Name: サファイアとOPOレーザー基づく標準レーザー走査顕微鏡：Tiの上のコヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）システムの実装 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 学ぶCARS顕微鏡法を用いた標準レーザー走査顕微鏡への実装方法。Ti:sapphireレーザーとOPOレーザーを活用し、ラベルフリーの生細胞イメージングを実現します。神経科学や脂質関連疾患研究に応用可能です。

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著者は、高速オシロスコープの貸し出しについてPhilippe Combette博士(IES、UM、モンペリエ、フランス)に感謝し、Montpellier RIO Imaging(MRI)からの財政的支援に感謝したいと思います。HRは、ANRがFrance Bio Imaging(ANR-10-INSB-04-01)とFrance Life Imaging(ANR-11-INSB-0006)にコヒーレントラマンイメージング開発のためのインフラストラクチャネットワークを付与したことを認めています。この研究は、主に欧州研究会議の助成金(FP7-IDEAS-ERC 311610)とNTへのINSERM-AVINER助成金によって支援されました。

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<li>Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+molecular+imaging+of+atherosclerotic+lesions+using+multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007(2007).</li>
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 <a target="_blank" href="http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator">http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator</a> (2015).</li>
<li>Ozçelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pals1+is+a+major+regulator+of+the+epithelial-like+polarization+and+the+extension+of+the+myelin+sheath+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves.</a> J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).</li>
<li>Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+saturated+and+unsaturated+lipids+by+wide-field+CARS-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy.</a> Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).</li>
<li>Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+spectra+measurement+of+olive+oil+and+other+vegetable+oils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils.</a> J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).</li>
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<li>Monsma, P. C., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoroMyelin+Red+is+a+bright%2C+photostable+and+non-toxic+fluorescent+stain+for+live+imaging+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin.</a> J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).</li>
<li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).</li>
<li>Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chasing+lipids+in+health+and+diseases+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Vib.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).</li>
<li>Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal%2C+3D+in+vivo+imaging+of+sebaceous+glands+by+coherent+anti-stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+normal+function+and+response+to+cryotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy.</a> J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

仕事の最も困難な部分は、レーザビームの時間的同期です。これは、高速オシロスコープと組み合わせた高速フォトダイオードを必要としますが、時間の唯一のラフな重なりが最初に行うことができます。その後、数cmのさらなる調整が必要です。最後に、リニア並進ステージによってマイクロメートル移動するCARS信号をトリガするために、遅延線の長さの最終的な微調整を行うことができます。並進ステージマイクロメーター駆動を調整することによって観察されるように、この信号は、約20マイクロメートルの狭い範囲内に維持されます。これは、パルス持続時間の約半分、 すなわち、140フェムト秒のビームのピークシフトに対応します。 CARS信号のために必要とされる二つのビームの空間的な重なりは、レーザ走査型顕微鏡システムの通常のビーム位置合わせと同様です。 遅延線の実装は、実験における基本的なバックグラウンドを持つ生物学者によって数週間で達成することができますアル光学系や物理学者とのコラボレーションインチ特別なケアは、反射損失を最小化するために、ミラーの選択のために取らなければなりません。ディレイラインを構...

光学顕微鏡は、細胞内の分解能で生物学的システムを生きているの動的プロセスの非破壊可視化のための主要な技術となっています。蛍光顕微鏡は、その高い特異性と感度1に、現在生きている細胞で使用される最も人気のある画像造影です。蛍光プローブの大きなパレットは（外因性染料、遺伝的にコードされたタンパク質、半導体ナノ粒子）を浮上しています。様々な試料照明蛍光ベースの技術は、3D画像化を実行し、2を光退色されるこの技術の主な欠点を減らすために（例えば、共焦点または二光子顕微鏡法のような）栄えています。分子種の大部分は本質的に蛍光性ではなく、したがって、これらのフルオロフォアは、人為的に撮像された試料に導入しなければならないので、他の制限は、フルオロフォア標識の要件を含みます。この人工的な操作は、小分子のために特に破壊的であるか、または鍋を誘導することができますentialフォト毒性。これらの理由は、生体内の観察のための蛍光顕微鏡ではないに適しています。したがって、蛍光分子を使用することなく、高感度かつ特異的な分子のコントラストを有する光学イメージング技術の使用は、生物医学科学の非常に望ましいです。 標識または染色することなく、いくつかの非線形光学イメージング技術は、第二高調波発生（SHG）3,4と第三高調波発生（THG）5を含む、浮上しています。 SHG顕微鏡は、微小管またはコラーゲン6などの超分子レベルでの画像構造的配置に使用されてきました。 THGは、水性媒体および脂質7との間のインタフェースとしての光不均質から生成されます。 THGは、画像ミエリン8,9に示されました。両方の技術は、二光子蛍光顕微鏡上で実施し、一つのレーザビームを必要とすることができます。しかし、それらは典型的には50（高出力レーザ強度​​を必要とします生活試料中の有害である、と明確にイメージの特定の生物学的構造をするために必要な化学的特異性を提供しないTHG 9用の1180 nm）を、50 mWの- SHG 10、25用の860 nmのmWの。 化学的に選択的なイメージングは​​、ラマン散乱に基づいて固有の分子振動信号から得ることができます。光のビームが問題当たると、光子は吸収され、原子または分子によって散乱させることができます。散乱光子のほとんどは、入射光子と同じエネルギー、 すなわち、周波数を、持っています。このプロセスは、レイリー散乱と呼ばれています。しかしながら、光子の少数は、ラマン散乱と呼ばれる非弾性散乱過程で、すなわち、入射光子の周波数とは異なる光周波数で散乱されます。エネルギー差は、分子構造や環境に応じて振動モードの励起に由来します。したがって、自発ラマン散乱プロブIDEの化学選択的イメージングは​​、異なる分子は、特定の振動周波数を持っています。しかしそれは、その微弱な信号の限られています。共焦点ラマン顕微鏡を開発し、3次元空間分解能を提供するが、それは、高平均パワーと長い取得時間11を必要とされています。これらの困難を克服するために、レーザー技術の最近の進歩は、特に、コヒーレントアンチストークスラマン散乱における非線形光学振動顕微鏡の上昇、（CARS）11,12,13可能にしています。 CARS三次の非線形光学過程です。周波数ωPでポンプビームからなる3つのレーザビームは、周波数ωSのストークスビームおよびプローブビームが（ほとんどの場合、ポンプある）試料に集束され、（周波数ωAS =において反ストークスビームを生成します2ωP - ωS）14。反ストークス信号を大幅に向上させることができる場合の周波数差（ - ωSωP）ポンプおよびストークスビーム間のラマン分子振動のΩのR =に同調されます。 CARS信号は、多光子相互作用に基づいています。したがって、自発ラマン散乱よりも強い大きさのコヒーレント信号の注文を生成します。 CARS顕微鏡法は、第一の実験ダンカンら 15によって示されました。ツンブッシュらは 、高開口数の対物レンズを有する2つの焦点を合わせ、近赤外フェムト秒レーザー光を用いたCARSの位相整合条件を可能にし、二光子非共鳴バックグラウンド16を回避することによって、その後の技術を向上させます。 CARS顕微鏡は、したがって、化学的に、このような生細胞中（OH伸縮振動を介して）（CH伸縮振動を介して）脂質17,18、水、タンパク質、DNA 19,20などの分子を検出することにより、生細胞や組織イメージングのための強力なツールとして浮上していますしかし、化学化合物を重水素化21医薬品及び化粧品用途22のための。 非線形顕微鏡の主な制限は、複雑さと光源のコストに由来します。 CARSシステムは、短いパルス持続時間を持つと時間的および空間的に同期したパルス列を持つ2つの波長可変レーザーを必要とします。初期のCARS顕微鏡は、二つの同期ピコ秒のTiに基づいていた：サファイアレーザー20。スーパコンティニューム光源23を生成するサファイアレーザー：CARSイメージングは、単一のフェムト秒チタンから入手しました。最近では、単一のフェムト秒Tiから成るレーザ光源：波長可変光パラメトリック発振器（OPO）をポンピングサファイアレーザーは、CARS顕微鏡検査のために使用されています。このセットアップは、本質的に時間的にポンプと完全分子の振動スペクトル24を覆うストークスビームの間の周波数の差でビームを同期することを可能にします。また、レーザ走査型顕微鏡ターンに基づきます主に次の2つの光子蛍光（TPF）のために使用されるキーfsレーザとOPOは、非物理学者のために利用できるようになりました。各非線形（NLO）イメージング・モダリティは、特定の構造または分子に敏感であるため、このようなセットアップの可能性が大きく、他の非線形光学イメージングを組み込むことによって補助投資を必要とせずに向上させることができます。マルチモーダルNLOイメージングは、したがって、複雑な生体試料25のためのNLO顕微鏡の可能性を大文字にします。これらの技術の結合は、脂質代謝、皮膚または癌の開発26、骨格筋の発達27、アテローム性動脈硬化病変28に、特に、多くの生物学的な質問の調査を可能にしました。また、CARSのレーザビーム走査の実装は、高速イメージング、 すなわち、 生体内で動的プロセスを研究するための魅力的なツールの能力を与えます。 この作業の目的は、トンを実装するための各ステップを示すことです標準的な多光子レーザー走査型顕微鏡で彼CARS技術。サファイアレーザーとチタン（Tiによってポンプ：サファイアレーザー）OPO：生物学者のためのソフトウェアによって運営顕微鏡は、フェムト秒チタンをベースにしています。積分は、時間的に二つのビームを同期させるために、レーザビーム経路の一方の長さを調整することにより行いました。我々は実験的な光学系における基本的な背景を必要とするこの技術のステップバイステップの実施を説明します。我々はまた、げっ歯類の坐骨神経のミエリン鞘に得られる撮像CARSを示しており、我々はこのイメージングは​​、標準的な二光子蛍光技術と第二高調波発生などの他の非線形光学イメージングと同時に行うことができる示します。

<table><tbody><tr><td>オシロスコープ</td><td>Tektronix</td><td>TDS 520D</td><td>500 MHz&nbsp;</td></tr><tr><td>光検出器</td><td>Thorlabs</td><td>DET08C/M, T4290</td><td>5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm</td></tr><tr><td>Ti:Sapphire レーザー カメレオン ウルトラファミリー II</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光パラメトリック発振器 OPO コンパクトファミリー</td><td>APE ベルリン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクシオ エグザミナー顕微鏡 LSM 7 MP</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電動潜望鏡</td><td>ニューポート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ W プランアポクロマート 20X/1.0</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビームコンバイナー</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>音響光学変調器</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPOパワーアッテネーター</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光電子増倍管</td><td>カールツァイ</td><td></td><td></td></tr>ス<tr><td>ZENソフトウェア</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バンドパスフィルター</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM BiG 1935-176</td><td>400 - 480 nm; 500 - 550&nbsp;海里;465 - 610&nbsp;nm</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>カットオフ波長 760&nbsp;nm</td></tr><tr><td>シルバーミラーニュー</td><td>ポート</td><td>10D20ER.2&nbsp;</td><td>&lambda;/10, 480 - 20,000&nbsp;nm、数量4</td></tr><tr><td>標準マイクロメーター付き単軸並進ステージ</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>数量</td></tr><tr><td>1 アルミブレッドボード</td><td>Thorlabs</td><td>MB1015/M&nbsp;</td><td>数量 1</td></tr><tr><td>ミラーマウント</td><td>Thorlabs</td><td>KMSS/M&nbsp;</td><td>個数 4</td></tr><tr><td>&Oslashのミラーホルダー。1インチ光学&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>MH25</td><td>Quantity 4</td></tr><tr><td>アイリスダイヤフラム&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>ID8/M</td><td>数量 3</td></tr><tr><td>保護ボックス</td><td>Thorlabs</td><td>TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S</td><td>数量 1</td></tr><tr><td>光学ポスト</td><td>Thorlabs</td><td>TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M</td><td>数量 8 (長さは設定により異なる)</td></tr> <tr><td>661-690 nm バンドパスフィルター</td><td>Semrock</td><td>676/29 nm BrightLine&reg; シングルバンドバンドパスフィルター</td><td>数量 1</td></tr><tr><td>蛍光ビーズ</td><td>サーモフィッシャー</td>テ<td>トラスペック&トレード;蛍光マイクロスフィアサイズキット</td><td></td></tr><tr><td>レーザー表示カード</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>IRレーザー表示カード</td></tr><tr><td>レーザー安全ガラス</td><td>ニューポート</td><td>LV-F22。P5L07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>フルオロミエリン&貿易;赤色蛍光ミエリンステイン&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーF34652</td><td></td></tr></tbody></table>

サファイアとopoレーザー基づく標準レーザー走査顕微鏡：tiの上のコヒーレントアンチストークスラマン散乱（cars）システムの実装

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

フェムト秒チタンを組み合わせたレーザー走査型顕微鏡：サファイアレーザと光パラメトリック発振器（OPO）レーザーラインを複製するには、生物学者のために利用できるようになりました。これらのシステムは、主に、マルチチャンネル二光子蛍光顕微鏡用に設計されています。しかし、そのまま、このような第二高調波発生（SHG）や第3高調波発生（THG）などの補完的な非線形光学顕微鏡は、また、構造化分子または水性中型のラベルフリーイメージングを可能にする、このセットアップを行うことができます脂質インターフェース。これらの技術は、生体内の観察に適しているが、化学的特異性が限られています。化学的に選択的なイメージングは​​、ラマン散乱に基づく固有振動信号から得ることができます。共焦点ラマン顕微鏡は、3次元空間分解能を提供するが、それは、高平均パワーと長い取得時間を必要とします。これらの困難を克服するために、レーザー技術の最近の進歩は、develのを可能にしました特にコヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）での非線形光学振動顕微鏡の発、。 CARS顕微鏡は、したがって、化学的にマッピング（OH伸縮振動を介して）（CH伸縮振動を介して）、脂質、水、タンパク質やDNAによって、生物学的および生細胞イメージングのための強力なツールとして浮上しています。本研究では、標準的なOPO結合多光子レーザー走査顕微鏡にCARS技術の実装について述べます。これは、レーザビーム経路の一方の長さを調整することによって二つのレーザラインにおける時間同期に基づいています。我々は、既存の多光子システム上でこの技術のステップバイステップの実装を提示します。実験光学系における基本的な背景が有用であると提示システムは高価な補助的な装置を必要としません。我々はまた、げっ歯類の坐骨神経のミエリン鞘に取得したCARSイメージングを示しており、我々はこのイメージングは​​、標準トンのような他の非線形光学イメージングと同時に行うことができることを示していますWO-光子蛍光技術と第二高調波発生。

<html>標準のTiパルス列の周波数：サファイアレーザーは、典型的には、約80メガヘルツです。サファイアレーザー：OPOそれは、Tiによって励起されるため、同じ周波数を有します。少なくとも200 MHzでの高速オシロスコープは、したがって、必要とされます。範囲600〜1100 nm単位での高速フォトダイオードも必要です。サファイアとOPO信号1 /（2×80×10 6）= 6.2ナノ秒でシフトしている：Tiを時最大時間的なずれが発生します。それ1.9メートル、最大光路シフトに対応する。図2は、OPOレーザービーム（A）から、およびTiから記録パルス列を示す：サファイアレーザー光遅延線（B）を含まない、調整遅延線（Cと）。 図2Aおよび図2Cに示すように、パルス列は、このように略実装遅延線と時間的に同期されます。 PG &quot...

分子結合の固有振動に基づくコヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）顕微鏡検査は、ラベルフリー化学的選択のライブセルイメージングを可能にします。サファイアレーザとOPOレーザー：この作品は、フェムト秒チタンに基づく標準的な多光子レーザー走査顕微鏡上の相補的な顕微鏡技術の実装を提供します。

サファイアとOPOレーザー基づく標準レーザー走査顕微鏡：Tiの上のコヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）システムの実装

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

本手順の全体的な目的は、フェムト秒チタンサファイアレーザーと光パラメトリック発振器に基づく標準的なマルチフォトンレーザー走査顕微鏡を用いて、ラベルフリーで化学的に選択的なライフスタイルイメージングを可能にするCARSと呼ばれる相補的な顕微鏡技術を実装することです。この手法は、脂質関連疾患の理解、皮膚浸透メカニズム、または皮膚疾患など、生物学や神経科学の分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、Ti:SapphireおよびOPOレーザーに基づく標準的なレーザー走査顕微鏡に容易に実装できる点にあります。本手順の実演は、研究員であり、研究室のイメージングプラットフォーム責任者を務めるHassan BoukhaddaouiとVasyl Mytskaniukが行います。テキストプロトコルに従って、チタンサファイアレーザーとOPOレーザーの電源を入れます。顕微鏡用コンピュータの電源を入れます。顕微鏡コンポーネントのスイッチをオンにします。デスクトップ上のアイコンをダブルクリックしてソフトウェアを起動し、テキストプロトコルに従って設定します。次に、カットオフ波長が 760 nanometers のダイクロイックミラーをサイドポートスライダーに配置します。対物レンズノーズピース上の無限遠空間に配置します。提示された結果を再現するためには、PMT1の前に狭帯域パスフィルターとリフレクターキューブを設置し、670 nanometersのCARS信号のみを記録するように設定してください。次に、ミエリンの蛍光観察のためにPMT3の前に、またSHG観察のためにPMT4の前に、それぞれ専用の狭帯域フィルターを配置します。ソフトウェアにおいて、専用のバンドパスフィルターを用いて検出器の信号を設定します。取得タブ内にあるセットアップマネージャーメニューの光路ツールを開き、目的のPMTを有効にして、チャンネルの色を選択してください。例えば、CARSには緑、SHGにはマゼンタを使用します。同一のチタンサファイアレーザーから出力される2つのビームは、OPOビームの生成時に遅延が発生するため、顕微鏡に到達した時点では同期していません。ディレイラインを組み込み、一方のレーザービームパッドの長さを調整することで、以下の手順に従って再同期を行ってください。この操作には、高速フォトダイオードと高速オシロスコープが必要です。まず、BNCケーブルを使用して、オシロスコープの入力チャンネルCH1をレーザー出力の電気的BNC同期出力（sync out）に接続します。次に、入力チャンネルCH2をフォトダイオードに接続します。その後、トリガーメニューを押し、メインメニューボタンのsourceを選択し、さらにCH1として選択したチャンネルに対応するサイドメニューボタンを押して、CH1チャンネルをトリガーとして設定します。次に、10x空気対物レンズの焦点面に配置したフォトダイオードに、光学マウントポストを用いて位置合わせし、固定します。Channelsツールで、チタンサファイアレーザーの波長を830 nanometersに設定し、全出力の1%未満という低出力に定義します。Acquisition Modeツールで、スキャン領域を1点に縮小し、極小のビームでフォトダイオードを照射するようにします。次に、continuousボタンをクリックしてレーザースキャンをオンにします。オシロスコープのAutosetを押し、フォトダイオードを手動で移動させて、オシロスコープの画面にパルス列を表示させます。run/stopボタンを押して、表示を静止させます。次に、チタンサファイアレーザーのスキャンをオフにします。ソフトウェアのChannelsツールをクリックし、830ナノメートルのレーザーを選択解除して、OPO信号を1107ナノメートルかつ低出力に設定します。その後、OPOレーザースキャンをオンにし、オシロスコープでOPOレーザーのパルス列を記録し、OPOレーザースキャンをオフにします。次に、チタンサファイア信号とOPO信号の時間的なずれを比較します。ミラーを配置するために使用するディレイラインの長さを計算してください。作業を進める前に、保護メガネを着用し、手首からチェーンブレスレットや腕時計を外してください。次に、保護チューブを取り外して、遅延線（ディレイライン）を設置するレーザーチタンサファイア光路を開きます。その後、レーザービームを容易に観察できるよう、例えば低出力の 700 nanometers など、可視光領域の波長を選択し、レーザースキャンをオンにします。ここで、光学マウントポストを使用して、開放したレーザー光路に2つのアイリスダイアフラムを設置します。1つのアイリスをディレイラインの出口に、もう1つのアイリスをペリスコープの入口に配置します。次に、アイリス絞りの開口部を狭め、レーザービームの光路に合うように絞りの位置を調整し、光学定盤上に固定します。最後に、3つ目の可動式アイリス絞りの垂直方向の位置を調整します。サイズダイアフラムは、ディレイラインの4つのミラーを順次配置する際にレーザービームの位置を確認し、再アライメント手順のコントロールとして機能します。次に、ミラーM1をディレイラインの入口にあるコンパクトキネマティックミラーマウントに設置し、可動式アイリスダイアフラムを使用してビームの高さを維持するように、その位置と向きを調整します。続いて、計算されたディレイラインの長さに合わせてミラーM2とM3をトランスレーションステージ上に90度の角度で配置し、可動式アイリスダイアフラムを用いてそれらの向きを調整します。遅延線出口のアイリス直前にM4を設置し、2つの固定アイリス絞りを通過するレーザービームの経路に合うよう、その位置と角度を慎重に調整します。次に、顕微鏡対物レンズの出力側にレーザービューイングカードを配置し、レーザービームのプロファイルを確認します。必要に応じて、均一な明るい円盤状のスポットが観察されるよう、M4の向きをわずかに調整してください。最後に、高速フォトダイオードを試料の焦点面にあるレーザービームの下に再配置します。次に、オシロスコープでチタンサファイアレーザービームとOPOビームの間の時間的なずれを観察してください。必要に応じて、トランスレーションステージ全体を移動させて遅延線の長さを変更し、パルスを同期させます。CARS信号に必要な2つのビームの空間的な重なりは、顕微鏡スライドに固定した蛍光ポリスチレンビーズを可視化することで得られます。20倍の水浸対物レンズを用いてビーズにピントを合わせます。次に、取得タブのチャンネルツールでトラック1を追加するか、既存のトラックを使用します。チタンサファイアレーザービームの波長を830 nanometersに、出力を低出力（low power）に設定します。Channelsウィンドウのトラック1のボックスで色を緑に切り替え、light pathウィンドウのPMT3またはPMT4のボックスを選択します。次に、OPOレーザービーム用にトラック2を追加し、波長を1107 nanometers、出力を低出力（low power）に設定します。「Channels」ウィンドウのトラック2のボックスと、「light path」ウィンドウのPMT3またはPMT4のボックスで、色を赤に切り替えます。次に、最大スキャン領域を選択し、両方のトラックのゲインを600に調整します。その後、「continuous」をクリックして、2つのビームによるサンプルのスキャンを順次実行します。2Dビューのスクリーン領域にある画像を確認します。両方のレーザーの出力を上げます。必要に応じて、フォーカスドライブをわずかに動かし、ビーズの焦点面を探します。最後に、クロップを調整し、単一のビーズまたは隣接するビーズのグループに画像をズームインします。次に、ペリスコープコントローラーを使用して、XY平面でビームを重ね合わせます。ソフトウェアのMaintainタブを開いてください。システムオプションをクリックし、電動ペリスコープツールのウィンドウを表示します。詳細はテキストプロトコルで説明されています。両方のレーザービームからの画像を重ね合わせることで、同期が完了します。CARSを活性化させるための精密な時間調整を行うには、オリーブオイルの一滴を載せたガラススライドとカバーガラスを用意します。次に、20倍の水浸対物レンズを用いて、カバーガラスの端に焦点を合わせます。続いて、トラック1において、チタンサファイアレーザービームの波長を830 nanometrsに、OPOの波長を1107 nanometersに設定します。同時スキャンを行うため、トラック1の両方のレーザーを切り替えます。まず、両方のレーザーを低出力に設定します。次に、ライトパスウィンドウでPMT4のチェックを外し、PMT1を選択します。次に、最大スキャン領域を選択し、continuousボタンをクリックしてレーザースキャンを開始します。ゲインを600に調整し、必要に応じて両方のレーザーの出力を上げます。続いて、ディスプレイビューのオプション制御ブロックで表示強度を調整します。次に、信号が大幅に増強されるまで、遅延線のトランスレーションステージをゆっくりと移動させます。続いて、両方のレーザーの出力を下げます。ここで、2つのレーザーの一方を交互にオフにして、信号がCARS信号であるかを確認します。信号強度が弱くなるか消失すれば、CARS信号が得られたことになります。最終的なシステムは非物理学者が使用することを想定しているため、有害で不可視の高ピークパワーレーザービームへの直接的な接触を避けるため、遅延線の光路をエンクロージャボックスとチューブで囲ってください。ただし、ステージの移動ノブへのアクセスは確保してください。髄鞘を選択的に染色するフルロマイエリン赤色染料を用いて、髄鞘を観察しました。830 nmと1095 nmで同時に照射することにより、CARS信号が得られます。円で囲まれた部分は、横断切片における軸索を囲む髄鞘に対応しています。CARS画像と蛍光画像を重ね合わせた際にも、同様の構造が確認されました。CARSによる詳細度と蛍光ラベルによる詳細度は非常に類似しています。これにより、色素を使用する必要性がなくなる可能性があります。このシステムは、坐骨神経の外表面にあるコラーゲン線維からの第2高調波信号を同時に生成することも可能です。CARS信号の記録には670 nmの狭帯域パスフィルターが使用されているため、550 nmの信号を記録するために別の検出器が使用されます。線維はマゼンタ色の擬似カラーで示されています。CARS信号のみで、髄鞘が明確に示されています。両方の信号を同時に可視化することで、マゼンタ色で示されるコラーゲン線維に囲まれた緑色の髄鞘が確認できます。CARS信号は、SHGまたはTHG信号よりも少ないエネルギーで検出可能です。CARS信号は、830 nmで4 mW、1095 nmで13 mWで得られ、一方でSHG信号を得るには1095 nmで50 mWが必要でした。このビデオを視聴することで、2つのレーザービームを時間的に同期させるために、一方のレーザービーム経路を段階的に修正する方法を十分に理解できるはずです。ディレイラインの実装は、実験光学の基礎知識を持つ生物学者が数週間で行うか、あるいは物理学者と共同して行うことが可能です。高出力で不可視のレーザービームを取り扱うことは非常に危険であることに留意してください。手順の実施中にゴーグルを着用し、レーザービームの光路を最終的に遮蔽するなど、適切な予防策を講じる必要があります。

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生物学

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二重共鳴コヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）と生物学的構造の差イメージング

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サファイアとOPOレーザー基づく標準レーザー走査顕微鏡：Tiの上のコヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）システムの実装

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