Name: ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュを用いた腎毒素マイクロインジェクション法で急性腎障害モデルを構築する手法です。リアルタイムイメージングにより細胞損傷と再生過程を観察し、腎保護戦略の開発に貢献します。

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この作品は、NIHの助成金DP2OD008470によって部分的にサポートされていました。また、RAMはノートルダム大学院の大学によって提供される資金によって部分的にサポートされていました。私たちは、ノートルダム大学で生物科学科、ゼブラフィッシュ研究センター、および幹細胞のためのセンターと再生医療のスタッフに感謝します。我々は、特に腎臓の生物学とこの仕事上での有用なフィードバックについての議論を係合するための研究室のメンバーに感謝します。

このプロトコルで説明ゼブラフィッシュ胚を操作するための手順は、ノートルダム大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 ソリューションの調製<ol><li> 73.0グラムのNaClを混合することにより、E3胚メディアの50倍原液を作成し、3.15グラムのKCl、9.15グラムの塩化カルシウム、および蒸留水5リットル中に9.95グラムのMgSO 4、および室温で保存してください。 </li><li>ゼブラフィッシュ胚の培養のために、殺菌剤として作用するように、1×E3のすべての1 Lに0.05％メチレンブルー200μlのを追加し、蒸留水で1×作業溶液にE3胚のメディアの株式の50倍ストック溶液を希釈し、そして店RT。 </li><li> 0.06ミリグラムPTUで50倍E3株式の40ミリリットルを組み合わせることにより、0.003％の1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）とのE3胚メディアの色素沈着ブロッキング溶液を作ります。その後、蒸留水で2 Lの合計にボリュームをもたらします。 </li><li>溶液中にPTU粉末を得るために、室温でE3 / PTU O / Nをかき混ぜます。その後でE3 / PTUを保存RT。 注：E3 / PTUは、約1週間の貯蔵寿命を持っており、古いソリューションは、ゼブラフィッシュの幼虫に色素沈着の開発を阻止ではあまり効果的であろう。 </li><li> 500mlの蒸留水にトリカインの1グラムを追加することにより、0.2％トリカイン（MS-222）の麻酔液を作成し、1 Mトリス、pHを9.5と7.2にpHを調整します。 </li><li> 1X E3（NOメチレンブルー）の溶液を配置することによって、撮像のために2％メチルセルロース溶液を作るために準備する、0.2％の1/10容量のトリカインを4℃で加えました。 注：メチルセルロース溶液を穏やかに顕微鏡用生胚を安定化するために使用される厚さ、透明な溶液です。操作が行われた後、胚は、動物を傷つけると同じ試料の後続段階で顕微鏡検査を可能にすることなく、メチルセルロースを溶解させるために1×E3で洗浄することができます。 </li><li> 4℃に冷却したときに、攪拌プレート上で激しく1×E3 /トリカイン溶液を攪拌し、徐々にメチルの適切な量を加えます激しく攪拌しながらセルロース粉末。徐々に不溶性メチルセルロース凝集体の形成を防止するために、溶液に粉末を加えます。 </li><li>全ての粉末は2％メチルセルロース/ E3 /トリカイン溶液に混合した後、4℃のコールドルームO / N複合溶液をかき混ぜます。 注：冷たい温度が完全に粉末を溶解するための最善の方法です。解決策は、1泊分後に明らかになっていない場合は、追加の稼働日および/または第2のO / N撹拌します。 </li><li> 30分間または2時間まで4℃で高速（12,000 XG）で1.5 mlチューブやスピンに2％メチルセルロース/ E3 /トリカイン溶液を、一定分量の混合物から気泡を除去するには。 </li><li>長期保存のために4℃で2％メチルセルロース/ E3 /トリカインソリューションを配置します。 注：使用前に、アリコートは、ゼブラフィッシュの試料を操作するためのRTに予め温めなければなりません。 </li></ol>ツールの作製<ol><li>経口投与のために使用される胚マニピュレータツールを準備します5「ストレート解剖針の端部にゲルローディングチップを取り付けることによって、マイクロインジェクションのための胚をsitioning、およびテープまたは瞬間接着剤で固定します。 </li><li>第1の器具の中にフィラメントと10cmのホウケイ酸ガラスを研磨し、ハンドルを締めて、ホウケイ酸ガラスを固定して火を置くことによって、ニードルプラーを使用して、マイクロインジェクション針を準備します。 </li><li>ファインテーパー針を形作るためにホウケイ酸ガラスを引き出します。熱540、245を引っ張って、速度200、および時間125：次の設定を使用します。 </li><li>粘土のストリップにそれらを中断するペトリ皿の内側置き針は、針の先端を保護し、埃の蓄積を防ぐために覆われた皿を維持します。 </li><li>マイクロインジェクション用の針を準備完了するには、約0.05〜0.1ミリメートルの直径を有する鋭い角度の噴射口を作成するために、針の引っ張ら終わりをカットするかみそりの刃や細かい鉗子エッジを使用しています。 </li><li>マイクロインジェクショントレイを作成するには、10で1.5％アガロース/ E3液を調製0 mlの三角フラスコ、電子レンジで沸騰するE3を加熱してアガロースを溶解は、その後、約10分間室温で冷却します。 </li><li>約0.5センチメートルの深さに基礎を作るためにペトリ皿に冷却し、アガロース/ E3ソリューションを注ぎます。場合、これは約0.3センチメートルの深さを有​​する第2の層を注ぎ、プレハブ胚ウェル金型を挿入し、アガロースは室温で固化することを可能に固化しました。 注：気泡の数を減少させる角度で寒天に金型を配置し、トップアガー/ E3層に金型を挿入します。 </li><li>全体のマイクロインジェクショントレイが設定されている場合には、その後、4℃でのE3ソリューションとストアで皿を埋める、ゆっくりと慎重に薬匙を用いて成形するだけでなくプレハブ胚を持ち上げます。 </li></ol> 3.胚の準備<ol><li>交配室に分周器を配置することにより、ゼブラフィッシュの交配タンクを設定し、システムの水で満たします。 </li><li>分周器Sの両側に1つずつの魚を置きますUCH各嵌合室は、一女性と男性1魚を含み、各嵌合室をカバーします。 </li><li>翌朝、産卵を有効にするには、仕切りを取り外します。 </li><li>約30分後に魚を確認し、水槽に大人に戻した後、細いワイヤメッシュストレーナツールを使用して、相手の水槽の水を通過させることによって、それらの胚を収集します。 </li><li>ペトリ皿の上にストレーナーを反転し、胚を収集するためにE3で洗い流してください。 </li><li> 28.5°CO / Nで胚を培養します。 </li><li>胚が24-26体節ステージ26に達したときに、胚の各皿に50 mg / mlでプロナーゼの100μLを添加し、約15のためにRTでディッシュ（23°C）をインキュベートすることによってdechorionateその後E3メディアのほとんどとをデカント分。 注：彼らは方法で収集された場合に胚が24-26体節の段階に到達することが受精の時から約24-25時間がかかります28.5℃でO / Nを説明し、インキュベートしました。 </li><li>で皿を埋めますE3、その後胚から絨毛膜を取り除くために、穏やかに旋回。 </li><li> E3 /プロナーゼをデカントし、新鮮なE3 25mlで皿をすすぎます。すべてのプロナーゼを除去するためのステップをすすぎ繰り返します。 </li><li>色素沈着の開発をブロックするには、E3をデカントし、胚は24時間後の受精に達したときに新鮮なE3 / PTUの25ミリリットルと交換してください。 注：数日に及ぶ実験のために、きれいな皿を保つために一日一回新鮮な培地でE3 / PTU液を交換してください。 </li></ol>腎毒素ソリューションの4マイクロインジェクション<ol><li>注射の日に、適切な車両制御を持つに沿って所望の腎毒素溶液を調製。 </li><li>ボルテックスまたは薬剤（複数可）を保証するために穏やかに混合は水柱のチューブとトップの側面を確認、/は溶液中にあります。 注：腎毒素のソリューションは、マイクロインジェクション効率を監視し、また、subseqで腎クリアランスを評価するために、蛍光共役デキストランの微量を含むように調製することができますuent時間は20,28ポイント 。 </li><li>針の背面に微細なゲルローディングチップをねじ込むことによって腎毒素の〜2-3μlのでトリミングされたマイクロインジェクションの針をロードし、溶液が重力によってトリミングされた針の先端を埋めることができるように、テープの切れ端で垂直に針を一時停止します。 </li><li>針先がいっぱいになると、マイクロマニピュレーターでロードされた針を固定します。 </li><li>マイクロスライド上に鉱物油の滴を配置することによって、マイクロインジェクションボリュームをテストし、液滴の大きさを評価するために、油に注入します。 500 PLの注入量は、0.1mmの直径を有します。 </li><li>インキュベーターから胚の皿を外し、胚ディッシュに0.2％トリカインの約5ミリリットルを添加することにより、麻酔。 </li><li>完全な麻酔を確実にするために、静かに胚マニピュレータツールの先端で胚をタッチします。運動の欠如は、十分な麻酔を示しています。 </li><li>成功した麻酔後、TRANSFで射出成形金型に胚を転送えーピペット。 </li><li>トランクがうつ病に沿って置かれ、尾は、うつ病の外にまでこだわったように、ウェルの最も深い領域にヘッドを配置し、金型の異なるウェルに各胚を操縦。 </li><li>マイクロマニピュレーターに充填された注射針を挿入し、次の胚への針の先端を配置します。 </li><li>軽く前方ジョイスティックを動かすことにより、テール容器に針を挿入し、マイクロインジェクションを提供するためにフットペダルを押し下げます。 注：成功した注射は、液体が循環に入る見によって評価することができます。また、蛍光共役デキストランと腎毒性の同時注射は、手順の後に成功した注入を確認するために研究者を可能にします。 </li><li>静かに胚から針を除去するために、ジョイスティックに引き戻します。 </li><li>注入後、きれいな皿に胚を転送し、トリカインを除去し、新鮮なE3 / PTUに置き換えるすすぎます。 </li><li>ロバに所望の時点に胚をインキュベート所望のように実験的な分析のためメチルセルロース取り付けメディア、またはプロセスに写真撮影によって文書化することができるの形態、。 注：胚の回収は、浮腫を有する個体の割合を決定するために評価されるべきであり、一般に腎障害を示しています。 </li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

治療薬の多様な数はAKI 29と関連しています。アミノグリコシドゲンタマイシン30と広く使われている化学療法シスプラチン31,32のような多くの個々の化合物によって誘発された損傷を理解する上で重要な研究の進歩がありました。これらの条件に関わるいくつかの病理学的変化は、しかし、現在進行中の研究の対象残ります。一つの緊急の課題は、このような重要な医療環境と高齢者の29のもののような高リスク集団で特に、悪患者にどのように影響するかを複数の薬物理解まま。したがって、薬剤誘発性AKIの効果についてさらにセルラーベースの研究を可能にするモデルは、この状態の検出を改善し、ダイナミックな薬物相互作用を鑑賞する上で重要な役割を果たし。 マウスやラットなどの哺乳動物モデルでの作業は、AKI、府次の腎臓における細胞の変化を確立するために不可欠なされていますこれらのシステムとのトン1の制限は、直接、リアルタイム観察が原因で建築の複雑さや器官の内部の場所に制限されることです。簡単に言えば、腎臓は、個人が腎臓を分析するため...

AKIは壊滅的な健康影響1につながる可能性が腎臓機能の突然の喪失です。 AKIはさらに高いクリティカルケアの例30〜50％に金利や高齢者、および50から70までパーセント1-3の死亡率で、起因する入院患者のうち、約20％の高い発生率に世界的な重大な医療問題です。残念ながら、AKIの有病率は増加しており、今後10年間でさらにエスカレートすると予測され、一部起因でAKIを誘導することができる要因の多様性、術後ストレス、虚血、および抗生物質などnephrotoxinsへの曝露が含まれると化学療法薬4。 AKIは、一般的に本質的な機能単位であるネフロン、で発生した、腎臓内の急激な細胞の損傷を伴う、および血液フィルタと中央集合管1内に尿を排出セグメント化された尿細管で構成されています。ネフロンのかなりの数がある場合AKI中に破損し、即時の効果は循環からの廃棄物のクリアランスの中断を含み、そして死んだと死細胞1から障害物に起因するネフロンを通る流体の流れを減少または廃止します。時間が経つにつれて、管状閉塞が永久的に腎機能1を減少させる、全体ネフロンの変性につながることができます。 AKI以下の腎臓における生理的な変化はまた、慢性瘢痕1につながることができ、複雑な炎症性事象を伴います。 これらの成果にもかかわらず、ネフロンは、尿細管上皮の5,6を再構成AKI後に再生を受けるためにいくつかの能力を持っています。ネフロン再生の増加分子的理解があったが、メカニズムは多くの点でとらえどころのないままにし、継続的な調査7を必要とします 。 AKIは永久的な腎障害をもたらすの程度も不明のまま。現在の研究は、腎臓のための再生能力がであることを示唆していますより顕著または反復エピソードが慢性腎臓病（CKD）につながり、救命移植または透析8,9を必要とする末期腎疾患（ESRD）に絶頂に達する一方で、最高、AKIの重症度の低い例を以下に示します。また、すでにCKDに罹患している個体は、AKI 8,9の重度のエピソードを収縮のより高い危険にさらされています。まとめると、AKIを、理解し治療および予防するために不可欠である基礎および臨床研究を続けていることは明らかです。 動物モデルでの研究は、AKI 10中に発生する地域や環境変化の進行を鑑賞してきました。この理解を広げるだけでなく、新しい治療法を開発するには、ゼブラフィッシュ動物モデルは、さまざまな方法11,12の様々な使用されています。ゼブラフィッシュ腎臓のネフロンは、胚および成体の両方において、哺乳類13-16と保全の高度を表示します。 ZEでさらに、ネフロン上皮傷害brafishは、尿細管細胞の局所的破壊がネフロンアーキテクチャ17-19の管内増殖および再構築が続いていることにより、高等脊椎動物におけるプロセスに似ています。胚では、しかし、シスプラチンのようなnephrotoxinsから大規模な細管損傷は致死20,21と関連しています。比較すると、ゼブラフィッシュ大人のAKIを生き残るためには、腎臓における実質的な回生機能を発揮します。例えば、アミノグリコシド系抗生物質ゲンタマイシンへの曝露後に、ゼブラフィッシュは、尿細管上皮の損傷を再生成し、新しいネフロン単位だけでなく22-24を成長させます。これらのゲンタマイシン誘発性AKIの研究は、多様なnephrotoxinsから腎障害を理解し、貴重な情報を提供してきたが効果や損傷25の異なるタイプへの応答を理解することが重要で残っています。 その大きさ、透明性、および遺伝的取り扱いやすさのためにゼブラフィッシュの胚は、腎毒素の研究のための多くの利点があります&lt;マイクロインジェクション20,21の方法は、調査のための分子を投与するために使用されるSUP&gt; 25、。ネフロンは、24時間後に受精（HPF）により形成され、約48 HPF 26,27により血液をフィルタリングするために始めています。このように、胚性腎臓の急速な形成と機能は実験的な分析を容易にします。しかし、マイクロインジェクションのプロセスは、技術的な課題があり、技術の習得に急な学習曲線が存在することができます。このビデオの記事では、我々はマイクロインジェクションを行い、成功した注射の速度を高めるために、トラブルシューティングのヒントを提供する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>アメリカのバイオ分析</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>アメリカのバイオ分析</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>アメリカのバイオ分析</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>N-フェニルチオ尿素 (PTU)</td><td>アルドリッチ化学</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>エチル 3-アミノ安息香酸 (トリカイン)</td><td>フルカ アナリティカル</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン ディポザブル ペトリ皿、滅菌、コーニング:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;(マイクロインジェクショントレイ) 150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>低温インキュベーター</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖ピンセット</td><td>ロボズ 外科用器具</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>マイクロメータ</td><td>テッド・ペラ社</td><td>2280から24</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

腎臓は、それらが血流からフィルターの化学物質への曝露から害の影響を受けやすいです。これは、急性腎障害（AKI）として知られている臨床症候群の腎機能と開発の急速な減少に関連した臓器損傷につながることができます。薬剤は、単独または他の薬剤と組み合わせて投与した場合、AKIを開始することができ、細菌感染から癌までの医療状況を治療するために使用されます。ゼブラフィッシュ彼らは人間を含む高等脊椎動物で保存されているネフロン機能単位で構成される胚腎臓を形成するように、in vivoでの腎機能に対する化学的影響を研究するための有用な動物モデルです。さらに、ゼブラフィッシュは、AKIの細胞および分子面を解明し、そのような腎保護分子の同定などの治療戦略を開発するための機会を与える遺伝的および化学的なスクリーニングを行うために利用することができます。ここでは、中にどのようにマイクロインジェクションを実証しますゼブラフィッシュ胚は、腎毒素の研究のためのパラダイムとして利用することができます。

セットアップマイクロインジェクション局は実体顕微鏡、マイクロマニピュレータと圧力調整器（ 図1A）が含まれています。噴射プレートの透照この手順（ 図1B）の間に試験片を表示することが好ましいです。注射針の製造は、切断し、最後にバックロード針を用いてエッジを調製し、続いて適切なホウケイ酸ガラスを、引っ張る伴います。最適には、針の先端は、切断手順の間（ 図1C）、このような微細な鉗子として急激に切断器具の縁部に角度を付けることにより行われるカットを鈍らのではなく、面取りされています （ 図1D）。この面取りエッジが重要であり、非常に静かにゼブラフィッシュに針を挿入する能力に影響を与えます。 注射の日に、胚を頑丈しかし柔軟な胚を使用して配置しました操作ツー...

抗生物質から化学療法に至るまで薬物が含まnephrotoxinsから発生腎損傷は、その病因が完全には理解のまま、複雑な障害をもたらすことができます。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの腎臓保護措置の同定に適用することができ、これらの条件、疾患のモデリングのために使用することができる方法を示します。

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

本プロトコルの全体的な目的は、ゼブラフィッシュを用いてゲンタマイシンやシスプラチンなどの腎毒性の影響を観察し、急性腎不全をモデル化することです。この手法の主な利点は、ゼブラフィッシュモデルを用いることで、急性腎不全後の細胞損傷と再生をリアルタイムでイメージングできることです。この手順を開始するために、5インチの直線解剖針の先端にゲルローディングチップを取り付け、テープまたは瞬間接着剤で固定し、マイクロインジェクション用に胚を配置するための胚操作ツールを準備します。次に、ピペットプラーを用いて、火炎研磨したホウケイ酸ガラスをフィラメントで引き伸ばし、先端が細くなったマイクロインジェクション針を数本作製します。その後、カミソリの刃または精密ピンセットの端を使用して針先を切り、鋭角な注入先端を作製します。続いて、針先を保護するため、ペトリ皿の中のモデリングクレイの上に針を配置します。マイクロインジェクション用トレイを作成するには、100 mLのエルレンマイヤーフラスコに1.5%アガロースE3溶液を準備し、電子レンジでアガロースをE3に溶解させます。その後、混合液を室温で約10分間冷却します。冷却したアガロースE3溶液をシャーレに注ぎ、厚さ約0.5 cmの土台を作成します。凝固後、アガロースE3溶液の2層目を注ぎます。次に、気泡が入らないように斜めに、作製済みの胚ウェル成形型をアガロースに挿入し、室温でアガロースを凝固させます。マイクロインジェクション用トレイ全体が固まったら、作製済みの胚ウェル成形型をゆっくりと慎重に持ち上げ、ディッシュにE3溶液を満たして4 °Cで保存します。この手順では、交配チャンバーに仕切りを設置してゼブラフィッシュの交配タンクを準備し、システム水で満たします。次に、各交配チャンバーに雌1匹と雄1匹が入るように、仕切りの両側に魚を1匹ずつ配置し、両方の交配チャンバーに蓋をします。翌朝、仕切りを取り除いて産卵を促します。約30分後、タンクの底に胚があるか確認します。その後、魚をアクアリウムに戻し、交配タンクの水を細かいワイヤーメッシュストレーナーに通して胚を回収します。次に、ストレーナーをシャーレの上に逆さにして置き、E3で洗浄して胚を回収します。その後、胚を28.5 °Cで一晩インキュベートします。胚が24〜26ソマイト期に達したら、E3培地の大部分をデカンテーションで除きます。次に、E3培地を加え、各胚のディッシュに50 mg/mL pronaseを100 µL添加し、28 °Cで15分間インキュベートして脱脈絡膜処理を行います。15分後、ディッシュにE3を満たし、ゆっくりと回して胚から卵膜を剥離させます。その後、E3プロナーゼをデカンテーションで除き、25 millilitersの新しいE3でディッシュを洗浄します。色素沈着の発現を抑制するため、受精から24時間後にE3を25 millilitersの新しいE3 PTUに交換します。数日間にわたる実験の場合は、ディッシュを清潔に保つため、1日1回E3 PTU溶液を新しい培地に交換してください。投与当日、目的の腎毒性物質溶液を適切な溶媒コントロールとともに調製します。ボルテックスまたは穏やかに混合してください。その後、チューブの側面と液面の表面を確認し、薬剤が溶液中に完全に溶解していることを確認します。微細なゲルロードチップを針の後端に差し込み、2～3 µLの腎毒物をトリミング済みのマイクロインジェクション針に充填します。その後、針をテープで垂直に固定し、重力によって溶液がトリミング済みの針先に満たされるようにします。針先が満たされたら、充填済みの針をマイクロマニピュレーターに固定します。マイクロメーターのスライドガラス上にミネラルオイルを1滴滴下し、そこに注入して液滴のサイズを確認することで、マイクロインジェクション量をテストします。次に、胚が入ったディッシュをインキュベーターから取り出し、0.2% tricaineを5 mL加えて胚を麻酔します。その後、転送用ピペットを用いて胚を注入用モールドに移します。各胚をモールドの異なるウェルに配置し、体幹部がくぼみに沿って収まり、尾部が少し外に出るように、頭部をウェルの最も深い部分に置きます。次に、充填済みの針をマイクロマニピュレーターに装着し、針先を胚の横に配置します。マイクロインジェクションを行うため、針を尾静脈にゆっくりと刺入します。この手順において、マイクロインジェクションが最も重要な工程となります。確実に成功させるためには、針を鋭角にカットし、胚の隣の目的の位置まで慎重に移動させる必要があります。注入が成功すると、液体が循環系に入っていくのが観察できるはずです。腎毒性物質と蛍光標識デキストリンを共注入することで、処置後に注入が成功したかどうかを確認することができます。その後、胚から針をゆっくりと抜きます。胚を清潔なディッシュに移し、新鮮なE3 PTUで洗浄してトリカインを除去します。次に、目的の時点まで胚をインキュベートして形態を評価します。形態は、メチルセルロース封入剤を用いて写真で記録することができます。または、必要に応じて実験解析に供します。注射後12〜24時間ごとに胚の回復状態を評価し、腎損傷の一般的な指標となる浮腫を呈した個体の割合を確認してください。ゼブラフィッシュ胚の透明性はマイクロインジェクションの手順を容易にしますが、一般的な実験期間中の色素形成を抑制するために、受精後24時間（24 hpf）にPTUによる化学処理を行うことで、透明性をさらに高めることができます。ここでは、胚標本を72 hpfまで発生させ、その後、擬似注入を行うか、生理食塩水溶媒をマイクロインジェクションするか、あるいは2.5 mg/mLのゲンタマイシンをマイクロインジェクションしました。その後の生存観察は、ステレオ顕微鏡を用いた透過照明により、注入後1日および2日後に行いました。擬似注入または生理食塩水を注入した胚と比較して、ゲンタマイシンを注入した個体のみに浮腫の発現が認められました。この例では、以前に報告された観察結果と一致して、正常な腎機能の喪失を示唆する心膜浮腫が認められました。この手順に続いて、whole mount C2 ハイブリダイゼーションなどの他の手法を行うことで、腎毒性物質への曝露後における遺伝子発現の変化を評価することが可能です。

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は2日後fetilization（DPF）急性腎障害（AKI）を誘導するためにゼブラフィッシュの幼虫にアミノグリコシド、ゲンタマイシンを、マイクロインジェクションのテクニックを説明します。我々はまた、AKIの媒介の損傷を可視化するためにゼブラフィッシュ幼生の埋め込みプラスチックと切片全体のマウント免疫組織化学のための方法を、説明します。...

急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections

ヒトの急性腎臓損傷（AKI）は腎臓のネフロンを構成する上皮細胞の損傷によって引き起こされる一般的な臨床上の問題であり、AKIは50から70パーセント1の高い死亡率に関連付けられています。この現象を導くメカニズムと限界がよくわかっていないままにかかわらず、上皮細胞の破壊に続いて、ネフロンは、再生する機能が制限されています。このビデオの記事では、我々はターゲットレーザーのゼブラフィッシュ胚の腎臓で腎臓のネフロン細胞の切除、または前腎のための私たちのテクニックを説明します。私たちの新しいメソッドは、AKIの腎毒性誘発性のモデルを補完し、腎臓のネフロンにおける上皮再生に関連付けられている細胞と分子の変化の高解像度の理解を得るために使用することができます。...

腎上皮再生を研究するためにゼブラフィッシュの前腎のレーザーアブレーション

このビデオは、腎機能に対する化学的影響を研究するために、ゼブラフィッシュの胚の尾静脈にネフロトキシンを静脈内注射する方法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚へのネフロトキシンの静脈内マイクロインジェクション:ゼブラフィッシュ胚の血流にネフロ毒性物質を送達する技術

ゼブラフィッシュ成体の腎臓は腎臓の再生や病気の研究のための優れたシステムです。このような研究の重要な側面は、ネフロンの構造と機能の評価である。このプロトコルは、ネフロンの尿細管組成を評価し、腎再吸収を評価するために実施することができるいくつかの方法論を記載している。...

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

ここでは、ゲンタマイシン注射による急性腎障害を誘発することにより、成人の腎臓再生を研究するための信頼性の高い方法を紹介します。損傷はゲンタマイシンの投与量と環境温度に依存することを示し、in situハイブリダイゼーションを使用してlhx1a...

ゲンタマイシン誘発性損傷によって大人ゼブラフィッシュにおける腎再生

この研究は、腎臓GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた分節型腎障害の新しいインビボモデルを提示する。このモデルは、腎上皮細胞の標的アブレーションの誘導を可能にし、ネフロン傷害および修復の細胞機構を示す。...

ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

このプロトコルは、腎毒性物質としてシスプラチンを使用して、成体ゼブラフィッシュに急性腎損傷(AKI)を誘導する手順を記述する。この技術の再現性を評価するステップと、腎組織、フローサイトメトリー、TUNELの炎症と細胞死を分析する2つの技術を詳述した。...

成体ゼブラフィッシュにおけるシスプラチンによる急性腎損傷モデル

アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

このビデオは、モルホリノまたはmRNAが、その後の開発中に特定の遺伝子産物のレベルを増減して1細胞段階でゼブラフィッシュ胚に注入する方法を示しています。...

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

学ぶゼブラフィッシュを用いた腎毒素マイクロインジェクション法で急性腎障害モデルを構築する手法です。リアルタイムイメージングにより細胞損傷と再生過程を観察し、腎保護戦略の開発に貢献します。

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

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