ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

この手順の全体的な目標は、ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた脂質二重膜の自動形成を研究するために使用できる方法を説明することです。この方法は、膜-タンパク質相互作用に関するナノバイオセンサー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、脂質二重層の形成が自動化され、再現性があることです。

まず、蒸留水に塩化カリウム、塩酸トリス、EDTAを組み合わせて緩衝液を調製します。次に、溶液のPHを8.0に調整します。次に、0.2ミクロンのフィルターを使用して溶液をろ過し、121°Cで溶液を15分間オートクレーブします。

次に、2つの容量部のウンデカンと8部のヘキサデカンからなる混合物に脂質の3%を溶解することにより、プレペインティング用の脂質溶液を調製します。ローテーターを使用して溶液を一晩攪拌します。また、膜形成のための脂質溶液を、2つの体積部のウンデカンと8部のヘキサデカンの同じ混合物に0.1%溶解することにより

この溶液をローテーターでも一晩かき混ぜます。PDMS薄膜を作製するためには、ミキシングカップで9部のプレポリマーと1部の硬化剤を混合します。この混合物を5gをシャーレに入れ、800rpmで10秒間スピンコートして、厚さ200〜250ミクロンのフィルムを形成します。

次に、ペトリ皿を真空デシケーターに入れ、100ミリトールの真空を2時間引っ張って、残留気泡を取り除きます。その後、薄膜をオーブンで70°Cで5時間焼き、PDMSを重合します。冷めたら、重合した薄膜を2センチ×2センチ四方にカットし、直径500ミクロンのパンチで角の中央に小さな穴を開けます。

次に、マイクロピペットを使用して、1マイクロリットルの3%脂質溶液で開口部を事前にペイントします。黒色脂質膜チャンバーを作成するには、3D描画ソフトウェアを使用してチャンバーの2つの対称ブロックを設計します。次に、PTFEのブロックとCNCマシンを使用してチャンバーを製作します。

チャンバーを組み立てるには、塗装済みのPDMS薄膜を2つのPTFEブロックの間に配置して、PDMS薄膜の開口部がチャンバーの穴の中央に来るようにします。カバーガラスと真空グリースを使用して、チャンバーの外縁をシールします。密封したら、組み立てたチャンバーをナットとボルトで固定します。

液漏れがないように、チャンバーがしっかりと密閉されていることを確認することが重要です。ピペットを使用して、0.1%脂質溶液の0.5マイクロリットルをPDMS薄膜の開口部に堆積させ、チャンバーと組み立てます。次に、チャンバーを摂氏10度未満の冷却環境に置き、必要になるまで保管します。

迅速な自己組織化で黒色脂質膜を形成するには、チャンバーを冷蔵庫から引き出し、チャンバーの両側に2ミリリットルの緩衝液を追加します。凍結したメンブレン前駆体が溶けるまで、チャンバーを10分間脇に置きます。次に、チャンバーをマイクロマニピュレーターに置き、光源と顕微鏡に対する仰角を正確に制御します。

ハロゲン光ファイバーイルミネーターを使用して、チャンバーの片側を照らし、PDMS薄膜の開口部を明るくします。反対側には、開口部に沿って20倍の対物レンズを配置し、色が環状円環よりも明るくなる中心を観察します。電気測定には、次亜塩素酸ナトリウムの溶液に太さ208μmの銀線を1分以上入れて、塩化銀電極を作製します。

次に、電極を微小電極増幅器に接続します。次に、塩化銀電極をチャンバーの両側に配置し、緩衝液中になるようにします。電気生理学ソフトウェアを使用して、メンブレン全体に10ミリボルトの三角形の波形を印加し、方形波を取得します。

記録ボタンをクリックして、メンブレンの電気的特性を記録します。均一な方形波が観察されるまで録音を続けます。次に、黒い四角のアイコンをクリックして録音を終了します。

グラミシジンAを脂質二重層に組み込むために、2つの方法を採用することができます。まず、グラミシジンAを脂質溶液に直接添加してから、脂質溶液をPDMS薄膜の開口部に広げることができます。次に、脂質二重層が形成されたときにグラミシジンA溶液をチャンバーに添加できます。

グラミシジンAチャネルの活性を観察するには、5キロヘルツのサンプルレートでメンブレン全体に100ミリボルトを印加して、メンブレンの保持電位を測定します。録音ボタンをクリックして、以前に行ったように電気的特性を記録します。イオンチャネルの活動が示されているので、イオンチャネルの取り込みを確認するために、さまざまな電流ジャンプが観察されるまで記録を続けます。

確認したら、黒い四角のアイコンをクリックして録音を終了します。記録が終了したら、電気生理学ソフトウェアを使用して、100ヘルツのローパスベッセルフィルターでデータをフィルタリングします。フィルタリングされた保持電位データの電流ジャンプを観察します。

これらのジャンプは、グラミシジンAイオンチャネルの二量体化を表しています。凍結したメンブレン前駆体を室温で解凍すると、疎水性溶媒がPDMS薄膜に抽出されるため、脂質二重層の形成が促進されます。この一連の画像は、凍結した形から温めると自己組織化する脂質二重層の形成を示しています。

ここで、電気コンダクタンスは、グラミシジンAの取り込みと二量体化を示しています.二量体化すると、グラミシジンAはイオンチャネルを形成し、コンダクタンスレベルは28ピコシーメンスに跳ね上がりますが、これは以前の報告の結果と一致しており、この抗生物質が二重層に即座に組み込まれることを示しています。私たちの膜形成技術は、実用化の可能性が限られている従来の技術とは対照的に、細胞膜およびナノチャネル研究のための強力なツールを提供します。当社のシステムは、膜形成やイオンチャネリングの組み込みに専門知識を必要としないため、薬物スクリーニングやバイオセンシングアプリケーションに最適です。