><tr><td>シーケンスファイルへのデータアクセス</td><td>European Nucleotide Archive&nbsp;</td><td></td><td>Saccharomyces cerevisiae CENからのEccDNAデータセット。PK113-7Dです。研究受託番号PRJEB9684。2番目のアクセッション番号はERP010820です。軌跡タグの接頭辞はBN2032です。</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D</td><td></td><td></td><td>遺伝子型 MATa MAL2-8c SUC2</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae 酵母欠失ライブラリープール</td><td>EUROSCARF, ドイツ</td><td></td><td>S288c BY4741 KanMXモジュールによってdisrubed 4400の生存可能な単一遺伝子欠失変異体のプール。遺伝子型MATa his3&Delta;1 leu2&デルタ;0 met15&Delta;0 ura3&Delta;0 genexxx::KanMX.</td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA分光光度計&nbsp;</td><td>NanoDrop 1000分光光度計、サーモフィッシャーDNA</td><td></td><td>濃度の測定。代替製品を使用できます。</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Nikon Optronics Magnafire.赤色励起蛍光フィルター、663-738 nm。</td><td></td><td>代替製品を使用できます。</td></tr><tr><td>ロボット図書館構築システム</td><td>Apollo 324, IntegenX Inc.</td><td></td><td>DNAライブラリーの調製。代替製品を使用できます。</td></tr><tr><td>シーケンシングプラットフォーム</td><td>Illumina HiSeq 2000プラットフォーム 株式会社イルミナ</td><td></td><td>DNAシーケンシング。代替製品を使用できます。</td></tr><tr><td>超音波装置</td><td>Covaris LE220、microTUBE AFAファイバーチューブ</td><td></td><td>代替製品を使用できます。</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Methods</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% YPDメディア&nbsp;</td><td></td><td></td><td>デキストロース10g、酵母エキス10g、バクトペプトン20gを混合し、H2Oを総量1000mlおよびオートクレーブに加える。</td></tr><tr>ゲノムDNA<td></td><td></td><td>のCircle-Seqテスト</td><td>ゲノムDNAは、酵母欠失ライブラリー(Euroscarf)のプールから精製(Qiagen)されました。DNA濃度は、nanodropおよび30 &microによって測定されました。gゲノムDNAを2本のマイクロ遠心チューブにピペットで移しました。1本のマイクロ遠心チューブに100ナノグラムのプラスミド(pUG6)を補充しました。DNAサンプルは、プロトコルステップ1.1-1.3および1.5-1.7を省略して、Circle-Seqによって精製しました。溶出したDNA濃度をナノドロップで測定し、サンプルGDおよびGD+Pの全DNA収量をエキソヌクレアーゼで29時間処理しました。10%の画分をphi29増幅およびPCR分析のために収集し、残りのDNAを72時間のエキソヌクレアーゼ処理に供しました。サンプルは、ACT1遺伝子を染色体マーカーとして使用して、PCRによって線形DNA含有量について分析しました。エキソヌクレアーゼ処理した各サンプルの5%分画を、phi29 DNAポリメラーゼにより16時間増幅しました(Qiagen)。各サンプル中のDNAの存在は、等量(7 &micro;l)0.5&microの井戸で。g/mL エチジウムブロマイド 0.9% アガロースゲル ゲル電気泳動後の</td></tr><tr><td>マッピングソフトウェア</td><td>Bowtie2アライナー、ジョンホプキンス大学</td><td></td><td>超高速ショートリードアライメント。参照:29。</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム染色</td><td></td><td></td> ヨウ素プロピジウム染色<td>DNAの画像を、RFPチャンネル(赤色励起蛍光フィルター、663-738 nm)の100倍倍(100倍/1.30油、ニコン)の蛍光顕微鏡法により、同一の露光時間(5秒)を用いて撮影しました。</td></tr><tr><td>ワークフロー バイオインフォマティクスシステム</td><td>Galaxy, オープンソース.</td><td></td><td>データ集約型の生物医学研究のための無料のWebベースのプラットフォーム。参照:27-28。</td></tr></tbody></table>

真核細胞から体外の環状dnaのゲノムワイドな精製

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

<html>染色体外環状DNA（eccDNAs） サッカロマイセス・セレビシエにおける共通の遺伝的要素であり、他の真核生物で報告されています。 EccDNAsは、多細胞生物における体細胞間の遺伝的変異に及び単細胞真核生物の進化に貢献しています。 eccDNAを検出するための感度の高い方法は、これらの要素は、ゲノムの安定性に影響を与え、どのように環境的および生物学的因子は、真核細胞におけるそれらの形成を誘導する方法を明確にするために必要とされます。このビデオでは、サークルのSeqと呼ばれる敏感なeccDNA-精製方法を提供します。この方法は、環状DNAのカラム精製、残りの線状染色体DNA、eccDNAのローリングサークル増幅、ディープシークエンシングおよびマッピングの除去を包含する。広範エキソヌクレアーゼ処理は、十分な線形染色体DNAの分解のために必要でした。によるローリングサークル増幅工程伊根高さ：ノーマル;直鎖状DNAを超える環状DNAについて濃縮&quot;&gt;φ29ポリメラーゼ10 10細胞の3 S.セレビシエ CEN.PK集団にサークルのSeq法の検証は1キロベースよりも大きいサイズでeccDNAプロファイルの数百を検出しました。 。S288CとCEN.PK両方に環状DNAにASP3-1、COS111、CUP1、RSC30、HXT6、HXT7遺伝子の発見をDNAの環状化は、これらの遺伝子座での株の間で保存されていることを示唆している繰り返し。要するに、サークルのSeq法は広いがあります真核生物でeccDNAためのゲノム規模スクリーニングのためだけでなく、特定のeccDNAの種類を検出するための適用性。

サークルのSeq法、3 S.を検証するために、細胞は、10代のためのYPDで別々に成長させた後、1×10 10細胞のセレビシエ CEN.PK集団をスクリーニングしました。以前に20（データは示していない）に記載のような染色体の線状DNA除去は、定量PCR ACT1信号が存在しないことによって確認されました。精製され、濃縮されたeccDNAが68百万まで配列決定された読み取り（141-ヌクレオチドシングルエンドの読み取り）とCEN.PK113-7D参照ゲノム（バージョン2012年6月19日）にマッピングされました。 C1、C2およびC4という3つのサンプルから推定されるeccDNAsの記録は、読み取る長い1キロバイト以上の連続によってマッピングされたゲノム領域に割り当てられていました。万モンテカルロシミュレーションに基づいて、隣接することによってマップされた各領域の重要性を1 Kバイト推定されたより長い読み取り。この79、159と56の領域は、おそらくeccDNA系列た（p &lt;0.1、 データセット1）と注釈されたから。記録contiguo数米国&gt; 1のキロバイトサンプルはさらに、（ 図2）が配列決定された場合、より一層eccDNA要素が記録されたであろうことを示唆している配列の深さの関数として増加読み出します。予想されたように、サークルのSeq法は、多数の抽出2μプラスミドを含む公知の環状DNA要素の数、ミトコンドリアDNA、染色体XII上のリボソームRNA遺伝子、およびサンプルにスパイクした3つの内部対照プラスミドのpBR322、pUC19のとpUG72からの読み込みちょうどカラム精製（ 図3）の前に。 ビデオは、染色体IVにHXT7 _ARS432_ HXT6座にマッピングされていることを読み取るの連続の一例を示しています。以前は、[HXT6 / 7 円は ] 10 S288C集団（1×10で各10個の細胞）にサークルのSeqによって検出され、環状DNA構造が逆PCR分析20によって確認されました。 [HXT6 / 7 CIrcle]も3 CEN.PK集団（ 図4A）のそれぞれに記録されました。また、CEN.PKの複製試料間で共通eccDNA遺伝子のほとんどは、S288Cデータセット（ 図4B）からeccDNA遺伝子を重複していました。 環状DNA精製、30μgのゲノムDNAを有する2つのサンプル毎にサークルのSeqプロトコルの特異性を試験するために、試験されました。一つのサンプルは、サークル、配列番号プロトコールにより精製した両方の試料からの100ngのプラスミドDNAおよびeccDNAを補充しました。カラム分離した後、DNAの収量は、プラスミド（GD + P）とサンプル用プラスミドなしの試料について1.27パーセント（380 ngの）（GD）および1.60パーセント（480 NG）でした。エキソヌクレアーゼ処理の効率がACT1に対してPCRを用いて29時間および72時間後の線状DNA含有量について試験した。なしの試料を増幅ACT1（データは示さず）を含んでいませんでした。各エキソヌクレアーゼ処理された試料の画分は、さらにありましたO29によってmplified ポリメラーゼおよび酵素反応の生成物は、ヨウ化プロピジウム染色（ 図5A-F）およびアガロースゲル電気泳動（ 図5G）により分析しました。エキソヌクレアーゼ処理後の試料は、最小限のヨウ化プロピジウム染色（ 図5A-B）を示しました。 O29 -唯一のゲノムDNAで増幅された試料は、対照試料（ 図5E）と同様糸状構造（ 図5C）を明らかにしました。 O29 -追加されたプラスミドを持っていた増幅された試料は、プラスミド対照（ 図5F）に似た病巣（ 図5D）を明らかにしました。画像はO29ポリメラーゼが直鎖状DNA上に環状DNAについて濃縮することを示しました。最も線形染色体DNAは、29時間のエキソヌクレアーゼ処理（ 図5A-B、G）後のサンプルから除去しました。しかし、100以上の時間のために、大規模なエキソヌクレアーゼ処理と、100以上のユニットを使用しました<html>すべての染色体直鎖DNAを除去するために必要な、O29として-増幅されたサンプルは、依然として72時間のエキソヌクレアーゼ処理（ 図5C-D）後のスレッドのような構造のバックグラウンドを示しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig1.jpg" /> サークルのSeq法の図1.概要プロトコルは5段階があります。カラムクロマトグラフィーによる1）細胞培養、2）精製およびeccDNAの濃縮、溶出画分に線形染色体DNAを、残りの3）消化、の4）増幅をO29 DNAポリメラーゼによるDNA、および5）高濃縮eccDNAのシーケンシングおよびSに読み込むのマッピングセレビシエ参照ゲノム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg &quot;/&gt; 図2.連続シーケンスの深さの関数として&gt; 1キロバイトを読み取る。1×10 10個の細胞からEccDNAは（読み取り、マッピングされた数百万で）シーケンスの深さの関数として増加します。示す：半数体CEN.PK Sからの生物学的三重10 10の細胞分裂によって分離・セレビシエ集団 （C1、C2、C4）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig3.jpg" /> CEN.PK生物学におけるプラスミドのパーセントで図知られている環状DNA要素の3検出。リード・カバレッジの（AB）散布図は、（密度を読んで）、C1、C2およびC4を複製します。したマップされた（A）は 、内因性酵母プラスミドに読み取ります2μを。 [rDNAのサークル]（染色体XIIからのリボソームRNA遺伝子）;そして、のmtDNA（ミトコンドリアDNA）。 （B）ユニークなプラスミドを制御するためにマッピングされた読み取ります。対照プラスミドは、カラム精製の前にサンプルに添加しました。セル当たりのプラスミド比は次のとおりだった：のpBR322（プラス記号）1：1、pUC19の（円）1時50分、およびpUG72（三角形）1：2500。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig4.jpg" /> CEN.PKとS288C図4.一般的なeccDNA要素。（A）ベン図476の間での重複を表示します 3 CEN.PKサンプル（C1、C2、C4）で294 eccDNA要素上の遺伝子。 16共通の重複eccDNA遺伝子/プラスミドは（すべての遺伝子名は、 データセット1である）注釈が付けられています。 （B）10 S288Cサンプルから推定eccDNAs上のすべての記録された遺伝子と比較して3 CEN.PKサンプル（C1、C2、C4）から推定eccDNAs上のすべての記録された遺伝子のベン図、：S1-S2、R1-R4、Z1-Z4は（参照20を参照します）。遺伝子/プラスミドおよび2株の背景や3またはそれ以上の実験装置の最小値をオーバーラップし、推定eccDNA領域を有する13の生物学的複製（S1-S2、R1-R4、Z1-Z4、C1-C3）が示されています。 Cサンプル、CEN.PK。 RおよびZサンプル、S288C BY4741。 Sサンプル、S288C M3750。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig5.jpg" /> 図エキソヌクレアーゼ後のDNAサンプルの5可視化と O 2 9治療。DNAの（AF）ヨウ化プロピジウム染色。スケールバーは10μm。 （A、C及びE）のゲノムDNAを有する試料（GD）。 （BとD）GDプラスプラスミド（GD + P）とサンプル。 （ <str<html>オング&gt; AB）29時間のエキソヌクレアーゼ処理（EXO 29時間）した後、 O29ポリメラーゼ増幅（EXO 72時間+ O29）に続いて72時間のエキソヌクレアーゼ処理後（CD）。 （E）E後のゲノムDNAコントロール：O29ポリメラーゼ増幅; （F）プラスミド対照（5.5キロバイト）後 29ポリメラーゼ増幅; （Gφ）アガロースゲル泳動。左から：L、1キロ​​バイトのマーカー; P、EXO 29時間後のプラスミド対照（5.5キロバイト）。 GD、EXO 29時間後（Aのようにサンプル）。 GD + P、EXO 29時間後（Bなどのサンプル）。 GDおよびGD + P、EXO後29時間+ O29。 GDおよびGD + P、EXO後72時間+ O29（CDのようなサンプル）。表S1を参照してください。 余分な詳細については。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ASET 1 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg &quot;/&gt; CEN.PK.でデータセット1.潜在的なDNAの環状領域 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/DATASET1-CENPK.xlsx">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 示されたシーケンスデータであり、348の領域について分析します。列は、AD、eccDNAマッピングされています。推定上eccDNAが同定された、サンプル（左から最初のカラム）。 B、​​染色体。 CD、開始および推定eccDNAsの座標を終了します。 EH、eccDNAコンテンツ。 E、自律的領域（ARS）配列を複製。 F、地域の完全な遺伝子; G、領域に含まれる遺伝子の一部。 H、BLASTN-同定された遺伝子。 IO、EccDNAカバレッジとp値。私は、BPで一意に注釈付きの配列と最長の領域と、 J、すべての数は、読み込みマッピングされました。 Kは、すべてのマップされたのカバレッジは、マッピングされた百万読み出す（FPKM）からキロバイトあたりの断片によって読み取ります。モンテカルロシミュレーションから偶然発生に比べ、推定eccDNA用L、p値; M、国連の数iquely読み込み、マッピングされました。 NO; KおよびLのみが一意にマッピングされた使用など（UFPKM）を読み出します。読み取りおよび20は説明したように、モンテカルロシミュレーションであったのマッピングのためのパラメータ。

この論文は、染色体外環状DNA（eccDNA）を精製するためのCircle-Seqと呼ばれる高感度な方法を紹介しています。この方法には、カラム精製、残存する直鎖状染色体DNAの除去、ローリングサークル増幅、ハイスループットシーケンシングが含まれます。Circle-Seqは、真核生物のeccDNAのゲノムスケールのスクリーニングや、ゲノムの不安定性やコピー数多型の研究に応用できます。

真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

真核細胞からのゲノムワイドな染色体外環状DNAの精製。こんにちは、Rasmusです。ここでは、環状DNA精製法の全容について説明します。第一部では、酵母細胞の培養および回収を行います。次に、3つのステップで環状DNAの精製および増幅を行います。まず、カラム分離によって環状DNAを精製し、濃縮します。次に、エキソヌクレアーゼでDNAを処理して残りの線状DNAをすべて消化し、最後にphi-29ポリメラーゼを用いてDNAサークルを増幅します。このプロトコルの第5部では、DNAサークルのシーケンシングを行い、リードをSaccharomyces cerevisiaeのリファレンスゲノムにマッピングします。このビデオの最後に、いくつかの代表的な結果を示します。今後の研究への展望と、本手法を用いる利点について説明します。パート1は細胞の回収です。スターター培養液を30°Cで振盪しながら最大密度まで増殖させます。最大密度はおよそ200 million cells/mLであり、24〜48時間後に到達します。増殖した培養物をFalconチューブに移し、3分間遠心分離してペレット化します。上清を除去します。大きなペレットをTEバッファー中でボルテックスし、再度遠心分離してペレット化します。パート2、カラム精製です。このステップでは、細菌のゲノムDNAから高度に精製されたプラスミドを得ることができる市販のカラム精製キットを使用します。酵母にこのキットを使用する前に、細胞壁を破壊する必要があります。これは、洗浄した細胞ペレットをキットのL-1バッファーで再懸濁することで行います。細胞懸濁液をマイクロセントリフュージチューブに移し、全容量の3分の1のガラスビーズを加えます。サンプルを最大速度で10分間ボルテックスし、2,000 rpmで30秒間遠心分離してビーズを除去します。上清を新しいチューブに移します。この方法では、高度に希釈したプラスミドを3つの異なる比率で上清に添加します。サイクルに高度に希釈したプラスミドを組み込むことを提案します。これは内部リファレンスガイドとして利用できます。これにより、DNAの精製および増幅の品質チェックを行うことができるほか、これらのスパイクインプラスミドを用いて、細胞あたりの非環状DNAの半定量的推定を行うことができます。他の環状DNAの配列解像度に影響を与えるため、添加するプラスミドは高度に希釈したものに限定してください。スパイクしたプラスミドを含む細胞懸濁液をキットのL-2溶液で処理し、キットのプロトコルに従います。カラムにロードした後、カラムを2回洗浄して、タンパク質、脂質、および染色体DNAを除去します。これにより、溶出画分において染色体外環状DNAが高純度に濃縮されます。パート3、線状DNAの消化についてです。このステップでは、エキソヌクレアーゼを使用して残存する線状DNAを消化します。ATP依存性エキソヌクレアーゼは、環状DNAを消化することなく、線状の二本鎖および一本鎖DNAを特異的に標的とします。線状DNAに対するエキソヌクレアーゼの特異性は、DNase処理を29時間行った後のゲル電気泳動によって確認されました。結果から、ゲノムDNAは消化される一方で、プラスミドDNAは赤色の矢印で示されるように残存していることがわかります。酵母は最大1,500キロベースの長さに達する16本の染色体を有しています。したがって、エキソヌクレアーゼ消化を促進するために、希少切断エンドヌクレアーゼを用いて、アクセス可能なDNA末端の数を増加させます。制限酵素NotIを使用する場合、図に示すように、各染色体は最大7回切断されます。カラム精製したDNAを、ヒーティングブロックを用いて37°Cで一晩NotI処理します。NotIを熱不活化した後、切断されたDNAを製造者のプロトコルに従い37°Cでエキソヌクレアーゼで処理します。エキソヌクレアーゼ処理後、酵素を70°Cで30分間熱不活化します。追加のATPとエキソヌクレアーゼを用いてすべての線状染色体DNAを消化するには、数日かかる場合があります。すべての線状DNAが完全に消化されていることを確認するため、ACTIなどの内部参照遺伝子を用いたPCRまたはqPCR法によりサンプルを分析します。パート4、DNAの増幅。このステップでは、phi-29ポリメラーゼを用いて環状DNAを濃縮および増幅します。反応は、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドとphi-29を用い、30 °Cで進行します。このポリメラーゼは高い忠実度と校正活性を備えており、偏りのないDNA増幅を可能にします。各ポリメラーゼは、ローリングサークル複製により、最大100 kilobasesのDNAを合成できます。また、このポリメラーゼは非常に高いプロセッシビティを持ち、DNAを最大10⁹倍まで増幅します。パート5、シーケンシング。ハイスループット次世代シーケンシングプラットフォームのプロトコルに従い、DNAを平均300 base pairsのサイズにソニケーションし、141 nucleotideのシングルエンドリードとしてシーケンシングします。シーケンスリードは、Galaxyの無料データベースを用いて、Saccharomyces cerevisiaeのリファレンスゲノムにマッピングします。シーケンスデータはGalaxyにアップロードされ、部分的なリードのマッピングが可能なショートリードアライナーであるBowtie2を用いてリードのマッピングが行われます。パート6では、代表的な結果について説明します。シーケンシングおよびSaccharomyces cerevisiaeのリファレンスゲノムへのマッピング後、Galaxyソフトウェア内のゲノムブラウザでリードを可視化することができます。例えば、画面に示されているように、1 kbを超えるコヒーレントリードを含む領域として、環状由来のDNAをカウントすることができます。1 kbを超えるコヒーレントリードを含む第4染色体上の領域の一例として、ヘキソース輸送体遺伝子6および7が存在する領域が挙げられます。酵母細胞集団にこの手法を適用すると、この遺伝子座にマップされたリードが頻繁に見つかり、リードカバレッジからパラログのヘキソース輸送体遺伝子間にDNAサークルが形成されたことが明確に示唆されます。ヘキソース輸送体遺伝子間に高い配列相同性が認められるため、不適切な相同組換えがこのDNAの環状化を引き起こすと我々は考えています。環状DNA変異のモデルは、DNA修復プロセスが不完全に行われた場合に生じます。例えば、反復配列内で二本鎖切断が発生すると、同一染色体上の相同配列が相同組換えによるDNA修復のテンプレートとして利用される可能性があります。切除、ストランド侵入、DNA合成、およびすべての接合部の解消を経て、ゲノムからDNAサークルがループアウトすることで、染色体上のDNA欠失が引き起こされます。エキソヌクレアーゼおよびphi-29ポリメラーゼでDNAを処理した際の効果は、プロピジウム йоウ化物染色を用いて可視化できます。ゲノムDNAの染色コントロールは左の画像のように見え、プラスミドDNAは右の画像のように見えます。400 nanogramsのゲノムDNAを29時間エキソヌクレアーゼ処理した後、左の画像に示すように、DNAの大部分が消化されます。この結果は、右のゲル画像に示すゲル電気泳動によって確認されます。72時間のエキソヌクレアーゼ処理の後、phi-29ポリメラーゼによるDA合成を行うことで、依然として数百万コピーのDNAを同定することが可能です。同様に、400 ngのゲノムDNAとさらに100 ngのプラスミドDNAを29時間エキソヌクレアーゼ処理すると、ゲノムDNAの大部分が消化されます。しかし、ゲル画像に示されているように、プラスミドDNAは消化されません。72時間エキソヌクレアーゼ処理したサンプルをphi-29ポリメラーゼで処理すると、増幅されたDNAの大部分が染色されたプラスミドとして現れます。まず、環状DNAについて遺伝子のスクリーニングを行ったところ、数百種類もの異なるタイプのDNAサンプルが見つかり、非常に驚きました。酵母集団においてDNAサークルがいかに一般的であるかという結果に本当に驚かされましたし、この手法は多くの種類の研究に活用できると考えています。当然ながら、その一つとしてヒト組織の調査などが挙げられます。遺伝子は、環状要素や酵母、さらには腫瘍細胞においても増幅されることが知られています。一般的に、体細胞を観察し、そこにどのような種類の環状DNAが存在し、この環状化がどのような影響を及ぼすのかを調査することは非常に興味深いと考えています。老化細胞においては、加齢に伴い環状DNAが蓄積し、環状DNA上に存在する遺伝子が増加することが予想されます。さらに、DNA環状化の分子メカニズムについて検討したいと考えています。そのための有効なアプローチは、相同組換えおよび非相同末端結合に欠損がある変異体を用いて酵母で解析することです。これらの変異体を研究することで、変異体の種類によってDNA環状化のプロファイルが異なることが予想され、酵母を用いた研究からDNA環状化についてより多くの知見を得られることが期待されます。したがって、他の手法と比較して、本手法は非常に感度が高く、実際におよそ10,000個に1個の細胞からDNA環を検出できる可能性があります。また、詳細にわたって行われた試験研究から分かっている限りでは、変異アレルは通常、検出可能になるまでに集団の1〜10%の割合に達する必要があります。そして、この手法を用いれば、他の手法とは異なり、形成されたDNAサークルの事前知識を持つ必要はありません。あるいは、DNAサークルがある程度結合していれば、シーケンシングや染色体染色による増幅として容易に検出することが可能です。ええ、やはり最大の利点は感度にあり、この方法で多くの興味深い取り組みができることを期待しています。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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