Name: 骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学ぶ生体内蛍光顕微鏡法（IVFM）を用いて造血細胞の骨髄ニッチへの生着と定着を可視化する方法。遺伝的モデルと組み合わせて細胞動態をリアルタイムで観察し、骨髄微小環境の役割を解明する。

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イメージングを行ったインディアナ センター博士ケン ・ ダン監督、インディアナ大学で生物顕微鏡用。脳定位固定装置は、設計、マーク Soonpaa、ウェルズ小児研究センターによって製作したプロトタイプです。この作品は NIH/R01DK097837-09 (NC) によってサポートされていた、NIH/R01HL068256-05 (NC)、NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC)、MPN 研究財団 (NC)、CTSI 共同プロジェクト IUSM/ノートルダム大聖堂 (NC)。

動物の使用を含むすべてのプロシージャを動物のケアおよび使用委員会のインディアナ大学医学部の承認を行った。行われる国の動物実験に関する法律を遵守することを確認します。
1. Mx1CreRBPJ-/-受信者のマウスの作製
<ol><li>Mx1-Cre+ RBPJlox/loxマウス10 Mx1 Cre を取得するマウスをクロス正RBPJlox/loxマウス12と Mx1 Cre 負 RBPJlox/lox同腹子コントロールとして使用します。PCR10遺伝子型を確認します。</li>
	<li>6-8 週を使用して-古い Mx1Cre+/RBPJlox/loxと Mx1Cre-/RBPJlox/loxマウス polyI:C 誘導を実行します。</li>
	<li>
PolyI:C 200 μ g i. p. Cre+と Cre-マウスでを挿入します。1 つの polyI:C 注入 3 日間最初の週の毎日を与えます。1 つの polyI:C 注入 7 日 (合計で 4 回の注射) の前の注入後第 2 週を与えます。
	<ol>
<li>RBPJKO を使用 (Mx1Cre を誘導+/RBPJ液体酸素/液体酸素) と RBPJWT (Mx1Cre を誘導-/RBPJ液体酸素/液体酸素) 最後の polyI:C 注射後 3 週間の受信者としてマウス。 注: 注射後 3 週間 pI: pC によるマウスを使用することをお勧めします。PolyI:C によって引き起こされるインターフェロン応答は HSC の肺浸潤拡大の結果、BM の重要な変化を誘導して末梢血16,17に成熟した前駆細胞の出力を減少します。造血のサブセットの表現は、正規化された 3 週間後に炎症の交絡影響せず利用できる注入とマウスです。この誘導のプロトコルは、RBPJ のために最適化されています。異なる遺伝子の削除、誘導プロトコルは、構成によって異なる場合があります、削除を検証する必要があります。合計 4 つ polyI:C 注射後 RT-PCR による loxP サイト間 RBPJ 地域の ~ 100% 削除を検証しました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Lys EGFP ドナー骨髄細胞の移植のための準備
<ol><li>1 つの Lys EGFP マウス (頚部転位続いて二酸化炭素) を安楽死させる 1 または 2 の移植の前に h。</li>
	<li>70% エタノールで動物の体の表面をスプレーします。</li>
	<li>足首周りの両方の足で皮膚切開を行い、手術用鉗子を引いて離れて一緒にきれいな筋肉組織を公開する毛皮外科はさみを使用します。</li>
	<li>外科はさみを使用して、可能な限り足から同様に多くの筋肉を削除します。はさみを使用して、(膝・足関節の骨を切り取ってきれいに大腿骨と脛骨のガーゼを使用してから任意の残りの筋肉組織。DMEM に 10% を含む 6 ウェル プレートに (2 つの大腿骨および脛骨の 2 つ) の骨を置く政府短期証券。</li>
	<li>ピペット 10 mL 冷たい 2 mM EDTA PBS とモルタルで噛み砕く骨髄細胞単一細胞懸濁液に細胞をさせる。また、1 mL 注射器で各側面から 2 mM EDTA PBS 3 回で骨をフラッシュします。</li>
	<li>骨髄細胞を 15 mL 遠心管に 70 μ m フィルターを使用してフィルターします。2-3 ml の PBS のフィルターをすすいでください。460 x g で 10 分間ダウン セルをスピン、10 %10 mL の新鮮な DMEM に細胞を再懸濁します FBS。</li>
	<li>診断に骨髄細胞をカウントし、1.5 倍の 107セル/mL を IMDM の血清濃度を調整します。200 μ L のボリュームを持つ動物あたり 3 x 10 の6セルを使用します。合計 BM の約 1/3 セル骨髄性 GFP + セルです。注射の準備ができるまで、氷の上セルを残します。105セル × 0.5 を使用して、FACS9GFP 発現を確認します。</li>
</ol>3 RBPJKO マウスに Lys GFP 細胞骨髄移植
<ol><li>パイ ケージで受信者のマウスを抑制します。ガンマ放射の致命的な線量を持つマウスに照射 (1,200 Rad) Cs 137 照射に。分割投与プロトコルを使用: 夕方 900 ラドに続いて 300 ラド (離れて 16 h) 次の朝。</li>
	<li>致死的放射線照射した RBPJWT と RBPJKO の受信者マウス移植放射線の 2 回目投与後 5 〜 6 時間。BM を注入動物を介して尾静脈注射 (セクション 2 のセルを収穫の詳細を参照してください) あたり 3 x 10 の6セルの濃度リス EGFP マウスから採取した細胞。</li>
	<li>異なる時点での IVFM による移植マウスの独立したコホートのイメージ: 24 h のと週 2、4、6、前述の下で (4 </ol>4. 手術に備えて生体イメージング
<ol><li>手術器具を滅菌します。2 本の細い鉗子 (1 つストレート、角度の 1 つ)、1 組の高級はさみとニードル ホルダーの 1 つのペア。手続きに必要なすべての供給で術野を準備します。</li>
	<li>麻酔薬ケタミン カクテルの IP 注入マウスを与える (キシラジン 2.5-5 mg/kg + アセプロマジン 1.0 〜 2.5 mg/kg + ケタミン 90-100 mg/kg) 26-28 G 針の注射器を使用して。 動物のプロシージャの間に 15 分毎が監視され、元の用量の 1/4 で必要に応じて麻酔薬、補われます。</li>
	<li>適切な熱源 (37 ° C 加熱パッド、パッドを加熱との直接接触から保護動物) の上にマウスを置くし、視覚的に呼吸数を監視します。</li>
	<li>つま先を利用した反射がピンチの応答を確認します。確実に動物完全に麻酔、手術を開始する前に。</li>
	<li>使用 26 28 ゲージ与えるマウス蛍光血管マーカー (デキストラン、20 mg/mL の溶液 100 μ L) の尾静脈注射針注射器です。</li>
	<li>両方の目に獣医眼軟膏を適用されます。小さな電気バリカンで動物の頭の背側表面をクリップします。脱毛クリームを削除し、生理食塩水、すすぎを 5 分使用ガーゼ スポンジにクリームを適用します。綿棒を使用して 70% アルコールできれいな頭皮を準備します。</li>
	<li>微細鉗子、はさみを使用して小さな正中皮膚切開 (10-20 mm) を基になる背側頭骨表面を公開するのに頭皮に。5-0 外科シルクを使用すると、イメージングのため calvarium を公開するのにフラップを作成する、切開の各側に皮膚の縫合糸に宿泊 2 を配置します。</li>
	<li>自分の背中にマウスを置き、顕微鏡油で満たされたガラス底皿に露出した頭皮が水没します。多光子イメージング部屋に動物を輸送します。</li>
	<li>顕微鏡ステージ上目的上ガラス皿の上に配置 calvarium と動物を配置し、37 でカバーします° C 加熱パッド (動物は熱との直接接触から保護する必要があります)。</li>
</ol>5 体内マウス Calvarium の高分解能イメージング。
<ol><li>多光子イメージングの変更倒立共焦点システムを使用して (材料の表を参照してください)。次の製造元の指示調整 830 2 光子レーザー nm、20 の場所 X W、NA 0.95 顕微鏡鼻部分およびチェック レーザーのビーム配置の対物レンズ。 注: 正立顕微鏡システムはこれらの研究でよく使用が、反転の多光子吸収システムも利用できます。本研究では、カスタム設計された非外科的脳定位固定装置が使用されました。正立顕微鏡システムのいくつかの市販脳定位固定装置が市販脳定位固定装置マウス頭蓋骨のセキュリティ保護を目的とした倒立顕微鏡システムはありません。カスタムの脳定位固定装置に別の方法として、上記の安定性のための様々 なテープや接着剤の手法を活用して目的位置に頭蓋骨を保護できます。</li>
	<li>画像集録ソフトウェアを開きます。「設定の取得」パネルは、1 方向スキャン モードを選択した場合確認してください。4 μ s/ピクセル、512 × 512 ピクセルにフレーム レートのためにスキャンの速度を設定し、1.5 にズームします。レボルバで配置されているレンズに合わせて利用可能な対物レンズのリストから 20 X W Na 0.95 目的を選択します。</li>
	<li>「画像取得制御」パネルから「色素リスト」にアクセスし、、「光子」を選択します。「光パス & 染料」ウィンドウを開き、レーザー ユニット 2 のチェック ボックスをチェックすることによって DM690 980 励起 DM 2 P レーザー シャッターの開きを選択します。「顕微鏡コント ローラー」ウィンドウで RDM690 のミラーをを選択します。</li>
	<li>「エピ ランプ」を B/G エピ フィルター キューブを選択選択して血流と中心静脈 (a) と (b) (図 2 a) 冠状縫合の分岐を参照として使用して、calvarium 骨髄ニッチを視覚化する試料の上に目的に焦点を当てます。</li>
	<li>
非 descanned モードを使用して画像を収集します。外部検出器を選択: コラーゲンの SHG 信号を収集する PMT detector1 (排出フィルター - 430/100 nm)、収集の GFP 信号 (排出フィルター - 525/50) GaAsP detector2 と TRITC デキストランの信号を収集する GaAsP detector3 (排出フィルター - 605/90 nm)。
	<ol>
<li>光毒性を最小限に抑えるための平均で 4μs/ピクセルのスキャン レートでイメージングを実行します。一定のレーザー パワーと検出器のゲインが最小限の飽和検出器のダイナミック レンジを活用する調整で画像を収集します。</li>
		<li>Calvarium 骨髄の 6 地域から一連の組織 (60 × 1 μ m Z スタック) の深さによってセクションを収集します。ズーム 1.5 と 512 × 512 ピクセルのフレーム サイズ (423 μ x 423 μ m)、1 μ m のステップ サイズ設定を使用します。 注: 全体的に 1 つのマウスを画像に必要な合計時間は 1 〜 1.5 h です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 定量解析
<ol><li>製造元の指示に従って専用 3 D ・ 4 D 画像の定量化と可視化ソフトウェアを使用して画像の定量と 3 D 再構成を行う (表を参照)。対話的にアルファ ブレンドまたはシャドウ射影ボリューム レンダリング アルゴリズム最大強度投影法 (MIP) を利用した 3 D で Z スタックを視覚化します。</li>
	<li>セグメントの GFP の細胞を使用して、"スポット オブジェクト分割モジュール"。(これは緑と赤のチャンネルで強い蛍光を表示する骨細胞の信号を排除) GFP の細胞数の偽肯定的な排除するスタック算術処理 (チャネル減算) を適用します。</li>
	<li>曲面の分割モジュールを使用して血管と骨の表面の分割を実行します。必要な場合は、「表面にスポットの距離」と呼ばれるエックス テンション アルゴリズムを適用して細胞上の表面のいずれかへの距離を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li>
<li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li>
<li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li>
<li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li>
<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683(2014).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは、生体の蛍光顕微鏡による造血細胞移植の動力学を調査するように最適化実験デザインについて説明します。本研究では WT BM または欠陥のある BM をシグナリング ノッチ骨髄前駆細胞の拡張追跡された骨 calvarium で次 Lys GFP 陽性骨髄性細胞によって BMT 後 RBPJWT または RBPJKO の受信者に。たとえばアドレス同様の質問に適用できるモデルとしてこのアプローチが提案されて: 私) よう拡大と他系統の BM ニッチ細胞の局在を決定するリンパ球、赤芽球またはドナー細胞として使用して、巨核球の細胞造血細胞が GFP やトマト、赤; 運転系統特定の促進者を運ぶii) に受信者として他の特定 KO やトランスジェニック マウスを用いた異なる微環境要因を評価します。
このイメージング プロトコルを calvarium 骨の強さはバミューダ諸島地域、中心静脈と冠状縫合の分岐を選択するために使用する解剖学的ランドマークは個人間の整合性を許可するすべてのマウスの保存合理的に自動ステージの要件を取りやめている間実験。さらに、造血細胞を追跡する GFP モデ...

生体多光子蛍光顕微鏡 (IVFM) は、高解像度、リアルタイム イメージングの深さを持つ組織の最大のことができる強力なイメージング技術によって組織の 1 mm。マウスの calvarium を適用すると、60-100 μ m11を非侵襲的な方法で BM 内造血細胞の挙動を観察が許可されます。このアプローチは、正規 Notch シグナルに欠けている BM の RBPJ ノックアウト マウスで通常の骨髄前駆細胞の生着の動態を決定するここで使用です。
私達のグループからの最近の作品は、その欠陥正規 Notch シグナルのような骨髄増殖性疾患12BM 微小環境リードを示した。Notch シグナルの損失は、RBPJ、下流正規 Notch シグナル、組換え10を誘発 Mx1 Cre を使用しての重要な転写因子の DNA 結合ドメインの条件付き削除によって得られました。本研究では Mx1-Cre/RBPJlox/loxマウス モデルが使用されました。RBPJ の DNA 結合モチーフの条件付き削除すべてのノッチの受容体から信号の損失で起因します。式は複数の臓器の間質成分のだけでなく、血液細胞のターゲット遺伝子欠失の誘導の結果 polyI:C の管理時にアクティブ Mx1 プロモーターによる Cre Mx1 Cre モデルで BM、脾臓と肝臓を含みます。
Mx1-Cre+/RBPJlox/loxと Mx1 Cre-/RBPJlox/loxマウス (ここに至って示される RBPJKO と RBPJWT、それぞれ) polyI:C による致死的照射し、正常な野生型造血細胞移植されました。移植後 4 週目から始まって、RBPJKO の受信者は脾腫に続いて重要な白血球を開発しました。RBPJKO マウスでは、移植後およびそれ以降の時点で BM の 8 週目骨髄前駆細胞の増加割合を提示、週 4 と 6 で BM の分析はコントロール RBPJWT と比較して、骨髄球系細胞内容に顕著な違いを明らかにしなかった受信者。この観測は、一緒に実際に Mx1 Cre が異なる造血臓器の単位があること提起した BM 微小環境骨髄増殖性の表現型の発生に直接的な影響を持っていたかどうか。
BM が病気の開発の重要な最初のサイトであるかどうかを判断するには、マウス calvarium の IVFM は BM の移植 (BMT)、RBPJ ノック アウト モデル系列のシステムを追跡との組み合わせで使用されました。特定リゾチーム プロモーター (Lys GFP)9の制御の下で EGFP を発現するトランスジェニック マウスを用いて BM BMT 後の画像の中に可視化することができるドナー細胞を入手します。リゾチーム発現は骨髄細胞に固有、Lys GFP が成熟した顆粒球13(CMP) 一般的な骨髄前駆細胞をマークします。
異なる時点で BM の IVFM を示した、Lys GFP の細胞同様に BM の RBPJWT と RBPJKO の受信者にホーム拡大や高速 RBPJKO BM 受信者の中にしみ込んでいます。この違い以前の時点 (2 週目) で劇的だったし、時間の経過とともに減少 (週 4 と 6)。しかし、これらの後の時点で PB で循環する骨髄細胞数の着実な増加を示した同じ受信者の造血のコンパートメントの評価、細胞の高められた出力を示す RBPJKO マウスの脾臓でローカライズ循環に BM。Lys GFP の細胞における局在の解析 BM 移植マウスの 6 週間では、骨髄細胞がコントロールにより RBPJKO 微小環境で血管系から遠い寝泊まりしていたことを明らかにしました。
総称して、これらの特定の動物モデルと IVFM の組み合わせは RBPJKO BM 微小環境における骨髄系細胞の生着の動力学の洞察力を提供されています。同じような質問に対処するため適用することができますパラダイムとして実験的なデザインとここで説明する定量的な手法を提案する.たとえば、RAG1 GFP14または15 Gata1 GFP マウスなどのモデルを追跡他のセルの特定の血統を使用する次のリンパの動作許可可能性がありますや赤芽球系前駆細胞、BM のそれぞれ。

<table><tbody><tr><td>ケタミンカクテル</td><td>IU医学部</td><td></td><td>ケタミン90-100 mg / kg、キシラジン2.5-5.0 mg / kg、アセプロマジン1.0-2.5 mg / kg</td></tr>、<tr><td>TRITCデキストラン</td><td>TDBコンサルタント</td><td>TD150-100mg</td><td>他の色のデキストランを使用することができます。</td></tr><tr><td>アンディスヘアトリマー</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック</td><td>CLP-323 75</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼスポンジ</td><td>メッド獣医インターナショナル</td><td>PK224</td><td>4プライ、2 x 2</td></tr><tr><td>ナイール脱毛クリーム</td><td>商業店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>メッド獣医インターナショナル</td><td>RXSAL-POD1LT</td><td>0.9% 塩化ナトリウムポリボトル</td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-826-79</td><td>28 g、1/2 cc</td></tr><tr><td>ファイン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>00108-11、00109-11</td><td>ストレート鉗子、角度付き鉗子</td></tr><tr><td>シザー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>5-0シルク縫合</td>糸フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>MV-682</td>他の<td>非吸収性縫合糸は、</td></tr><tr><td>WillCo-ガラスボトムディッシュ</td><td>WillCo</td>を使用することができます<td>GWSt-5040</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡オイル</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脳定位固定装置用ステージインサート&nbsp;</td><td>IU医学部</td>カスタム<td>デザイン</td><td></td></tr><tr><td>オリンパスFV1000共焦点顕微鏡システム&nbsp;</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr>オ<tr><td>リンパスXLUMPLFL 20XW、NA 0.95対物レンズ&nbsp;</td><td>オリンパスの</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小さな加熱パッド</td>、<td>商業店</td><td></td>、<td>動物園、メッド、爬虫類、加熱パッド</td></tr><tr><td>、イマリス8.1、イメージングソフトウェア</td><td>、ビットプレーン</td><td></td><td>、3/4、D、画像視覚化および分析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (ivfm) を組み合わせること

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

増加する証拠は、その正常造血が特殊な細胞ニッチ重要な造血幹細胞 (HSC) 機能1,2を調節することを含む、BM の個別のアイソレータケージ手がかりによって規制されてを示します。確かに、造血微小環境のより詳細な画像は今浮上して、骨と血管内皮のニッチが正常 HSC とその子孫3,4,5 の規制の機能ユニットを形成.新しい研究は、血管周囲細胞、脂肪細胞、神経細胞の維持と HSC 機能6,7、8を規制することの重要性を明らかにしました。さらに、異なる系統、すなわち骨髄性とリンパ性細胞、家から細胞、骨髄微小環境の内で特定のニッチに存在する証拠があります。しかし、BM 微小環境とその居住者の完全なマッピングは、まだ進行中です。
トランスジェニック マウス系統系統固有蛍光マーカーあるいは BM のニッチの特定のセルに選択した分子を欠いた遺伝子改変マウスの表現ができます。ノックアウトと系列移植アプローチとの組み合わせで、モデルを追跡、HSC などの定義済みの造血集団の固有の「ニッチ」の役割に関する知識を絞り込むこと細胞 B 細胞、T 細胞、骨髄細胞、赤芽球系細胞。この戦略は、マージ、calvarium の 2 光子顕微鏡を使用することによってさらに増強することができます。体内の高分解能イメージングと BM calvarium の 3d レンダリングを提供することにより造血の特定のサブセットが BM のホームし、時間をかけて彼らは拡張の動態を評価の場所正確に今判断できます。ここでは、Lys GFP トランスジェニック マウス (骨髄細胞マーキング)9と RBPJ (正規 Notch シグナルに欠けている) ノックアウト マウス10はノッチ欠陥 BM の微小環境に骨髄系細胞の生着を確認する IVFM との組み合わせで使用されます。

2 RBPJKO、2 RBPJWT 受信者のコホートを異なる時点で各撮像セッションでイメージしました: 24 h、2、(ワークフロー、図 1 aに示されている) BM Lys GFP の細胞移植後 4 〜 6 週間。
各マウスの画像に(図 2 a、)中心静脈と冠動脈縫合 (図 2 a、b) の分岐に関連して彼らの位置によって識別され、BM calvarium の 6 標準地域から買収されました。イメージ作成前デキストラン テキサス-赤のインジェクションによって、これらのランドマークの識別と 6 地域 (図 2 a) の選択: 左、中と右 (UL、UM、ウル) と左下、中と右 (LL、LM、LR)。60 x 1 μ m z スタックの各地域から収集され、レンダリングとして 3次元最大強度...

ホーミングや骨髄 (BM) のニッチに造血細胞の生着を研究する遺伝的動物モデルとの組み合わせで、calvarium の生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) が適用されます。

骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

この手順の全体的な目標は、移植された血液細胞のレシピエント骨髄ニッチへのin vivo生着を視覚化し、測定することです。この技術の主な利点は、移植後のドナー造血細胞のさまざまな骨髄ニッチへのホーミング、拡大、局在化などの細胞プロセスを視覚化できることです。このアプローチは、改変動物モデルと組み合わせて使用することで、造血細胞の再生に重要な分子経路を定義するのに役立ちます。組織学や他のイメージング技術とは異なり、生体内顕微鏡法では、生きた動物の細胞間相互作用を細胞レベルでリアルタイムに捉えることができます。この方法を使用して、骨髄微小環境がNotchシグナル伝達の喪失によって引き起こされる骨髄増殖性疾患の発症の最初の部位であるかどうかを判断することにしました。この技術を初めて使用する個人にとっての課題には、呼吸アーチファクトの最小化、頭部の最適な位置決めと安定化、画像の飽和の回避などがあります。移植の1〜2時間前に、溶解したEGFPマウスに70%エタノールをスプレーします。次に、手術用ハサミを使用して足首の周りの各脚の皮膚を切開し、手術用鉗子を使用して皮膚と毛皮を一緒に取り除き、きれいな筋肉組織を露出させます。脚からできるだけ多くの筋肉を取り除きます。次に、膝と足首の関節の骨を切断し、ガーゼスポンジを使用して、大腿骨と脛骨から残っている筋肉組織を取り除きます。洗浄した骨を、10%FBSを添加したDMEMを含む6ウェルプレートですすいでください。次に、4つの後肢の骨すべてをPBS中の10ミリリットルの冷えたEDTAに乳鉢に移し、乳棒で骨を粉砕します。骨髄細胞を粉砕して単一細胞懸濁液を取得し、70ミクロンのフィルターを介してスラリーを15ミリリットルの遠心分離チューブに濾します。フィルターを2〜3ミリリットルのPBSですすいでください。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを10ミリリットルの新鮮なDMEMと10%FBSに再懸濁します。注射では、細胞懸濁液を遠心分離し、血清を含まないIMDMで細胞の濃度を10の1.5倍から7番目の細胞にカウントして調整します。細胞を氷の上に置きます。2回目の放射線照射から5〜6時間後に、放射線を受けた各動物の尾静脈に10〜6回目の骨髄細胞を3回注入します。移植後、適切な時点を追加します。麻酔をかけたレシピエントマウスを摂氏37度の加熱パッドに置き、つま先のつま先つまみに対する反応がないことを確認します。動物の目に軟膏を塗り、尾静脈を介して100マイクロリットルの適切な蛍光マーカーを投与します。.次に、小さな電気バリカンを使用して動物の頭の背側表面から毛を取り除き、続いて脱毛クリームを塗布します。5分後、ガーゼスポンジでクリームを取り除き、残っている溶液を生理食塩水で洗い流します。70%エタノールを浸した綿棒で頭皮を消毒します。次に、細い鉗子とはさみを使用して、頭皮に10〜20ミリメートルの正中線の皮膚切開を行い、下にある背側の頭蓋骨の表面を露出させます。5-0サージカルシルクを使用して、切開部の両側に2本のステー縫合糸を配置し、イメージングのためにカルバリウムを露出させるフラップを作成します。露出した頭蓋骨に油を滴下します。マウスを仰臥位にして、露出した頭皮を顕微鏡オイルで満たされたガラス底皿に浸します。次に、カルバリウムを対物レンズの上に置き、摂氏37度の加熱パッドで動物を覆う多光子イメージングステージに動物を置きます。多光子画像取得中は、ヘッドが正しい位置に安定していることが不可欠です。定位デバイスを使用するか、必要に応じてマウスをテープで固定します。多光子イメージング用に改造された逆共焦点システムを使用して、2光子レーザーを830ナノメートルに調整します。次に、適切な画像取得ソフトウェアを開きます。[取得設定]メニューで、一方向のスキャンモードが選択されていることを確認し、スキャン速度をピクセルあたり4マイクロ秒に、フレームレートを512 x 512ピクセルに、ズームを1.5に設定します。0.95の対物レンズで20Xワットを選択します。色素リストウィンドウを開き、2つの光子を選択します。次に、顕微鏡コントローラーウィンドウでRDM690ミラーを選択します。光路とサイコロウィンドウで、レーザーユニット2ボックスを選択して、2光子レーザーシャッターが開いているかどうかを確認します。EPI Lampを選択し、B / G EPIフィルターキューブを選択します。次に、対物レンズを標本に焦点を合わせ、中心静脈と冠状動脈縫合糸の分岐点を基準点として使用して、カルバリウム骨髄ニッチの血管の流れを視覚化します。ノンデスキャンモードを使用して、3つの外部検出器を選択し、平均化なしでピクセルあたり4マイクロ秒のスキャン速度で試料をイメージングし、一定のレーザー出力と検出器ゲインを使用して、検出器のダイナミックレンジを最小限にとどめます。組織の深さまで一連の切片を収集した後、適切な専用の3Dから4D画像定量および可視化ソフトウェアを開きます。製造元の指示に従って、適切な3Dレンダリングアルゴリズムを使用してZスタックをインタラクティブに視覚化します。次に、スポットオブジェクトセグメンテーションモジュールを使用してGFPセルをセグメント化し、スタック演算処理を適用して、緑と赤のチャネルの偽陽性GFPセルを排除します。最後に、Surface Segmentationモジュールを使用して血管系と骨表面のセグメンテーションを改革し、スポットから表面へのX張力距離アルゴリズムを適用して、必要に応じて細胞から任意の遠位表面までの距離を計算します。ここでは、骨髄カルバリウムの6つの標準領域のそれぞれから収集されたZスタックを、3D最大強度投影、骨成分を含む3Dシャドウ投影、および3Dセグメント画像としてレンダリングし、細胞の定量化と骨および血管からの距離の測定を可能にしました。この実験では、Notch欠損骨髄微小環境における骨髄系細胞のin vivoイメージングにより、ドナー溶解GFP細胞は、移植後24時間で野生型とノックアウトレシピエントで同様のホーミング効率を持ち、その後の時点で異なる生着を示すことが明らかになりました。骨髄前駆細胞の拡大の動態の解析により、適応的に骨髄移植された細胞は、移植後2週間でノックアウトレシピエントにより急速に、より多く増殖することが示されました。野生型レシピエントのドナー骨髄細胞は、ノックアウト骨髄のドナー細胞が急速に循環するため減少する4週間後のドナー細胞やノックアウトレシピエントよりも2倍多く増殖しましたが、その数は2倍でした。そして、6週間後には、骨髄カルバリウム内のドナー細胞の数の差は横ばいになります。さらに、骨髄移植後6週間でのノックアウトおよび野生型カルバリアの中下部領域の3Dセグメンテーション解析では、溶解したGFP細胞は、両方のタイプのレシピエント動物で骨から同じ距離に局在していることが示されていますが、興味深いことに、ノックアウトマウスでは血管系からより遠くに存在しています。一度習得すれば、骨髄内イメージングは、適切に実施されれば、マウス1匹あたり1時間30分で完了することができます。このアプローチを使用する際には、マウスごとにカルバリウムの骨髄の複数の領域をサンプリングし、実験ごとに少なくとも3匹のマウスを分析して、サンプル内およびサンプル間の変動に対処することを忘れないでください。このビデオを見た後、骨髄移植と生体内イメージングを組み合わせて、特定の血液亜集団の骨髄微小環境への生着の動態を決定する方法についてよく理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、抗癌治療への応答のイメージングのための方法を説明...

乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

複雑な組織塊、器官からの腫瘍に、種々の細胞成分から構成されている。我々は、タンパク質の発現に基づいて細胞起源だけでなく、電池特性を解読するスペクトルアンミキシングに続くマルチパラメータ免疫蛍光染色と組み合わせたマルチ蛍光標識トランスジェニックマウスを利用して組織内の細胞の表現型の寄与を明らかにした。...

細胞の起源、タイプ、および相互作用の可視化のための蛍光組織移植に続いて定量的マルチスペクトル解析

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。...

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）および骨髄ニッチの間の相互作用の性質は、ほとんど理解されている。カスタムハードウェアの修正および多段階取得プロトコルは、ex vivo画像骨髄エリア内ホーミング標識HSPCs、追跡相互作用及び運動に二光子共焦点顕微鏡の使用を可能にする。...

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

単球は自然免疫の主要な調節因子であり、末梢の単核食作用系の更新や炎症の場合に重要な役割を果たします。この原稿では、単球の動員メカニズムを研究するためのマウスのカルバリア骨髄のリアルタイムイメージングの手順について説明します。...

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

このプロトコルは、生体内で大腿骨骨髄内の細胞の動きを追跡するために使用できる新しいマウス大腿骨窓室モデルについて説明しています。生体内多光子蛍光顕微鏡は、大腿骨骨髄の3つの成分(血管系、コラーゲンマトリックス、好中球)を経時的にイメージングするために使用されます。...

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マウスにおける異なるヒト化骨髄ニッチを作成し、ライブイメージする方法が提示される。ヒト間葉系細胞によって作り出された支持的ニッチに基づいて、ヒト内皮細胞の添加はヒト血管の形成を誘導するが、rhBMP-2の添加はヒト - マウスキメラ成熟骨組織の形成を誘導する。...

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

このプロトコルは、マウス異種移植モデルにおける遺伝子編集細胞を含むいくつかの造血幹細胞または白血病幹細胞の大腿骨内注射を説明しています。これにより、細胞の迅速かつ安全な移植だけでなく、骨髄の連続分析も可能になります。...

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大腿骨内注射は、少数の造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)を骨髄腔に直接配置することにより、生着を可能にします。ここでは、免疫不全マウスへのヒトHSPCの大腿内注射の実験プロトコルについて説明します。...

免疫不全マウスへのヒト造血幹細胞および前駆細胞の大腿内注射 

生体内顕微鏡検査は、組織再生や腫瘍発生などのダイナミックな生物学的プロセスの研究を可能にします。非常に動的な組織である頭蓋骨髄は、造血と血管機能に関する洞察を提供します。生体適合性のある3Dプリントされた頭部固定インプラントを使用すると、反復的な縦方向のイメージングが可能になり、組織ダイナミクスと腫瘍微小環境の理解が深まります。...

Calvarial Bone Marrowにおける血管動態の生体内縦断的イメージング

学ぶ生体内蛍光顕微鏡法（IVFM）を用いて造血細胞の骨髄ニッチへの生着と定着を可視化する方法。遺伝的モデルと組み合わせて細胞動態をリアルタイムで観察し、骨髄微小環境の役割を解明する。

骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

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