ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

このプロトコルの全体的な目標は、ゼブラフィッシュを使用して、ゲンタマイシンやシスプラチンなどのネフロトキシンの効果を観察し、急性腎障害をモデル化することです。この技術の主な利点は、ゼブラフィッシュモデルにより、急性腎障害後の細胞損傷と再生のリアルタイムイメージングが可能になることです。この手順を開始するには、5インチのまっすぐな解剖針の端にゲルローディングチップを取り付けて、マイクロインジェクション用の胚位置決め用の胚操作ツールを準備し、テープまたは瞬間接着剤で固定します。

次に、ピペットプーラーを使用してフィラメントで磨かれたホウケイ酸ガラスを引っ張ることにより、細い先細りのマイクロインジェクション針を準備します。次に、かみそりの刃または細い鉗子のエッジを使用して針の先端を切断し、鋭い角張った注入先端を作成します。その後、針の先端を保護するために、ペトリ皿のモデリング粘土のストリップに針を置きます。

マイクロインジェクショントレイを作成するには、アガロースをE3と一緒に電子レンジに溶解することにより、100ミリリットルの三角フラスコに1.5%アガロースE3溶解を調製します。.その後、室温で約10分間冷まします。冷却したアガロースE3溶液をペトリ皿に注ぎ、深さ約0.5センチの土台を作ります。

固まったら、2層目のアガロースE3溶液を注ぎます。次に、プレハブの胚井型を寒天に、気泡を避ける角度で挿入し、アガロースを室温で固化させます。マイクロインジェクショントレイ全体が固まったら、プレハブの胚ウェルモールドをゆっくりと慎重に持ち上げてから、皿にE3溶液を充填し、摂氏4度で保存します。

この手順では、ゼブラフィッシュの嵌合水槽を嵌合チャンバーに仕切りを配置して設置し、システム水で満たします。次に、仕切りの両側に1匹の魚を置き、各交配室に1匹の雌と1匹の雄魚が含まれるようにし、両方の交配室を覆います。翌朝、ディバイダーを取り外してスポーンを有効にします。

約30分後、タンクの底に胚がないか確認します。次に、魚を水槽に戻し、交配タンクの水を細い金網のストレーナーツールに通して胚を収集します。次に、ストレーナーをペトリ皿の上で反転させ、E3ですすいで胚を収集します。

その後、胚を摂氏28.5度で一晩インキュベートします。胚が体節期24〜26に達したら、ほとんどのE3培地をデカントします。次に、E3培地を加えてそれらを脱角化し、次に胚の各皿に100マイクロリットル/ミリリットルの50ミリグラムのプロナーゼを加え、次に胚を摂氏28度で15分間インキュベートします。

15分後、皿にE3を入れ、次に穏やかに渦を巻いて胚から絨毛膜を取り除きます。次に、E3プロナーゼをデカントし、25ミリリットルの新鮮な E3.To で皿をすすぎ、色素沈着の発生をブロックし、受精の24時間後にE3を25ミリリットルの新鮮なE3PTUに置き換えます。数日間にわたる実験の場合は、E3 PTU溶液を1日1回新しい培地と交換して、皿を清潔に保ちます。

注射当日は、適切なビヒクル制御を使用して、目的のネフロトキシン溶液を調製します。渦を巻くか、穏やかに混ぜます。その後、チューブの側面と水柱の上部をチェックして、薬物が溶液に溶解していることを確認します。

細いゲルローディングチップを針の後ろに通すことにより、トリミングされたマイクロ注射針に2〜3マイクロリットルのネフロトキシンをロードし、テープで針を垂直に吊り下げて、溶液がトリミングされた針の先端に重力で満たされるようにします。針先がいっぱいになったら、ロードした針をマイクロマニピュレーターに固定します。マイクロメータースライドに鉱油を一滴垂らしてマイクロ注入量をテストし、オイルに注入して液滴サイズを評価します。

次に、インキュベーターから胚の皿を取り出し、胚皿に5ミリリットルの0.2%トリカインを加えて麻酔をかけます。その後、トランスファーピペットで胚を射出成形金型に移します。各胚を型の異なるウェルに操作し、頭をウェルの最も深い領域に配置して、体幹がくぼみに沿って休み、尾が少し突き出るようにします。

次に、充填した針をマイクロマニピュレーターに挿入し、針先を胚の隣に配置します。針を尾静脈にそっと挿入してマイクロインジェクションします。この手順の最も重要なステップは、マイクロインジェクションです。

成功を確実にするためには、針を鋭角に切断し、胚の隣の位置に慎重に移動させる必要があります。注入が成功すると、液体が循環に入るのが見えるはずです。腎毒性物質と蛍光標識デキストリンの同時注射により、研究者は手順後に注射が成功したことを確認できるようになります。

その後、胚から針をそっと取り出します。胚を清潔な皿に移し、すすぎ、新鮮なE3 PTUでトリカインを除去します。次に、胚を所望の時点までインキュベートして形態を評価し、メチルセルロースマウント培地での写真撮影によって文書化できます。

または、必要に応じて実験分析のプロセス。胚の回復は、注射後12〜24時間ごとに評価して、一般的に腎障害を示す浮腫のある個人の割合を決定する必要があることに注意してください。.ゼブラフィッシュの胚の透明性は、マイクロインジェクション手順を容易にし、24 hpfでのPTU化学処理によってさらに強化することができ、典型的な実験時間経過中の色素沈着の進行を抑えることができます。

ここでは、胚標本を72 hpfの段階まで発育させた後、模擬注射、生理食塩水ビヒクルによるマイクロ注射、またはミリリットルあたり2.5ミリグラムのゲンタマイシンをマイクロ注射しました。その後のライブ観察は、注入後1日と2日後に、実体顕微鏡によるトランスイルミネーション照明を用いて行った。模擬胚や生理食塩水注入胚と比較して、ゲンタマイシン注射された個体のみが浮腫の発症を示しました。

この場合、心膜浮腫は、以前に発表された観察と一致する正常な腎臓機能の無効化を示唆しています。この手順に続いて、ネフロトキシン曝露後の遺伝子発現の変化にアクセスするために、ホールマウントC2ハイブリダイゼーションなどの他の方法を実施することができる。