Name: in vitro転写アッセイおよび創薬への応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学ぶ in vitro転写アッセイによる細菌転写の複雑な調節機構と、抗細菌剤の阻害活性評価法。この手法は転写因子や小分子の効果を直接可視化し、創薬研究に応用可能です。

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この作品は、ニューカッスル大学（CM）からの教員早期キャリア助成金を認めるものです。

注意：実験は、放射性同位元素32 Pの使用を含む、すべての適切な安全条件が満たされるまで何も作業が行われるべきではありません。一般職員は、安全コースに参加し、前に放射性試薬を用いた実験に教師の練習を受けることが必要です。反応を行う際に個人用保護機器着用してください（熱ルミネッセンス線量計、安全眼鏡、手袋、放射線室の白衣、完全長ズボンを、靴、つま先を閉じました）。 アッセイ材料の作製<ol><li>転写アッセイに必要なタンパク質を取得します。 <ol><li>ここで説明する実験では、Eを過剰生産と精製11を説明し、または商業的供給源（物質一覧）から得るように研究室で大腸菌 RNAP。 注：両方とも、同様の結果を提供します。天然または親和性標識RNAPの精製の ​​ための他の方法も12,13を使用することができます。シグマ/ヌサ因子をdとして得ることができます前作14,15に傍接しました。 </li></ol></li><li>ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水の調製 注：また、RNaseフリー水は、商業的供給源（材料リスト）から得ることができます。 <ol><li>精製水1Lに1 mlのジエチルピロカーボネート（DEPC）を追加（0.1％v / v）で、一晩混合します。 </li><li>二回オートクレーブDEPC水とヒント。 </li></ol></li><li> DNAテンプレートの調製<ol><li>製造業者の説明書に従って、プラスミド精製キット（材料リスト）を使用してプラスミドpSG1154 16および/ ​​またはpIA226 17を精製します 。 </li><li>ランオフ転写アッセイのためのテンプレートを増幅するために（P XYLプロモーター領域を含む360 bpの断片）は、25μlの2×PCR混合物（物質一覧）、など、氷上でPCR反応を組み立てる2μlの各プライマー（5μM） ：5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;（フォワード）及び5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39;（リバース）、1μlのpSG1154プラスミドPReparation（250μM）および20μlの精製水）。 <ol><li>または代替的に、単一ラウンドの転写アッセイのために、pIA226 17からλのP Rプロモーター領域を含む447塩基対の断片を増幅します。 25μlの2×PCR混合物を用いて、氷上でPCR反応を設定し、2μlのプライマー（5μM）の各：5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;（フォワード）および5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39;（リバース）、1μlのpIA226 17プラスミド調製物（250μM）および20μlの精製水）。 注意：このテンプレートは、転写開始部位から26 番目のヌクレオチドである26のntの位置までシトシンを欠いています。したがって、転写開始、プロモータークリアランスが可能になります。このテンプレートを使用していて、唯一のATP、UTP及びGTPが反応中に存在しているときに安定した転写伸長複合体（EC）を形成するためのnt 26で失速。 </li></ol></li><li>以下の条件でPCR反応を設定します。95°; 30秒間、50℃30秒、72℃30秒間、30サイクル繰り返します。 </li><li>メーカーの指示に従ってPCRクリーンアップキット（物質一覧）を使用して生成物を精製し、転写アッセイのために100μlの転写バッファーで溶出します。 </li><li>蛍光分光器（物質一覧）を使用して、鋳型DNA濃度を決定します。 </li></ol></li><li> NTPの準備 注：NTPを、異なる商業的供給源（物質一覧）から入手することができます。 <ol><li> -20℃で1.5 mlチューブ（各チューブ内を50μl）とストアに1 Mストック、アリコート溶液1mlを作るためにDEPC処理水で（≥99％純粋）のNTPを溶解させます。 </li><li>実験前に32 P UTP（3000 CI /ミリモル）α-注文。32 Pは14.29日の短い半減期を有します。 注意：アルファ標識UTPを使用して、異なる長さのバンドの強度を比較する避けることができます。 </li></ol></li><li> RNAラダー準備<ol><li>フォローを組み立て0.5μgのRNAテンプレートミックス（物質一覧）、80mMのHEPES緩衝pH7.5の、12のMgCl 2、10mMのNaClを、10mMのDTT、2mMのATP / CTP / GTP、0.5 mMのUTP、2：室温でる反応T7 RNAP（物質一覧）、20μlのにDEPC処理水μlのμlのα-32 P UTP、0.5。 </li><li>反応は37℃で1時間進行させます。すぐに使用するか、-80℃で保存します。 </li></ol></li></ol> RNA配列決定ゲルの調製<ol><li>ジェルの準備<ol><li> 70％エタノール及び精製水で2回配列決定ゲル装置（物質一覧）からプレートをきれいにし、櫛と2つのスペーサでセルを組み立てます。 注：一方のプレートは、ステップ4.2でゲルの除去を容易にするために、シリ試薬（材料リスト）で被覆することができます。 </li><li> 27.5グラムのホウ酸; 1 Mエチレンジアミン四酢酸を10ml（23 mlの水及び5×トリス/ホウ酸塩/ EDTA（TBE）緩衝液（53グラムのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン16.4 ml中に33.6グラムの尿素を溶解マグネチックスターラーを用いてEDTA）、1Lの水のpH 7.4）。 </li><li> （19：1）40％アクリルアミド/ビスアクリルアミド溶液を16ミリリットル追加尿素溶液にをし、0.45μmのフィルターでろ過します。 </li><li> 514μlの10％を追加する（W / V）、濾過した溶液を51.4μlのN、N、N &#39;、N&#39; -Tetramethylethylenediamine（TEMED）、続いて水で新たに調製した過硫酸アンモニウム。 </li><li>静かに過度の通気を回避し、底部注入孔から水平に配置予め充填されたシーケンシングセルにすぐにかつ円滑に注入するためにゲル溶液を反転。注射の間に気泡を避けるように注意してください。 </li><li>ゲルが完全に転写アッセイに使用する前に設定されるまで1〜1.5時間を許可します。ゲルは、配列決定、細胞の上に水湿潤ティッシュで包んだ二、三日間室温で保存することができます。 </li></ol></li></ol> 3.転写反応<ol><li>転写伸長一時停止アッセイ<ol><li>転写伸長複合体の形成<ol><li> 1.5mlチューブにRNAPコア酵素（転写バッファー中で1μMストック）の1μLを加えます。 </li><li> RNAPへとRNAPホロ酵素を形成するために、10分間氷上でインキュベートし、精製されたシグマ70因子（転写バッファーで3μMストック70σ）の1μLを加えます。 </li><li> RNAPホロ酵素に転写バッファーで3μlの500 nMの精製された鋳型DNA（pIA226 PCR産物からλP Rプロモーター）を追加し、オープンな複合体を形成するために5分間37ºCでインキュベートします。 </li><li> DEPC処理400 mMのトリス-HCl、1.6 MのKCl、100mMのMgCl 2を、10mMのDTT、50％グリセロール、pHは7.9：10×転写緩衝液5μl（材料リストを使用して別の1.5mlチューブ中の反応成分の混合物を調製します水）、250μMの各GTPおよびUTP、1 mMのATPの1μlに2μlの、およびα-32 P UTP（3000 CI /ミリモル）の1μlの。 41μlにDEPC処理水を追加します。 いいえTE：RNase阻害剤（材料リスト）のRNaseの混入を最小化するために使用することができます。 </li><li>オープン複合体を含むチューブに混合液を移し、転写伸長複合体を形成するために15分間、37ºCでインキュベートNT 26で停止。 </li><li>室温（〜21℃）への反応を移動および50μg/ mlの最終濃度になるように2.5 mg / mlとリファンピシンの1μlを添加します。 </li><li> 0.1 mMと1μl加え、反応混合物にヌサを精製し、室温で5分間インキュベートします。 </li><li> 50μlの最終容量を作成し、タイマーを使用して、反応時間を測定するために、反応混合物中に250μMのCTPの2μLを加えます。 </li><li> 30、60、120、240、480、1200秒でRNAゲルローディング緩衝液（95％ホルムアミド、0.05％ブロモフェノールブルー、および0.05％キシレンシアノール）2μlの中に反応液の移送5μlの反応を停止します。 </li><li> 32 PのUTPのヒントやチューブは放射性廃棄物の続きで廃棄しますainer。 </li></ol></li></ol></li><li>転写開始アッセイ<ol><li>オープン複合体の形成<ol><li> 70〜0.5μMσ精製した希釈します。 </li><li>手順を繰り返し3.1.1.1 0.5μM（代わりに3μMの）70σ精製し、DNAテンプレート（pSG1154 PCR産物からP XYLプロモーター領域）を使用して3.1.1.3へ。 </li></ol></li><li>転写開始阻害アッセイ<ol><li>阻害剤はホロ酵素形成を破壊することが可能であるかどうかを調べるために、ステップ3.1.1.2と3.1.1.3が続く（ステップ3.1.1.1後）σ70を添加する前にRNAPコア酵素へのRNAPホロ酵素の形成を防止するために設計された阻害剤を、追加します。 </li><li>あるいは、ステップ3.1.1.2後、競合RNAPに結合σ70を阻害することができるかどうかを調べるために阻害剤を加えます。 </li><li>代わりに、阻害剤Sの、DMSO、阻害剤の同量の溶媒を使用し対照反応でトック。 </li></ol></li><li>反応の完了<ol><li> -20℃で1 mg / mlとし、株式のストック濃度に水でヘパリンを溶解させます。 注：ヘパリンが開いて複合体を形成していないRNAPを隔離することができるDNAの競争相手です。開いた複合体が形成されると、ヘパリンはRNAPのDNA結合部位を入力し、予め形成された開いた複合体からの転写を抑制することができません。したがって、ヘパリンは、単一ラウンドのアッセイのために必要とされます。それは、マルチラウンドアッセイに必要とされません。 </li><li> 5μlに10×転写バッファー（物質一覧）、1mg / mlのヘパリン溶液1μl、10mMの各ATP、GTP、およびCTP、2.5 mMのUTPを1μl、およびα-32の1μLを用いて反応混合物を準備しますP UTP（3,000 CI /ミリモル）。 45μlにDEPC処理水を追加します。 </li><li>転写オープン複雑な、パルススピンを有する反応混合物を混合し、37℃で20分間インキュベートします。 </li><li>そのように反応物10μlを移します反応をクエンチするRNAゲルローディング緩衝液（95％ホルムアミド、0.05％ブロモフェノールブルー、および0.05％キシレンシアノール）を5μlにリューション。 </li></ol></li></ol></li></ol> 4. RNAゲルランニング開発<ol><li>変性ポリアクリルアミドゲルを実行します<ol><li>ゲルとバッファーの温度が50ºCで安定するまで約1.5時間、1×TBE緩衝液中で50ºCと50 Wでゲルを実行します。 </li><li> 30秒90ºCでの熱のサンプルとゲルにアイスロードする前にそれらを移動します。 </li><li> （1：100希釈）2μlのRNAラダーを含む1レーンと一緒に、ゲルの上部のウェルにロードしたサンプル。 </li><li>ブロモフェノールブルー色素がゲルダウン〜2月3日に達するまで、1×TBE緩衝液中で50 W、50ºCでゲルを実行します。 </li></ol></li><li>ジェルトリートメント<ol><li>ゆっくりと開き、慎重にシーケンシングセルから上部プレートを分離します。ゲルを破壊を避けるために、十分に注意してください。 </li><li>カットchromatograpブロモフェノールブルー色素上からゲルのサイズに合わせてHY紙（材料リスト）。放射性標識されたRNA転写物のおおよその位置を確認するためにガイガーカウンターを使用してください。 </li><li>ゲルは濾紙に付着するまで慎重にしっかりとろ紙を用いてゲル、およびプレスをカバーしています。カットオフ取り込まれなかったNTPが非常に熱くなっていることがゲルの底に実行すると放射性廃棄物にゲルの底を捨てます。 </li><li>真空乾燥機の乾燥床にろ紙の同様のサイズのピースを置き、慎重にゲル面を上にしてその上にゲルコート紙を置きます。 </li><li> 1.5時間60℃でラップし、乾燥してゲルをカバーしています。 </li><li>一晩の反応効率に依存するために、1時間ごとに異なる​​ことができ、ラップでゲルコーティングされたろ紙の反対側をラップし、適切な露光時間で、イメージングの場合に輝尽性蛍光体プレート上に置きます。 </li><li>使用した蛍光体プレートの画像製造元の指示に従ってイメージスキャナ。ソフトウェアのマニュアルに従ってImageJソフトウェアを使用して、相対的なバンド強度を決定します。 </li><li> 、作業領域内の放射能汚染を確認した組織と洗浄剤と疑われるアイテムやエリアを拭いて廃棄容器に組織を配置するガイガーカウンターを使用してください。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

全ての生物において、転写は厳密に制御プロセスである。 インビトロ転写アッセイ転写因子、小分子および転写阻害剤の効果を試験するためのプラットフォームを提供するために開発されてきました。この方法の論文では、一般的な細菌の転写のためのアッセイを説明しました。彼らはタイムラインに沿ってすべての転写産物の可視化を可能として転写産物の配列決定ゲル電気泳動と組み合わせた転写アッセイは、機構研究のために非常に重要です。結果として、この方法は、反応条件の小さな変化の影響を識別し、作用のもっともらしいメカニズムを明らかにすることが可能です。さらに、それは、作用の未知の機構を有する転写因子の機能に関連して特定の転写アッセイを設計することが可能となります。 本稿ではまた、RNAP holoenの阻害剤の作用機序を確認する方法を説明しましたザイム形成。ここで説明する方法は、時間の経過とともに各RNA転写産物の変化を表示することができ、適切な修正を加えて必要に応じて、転写の各ステップに対する抗菌薬のテストを有効にすることができます。単一ラウンドのアッセイは、競合/非競合特性として阻害剤のメカ...

転写は、RNAは、特定のDNA鋳型から合成する処理です。真核細胞では三つの異なるRNAPsありますRNAP私はrRNAの前駆体を転写は、RNAP IIは、mRNAおよび特定小核RNAの合成のために責任がある、と5SのrRNAとtRNAの合成は、RNAP IIIによって行われます。細菌では、RNAのすべてのクラスの転写を担当する唯一のRNAPがあります。開始、伸長および終結：転写の3つの段階があります。転写は、細胞の中で最も高度に調節プロセスの一つです。 転写サイクルの各ステージは、遺伝子発現1の調節のためのチェックポイントを表します。開始のため、RNAPはオープンプロモーター複合体を形成するために、プロモーター2と呼ばれる特定の部位に酵素を誘導するように要求される、ホロ酵素を形成するためにシグマ因子に関連付けるました。続いて、転写因子の大きなスイートは、規制Oを担当しています伸びと終了フェーズ時にf RNAP活動。ここで調べた転写因子は、ヌサ高度に保存された必須タンパク質です。これは、rRNAの合成3-5の間に転写停止および終了、ならびに抗終結の調節に関与しています。 インビトロ転写アッセイでは転写6時の複雑な規制の手順を研究するための強力なツールとして開発されてきました。一般的に、プロモーター領域を含むDNAの線状断片は、転写のテンプレートとして必要とされます。 DNAテンプレートは、通常、PCRによって、またはプラスミドを線形化することによって生成されます。 （検出目的のための1つの放射性標識NTPを含む）、精製されたタンパク質とのNTPを添加すると、生成物は、インキュベーションの必要な期間の後に分析しました。適切なテンプレートおよび反応条件を使用して、転写のすべての段階はtranscrの詳細な分子特性解析を可能にしたこのアプローチを用いて検討されています最後の半世紀7オーバーiption。 RNAPの3次元構造に関する情報と組み合わせて、また、抗生物質および抗生物質のリードによる転写抑制の分子機構を精査し、新しい、改善された薬物8-10の開発にこの情報を使用することが可能でした。 本研究で、我々は、転写アッセイ転写伸長/終結因子ヌサによる調節のメカニズムを決定するために使用できる方法の例を提供する方法、および新規な転写開始阻害、リードの作用機序を決定することができます。

<table><tbody><tr><td>転写アッセイ</td><td></td><td></td><td></td>に必要なタンパク質を取得します</tr><tr><td>E. coli RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>DEPC処理水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート(DEPC)の調製&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリー水&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>DNA テンプレート調製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウィザード&nbsp;プラス&nbsp;SV Minipreps DNA精製システム</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCRプライマー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 蛍光分光計</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>高純度rNTPs</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-32P UTP&nbsp;</td><td>パーキンエルマー&nbsp;&nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td><td>放射性化合物</td></tr><tr><td>RNAラダー調製&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA マーカー テンプレート ミックス 0.1&ndash;1 kb</td><td>ミリポア</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>ゲル調製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT 核酸シーケンシングセル&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド&nbsp;&nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>シグマコート&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>尿素&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸154563&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% アクリルアミド/ビスアクリルアミド&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>転写アッセイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>リファンピシン&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>キシレンシアノール&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasinリボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>転写バッファー&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp;3MM Chr クロマトグラフィー ペーパー</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>放射性除染剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デコン 90</td><td>デコン</td><td>デコン90</td><td></td></tr><tr><td>ゲル治療</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台風 Trio+ イメージャー</td><td>GE ヘルスケア ライフ サイエンス</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

インビトロ転写アッセイが開発され、広く転写に関与する分子メカニズムを研究するために長年使用します。このプロセスは、マルチサブユニットのDNA依存性RNAポリメラーゼ（RNAP）遺伝子発現時RNAPの活性を調節するように作用する転写因子のシリーズを必要とします。放射性標識された転写物の配列決定ゲル電気泳動は、それに影響を与えることができる方法の転写が進行するとどのようなパラメータの詳細な機構的情報を提供するために使用されます。本稿では、本質的な伸長因子ヌサは、転写一時停止、ならびにRNAPホロ酵素形成の阻害を介して転写開始をターゲットに抗菌剤を同定する方法を調整する方法を研究するためのプロトコルについて説明します。これらの方法は、まだ不明である転写因子の作用機序を調査するための追加の方法、ならびに新規な抗菌アーガンを開発するためのプラットフォームとして使用することができますtsが、抗生物質の研究開発における遊休薬物標的である転写をターゲットに。

転写効率は、異なる時点でバンドの放射線のレベルを測定することによって決定することができます。ヌサ係数有効ポーズの可視化、終了、および実行オフ製品（ 図1A）の機能をテストするために一時停止アッセイ。 （ヌサNTD、アミノ酸残基1-137）ヌサのN末端ドメインの存在下では、RNA生成物の外観は著しくヌサを欠く対照実験と比較して遅れていました。ヌサフラグメントのアミノ酸残基104から137（ヘリックス3）の欠失、または一連のアミノ酸（残基K36、K37、R104、Q108、K111、Q112、Q116、およびR119）のアラニンへの変更は、完全に生じましたヌサ休止活性の喪失。ヘリックス3残基R104およびK111は、ヌサNTD休止活動のためとR104AとヌサNTDは存在しなかった対照（ 図1B）と同様のポーズ半減期値を与えるK111Aの構築物で必須であることが示されました。そのhouldはヘリックス3の欠失またはこれらの2つのアミノ酸残基の改変は、ヌサがRNAP 15への結合に影響を及ぼ...

この原稿では、細菌の転写を標的とする抗菌剤の転写と阻害活性を機能的に調べるためのプロトコールについて記載します。

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

このin vitro転写アッセイの全体的な目的は、転写因子、低分子化合物、および転写阻害剤の効果を検証するプラットフォームを提供することで、転写過程における複雑な調節ステップを研究することです。本手法は、転写調節に関連する詳細なメカニズム、メカニズムが未知の転写因子の機能、および一般的な転写阻害剤の効果など、分子生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、1枚のRNAシーケンシングゲルから、時系列に沿ったすべての転写産物を直接可視化できることです。まず、シーケンシングゲル装置のプレートを70% ethanolと純水で2回洗浄します。コームと2枚のスペーサーを用いてセルを組み立てます。マグネチックスターラーを使用し、33.6 gramsの尿素を22 millilitersの水と16.4 millilitersの5倍TBE緩衝液に溶解させます。40% アクリルアミド溶液を16 milliliters加え、このアクリルアミド溶液を尿素溶液に混ぜ、0.45 micrometerのフィルターでろ過します。ろ過した溶液に、調製したばかりの10% 過硫酸アンモニウム溶液を514 microliters加えます。続いて、TEMEDを51.4 microliters加えます。過剰なエアレーションを避けるため、ゲル溶液をゆっくりと転倒混和させ、水平に配置したプレパック済みのシーケンシングセル底部の注入孔から、速やかかつスムーズに注入します。注入時に気泡が入らないように注意してください。使用前に、ゲルを1〜1.5時間放置して完全に凝固させます。転写伸長複合体形成の手順を開始するために、1.5 µLチューブに1 µLのRNAポリメラーゼコア酵素を加えます。RNAポリメラーゼに1 µLの精製シグマ70因子を加え、氷上で10分間インキュベートしてRNAポリメラーゼホロ酵素を形成させます。RNAポリメラーゼホロ酵素に、転写バッファー中で500 nMに調製した精製テンプレートDNAを3 µL加え、37 °Cで5分間インキュベートしてオープンコンプレックスを形成させます。次に、以下の試薬を1.5 mLチューブに加えて、反応成分の混合液を調製します。10倍転写バッファーを5 µL、250 µM GTPを2 µL、250 µM UTPを2 µL、1 mM ATPを1 µL、およびα-P³²標識UTPを1 µL加えます。DEPC処理水を用いて、混合液の全量を41 µLに調整します。混合物をオープン複合体を含むチューブに移し、37 °Cで15分間インキュベートして、+26ヌクレオチドで停止した転写伸長複合体を形成させます。15分後、反応液を室温に移動し、最終濃度が50 µg/mLとなるように2.4 mg/mLのリファンピシンを1 µL添加します。さらに、0.1 mMの精製

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

我々は、DNAと転写因子との相互作用を測定するための定量的なDNA結合性、ELISAベースのアッセイを開発した。 RUNX2タンパク質に対して高い特異性は、コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドと特異的モノクローナル抗体を用いて達成された。酵素結合抗体基質反応と比色検出をリアルタイムでモニターした。...

遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ

ガリウム（III）5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorroleとその遊離塩基類似体は、低マイクロモル細胞の細胞毒性を示す。この原稿はcorrolesによる転写阻害を評価するために、UV-Vis分光法によるRNA転写反応、臭化エチジウム染色ゲルを有するイメージングRNA、および定量RNAを説明し、抗癌剤候補の特性を評価する簡単な方法を示す。...

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;酵素アッセイは、ガリウム（III）とHによる転写阻害を測定する<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15トリス（ペンタフルオロフェニル）corroles

ここでは、腫瘍細胞代謝のリアルタイムモニタリングと、転移のin vivoニワトリ胚絨毛膜-尿膜(CAM)モデルを組み合わせて、腫瘍細胞をDNA損傷化学療法に感作する能力について、新規の抗がん標的/薬剤を評価するために使用されます。...

がん薬感の有効性を評価<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

ここでは、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを、3'...

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

前または臨床的発症次 -   - 標的治療に対する薬剤耐性は広範囲に及び抵抗のメカニズムを同定することが必要である代替臨床管理戦略を導くために重要です。ここでは、これらのメカニズムの発見を促進するためにシークエンシングを用いたin vitro での薬剤耐性株のカップルの導出にプロトコルを提示します。...

の実装<em&gt;インビトロ</em&gt;薬剤耐性アッセイ：臨床的に関連性のメカニズムを暴くための可能性を最大化

この作業では、活性エンハンサーがどのように特定され、実験的に検証されるかについての実験的なワークフローを提供します。...

レチノイン酸誘導された胚性幹細胞分化の間に活性化された予測と遺伝子調節要素の検証

私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング（HTS）に適しています。...

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼを使用してポックスウイルスに感染した細胞で mRNA 翻訳調節を研究するためのプロトコールを提示します。このアッセイは、5 '-非翻訳領域 (UTR) および 3 '-UTR を含む、mRNA...

インビトロ転写される RNA ベースのルシフェラーゼをレポーターアッセイで、ポックスウイルス感染細胞における翻訳調節を研究する

ここでは、高い、長期にわたる、安定したオンターゲットサイレンシング効率と、低いゲノムワイドなオフターゲット活性を持つ、遺伝子操作された転写抑制因子(ETR)の in vitro...

イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

このプロトコルは費用効果が大きいトランスクリプトーム ベースの薬剤のスクリーニングのためのex 生体内 または 生体外の 細胞培養からのトランスクリプトーム データ前処理へのワークフローを記述する。...

費用対効果の高いトランスクリプトームベースの薬物スクリーニング

学ぶ in vitro転写アッセイによる細菌転写の複雑な調節機構と、抗細菌剤の阻害活性評価法。この手法は転写因子や小分子の効果を直接可視化し、創薬研究に応用可能です。

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

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