骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

この手順の全体的な目標は、移植された血液細胞のレシピエント骨髄ニッチへのin vivo生着を視覚化し、測定することです。この技術の主な利点は、移植後のドナー造血細胞のさまざまな骨髄ニッチへのホーミング、拡大、局在化などの細胞プロセスを視覚化できることです。このアプローチは、改変動物モデルと組み合わせて使用することで、造血細胞の再生に重要な分子経路を定義するのに役立ちます。

組織学や他のイメージング技術とは異なり、生体内顕微鏡法では、生きた動物の細胞間相互作用を細胞レベルでリアルタイムに捉えることができます。この方法を使用して、骨髄微小環境がNotchシグナル伝達の喪失によって引き起こされる骨髄増殖性疾患の発症の最初の部位であるかどうかを判断することにしました。この技術を初めて使用する個人にとっての課題には、呼吸アーチファクトの最小化、頭部の最適な位置決めと安定化、画像の飽和の回避などがあります。

移植の1〜2時間前に、溶解したEGFPマウスに70%エタノールをスプレーします。次に、手術用ハサミを使用して足首の周りの各脚の皮膚を切開し、手術用鉗子を使用して皮膚と毛皮を一緒に取り除き、きれいな筋肉組織を露出させます。脚からできるだけ多くの筋肉を取り除きます。

次に、膝と足首の関節の骨を切断し、ガーゼスポンジを使用して、大腿骨と脛骨から残っている筋肉組織を取り除きます。洗浄した骨を、10%FBSを添加したDMEMを含む6ウェルプレートですすいでください。次に、4つの後肢の骨すべてをPBS中の10ミリリットルの冷えたEDTAに乳鉢に移し、乳棒で骨を粉砕します。

骨髄細胞を粉砕して単一細胞懸濁液を取得し、70ミクロンのフィルターを介してスラリーを15ミリリットルの遠心分離チューブに濾します。フィルターを2〜3ミリリットルのPBSですすいでください。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを10ミリリットルの新鮮なDMEMと10%FBSに再懸濁します。

注射では、細胞懸濁液を遠心分離し、血清を含まないIMDMで細胞の濃度を10の1.5倍から7番目の細胞にカウントして調整します。細胞を氷の上に置きます。2回目の放射線照射から5〜6時間後に、放射線を受けた各動物の尾静脈に10〜6回目の骨髄細胞を3回注入します。

移植後、適切な時点を追加します。麻酔をかけたレシピエントマウスを摂氏37度の加熱パッドに置き、つま先のつま先つまみに対する反応がないことを確認します。動物の目に軟膏を塗り、尾静脈を介して100マイクロリットルの適切な蛍光マーカーを投与します。.

次に、小さな電気バリカンを使用して動物の頭の背側表面から毛を取り除き、続いて脱毛クリームを塗布します。5分後、ガーゼスポンジでクリームを取り除き、残っている溶液を生理食塩水で洗い流します。70%エタノールを浸した綿棒で頭皮を消毒します。

次に、細い鉗子とはさみを使用して、頭皮に10〜20ミリメートルの正中線の皮膚切開を行い、下にある背側の頭蓋骨の表面を露出させます。5-0サージカルシルクを使用して、切開部の両側に2本のステー縫合糸を配置し、イメージングのためにカルバリウムを露出させるフラップを作成します。露出した頭蓋骨に油を滴下します。

マウスを仰臥位にして、露出した頭皮を顕微鏡オイルで満たされたガラス底皿に浸します。次に、カルバリウムを対物レンズの上に置き、摂氏37度の加熱パッドで動物を覆う多光子イメージングステージに動物を置きます。多光子画像取得中は、ヘッドが正しい位置に安定していることが不可欠です。

定位デバイスを使用するか、必要に応じてマウスをテープで固定します。多光子イメージング用に改造された逆共焦点システムを使用して、2光子レーザーを830ナノメートルに調整します。次に、適切な画像取得ソフトウェアを開きます。

[取得設定]メニューで、一方向のスキャンモードが選択されていることを確認し、スキャン速度をピクセルあたり4マイクロ秒に、フレームレートを512 x 512ピクセルに、ズームを1.5に設定します。0.95の対物レンズで20Xワットを選択します。色素リストウィンドウを開き、2つの光子を選択します。

次に、顕微鏡コントローラーウィンドウでRDM690ミラーを選択します。光路とサイコロウィンドウで、レーザーユニット2ボックスを選択して、2光子レーザーシャッターが開いているかどうかを確認します。EPI Lampを選択し、B / G EPIフィルターキューブを選択します。

次に、対物レンズを標本に焦点を合わせ、中心静脈と冠状動脈縫合糸の分岐点を基準点として使用して、カルバリウム骨髄ニッチの血管の流れを視覚化します。ノンデスキャンモードを使用して、3つの外部検出器を選択し、平均化なしでピクセルあたり4マイクロ秒のスキャン速度で試料をイメージングし、一定のレーザー出力と検出器ゲインを使用して、検出器のダイナミックレンジを最小限にとどめます。組織の深さまで一連の切片を収集した後、適切な専用の3Dから4D画像定量および可視化ソフトウェアを開きます。

製造元の指示に従って、適切な3Dレンダリングアルゴリズムを使用してZスタックをインタラクティブに視覚化します。次に、スポットオブジェクトセグメンテーションモジュールを使用してGFPセルをセグメント化し、スタック演算処理を適用して、緑と赤のチャネルの偽陽性GFPセルを排除します。最後に、Surface Segmentationモジュールを使用して血管系と骨表面のセグメンテーションを改革し、スポットから表面へのX張力距離アルゴリズムを適用して、必要に応じて細胞から任意の遠位表面までの距離を計算します。

ここでは、骨髄カルバリウムの6つの標準領域のそれぞれから収集されたZスタックを、3D最大強度投影、骨成分を含む3Dシャドウ投影、および3Dセグメント画像としてレンダリングし、細胞の定量化と骨および血管からの距離の測定を可能にしました。この実験では、Notch欠損骨髄微小環境における骨髄系細胞のin vivoイメージングにより、ドナー溶解GFP細胞は、移植後24時間で野生型とノックアウトレシピエントで同様のホーミング効率を持ち、その後の時点で異なる生着を示すことが明らかになりました。骨髄前駆細胞の拡大の動態の解析により、適応的に骨髄移植された細胞は、移植後2週間でノックアウトレシピエントにより急速に、より多く増殖することが示されました。

野生型レシピエントのドナー骨髄細胞は、ノックアウト骨髄のドナー細胞が急速に循環するため減少する4週間後のドナー細胞やノックアウトレシピエントよりも2倍多く増殖しましたが、その数は2倍でした。そして、6週間後には、骨髄カルバリウム内のドナー細胞の数の差は横ばいになります。さらに、骨髄移植後6週間でのノックアウトおよび野生型カルバリアの中下部領域の3Dセグメンテーション解析では、溶解したGFP細胞は、両方のタイプのレシピエント動物で骨から同じ距離に局在していることが示されていますが、興味深いことに、ノックアウトマウスでは血管系からより遠くに存在しています。

一度習得すれば、骨髄内イメージングは、適切に実施されれば、マウス1匹あたり1時間30分で完了することができます。このアプローチを使用する際には、マウスごとにカルバリウムの骨髄の複数の領域をサンプリングし、実験ごとに少なくとも3匹のマウスを分析して、サンプル内およびサンプル間の変動に対処することを忘れないでください。このビデオを見た後、骨髄移植と生体内イメージングを組み合わせて、特定の血液亜集団の骨髄微小環境への生着の動態を決定する方法についてよく理解できるはずです。