Name: ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学ぶヒト血液中の顆粒球と単球の食作用および酸化バースト活動測定法。フローサイトメトリーと血液分析を用いて、運動や食事介入による免疫応答を評価する実験手法を解説します。

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著者は、この手順の最適化中に彼らの援助のためにザック・シュー、ケーシー・ジョン、およびリンCialdella-カムを承認したいと思います。

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この原稿は、顆粒球と単球機能の2つのインジケータの決意のためのステップバイステップのプロトコルを提供します。私たちは、このアッセイの成功に不可欠ないくつかの手順を確認しています。そのような工程は、細菌の添加の直前に発生した氷浴インキュベーションです。すべてのサンプルの徹底的な冷却は、食作​​用およびOB活性に対する温度の影響を最小限に抑えることができます。もう一つの重要なステップは、各サンプルに細菌を添加することです。 8：1の細菌：食細胞の比率は、最適な結果が得られます。しかし、他の研究者は、この比は、適切な結果を生成するように変更する必要があることを見つけることができます。もう一つの重要なステップは、白血球を赤血球を溶解し、修正するためのRBCの溶解およびWBCの固定試薬の使用です。このような試薬の使用は、赤血球の完全な溶解を確実にかつ安全に4℃で一晩処理したサンプルを保存してから、次の日に、フローサイトメーターを介してそれらを実行するために研究者を可能にします。以前の研究（未発表）インド語RBCの溶解およびWBCの固定データの整合性を損なうことなく、などの多くの12のような時間で固定したサンプルのフローサイトメトリーを遅延させるた...

顆粒球及び単球貪食/酸化的バースト（OB）活性アッセイ頻繁に長時間の、集中運動後の先天性免疫機能に関する情報を収集するために使用されるシンプルな、ストレートフォワードの手法である。1-4に対する免疫系の応答を研究するときこれらは宿主防御において中心的な役割を果たし、感染部位に蓄積するための第一の免疫細胞であるため、刺激、顆粒球および単球は、特に重要である。5好中球、顆粒球の種類は、損傷した筋肉内に移行する最初の細胞であります激しい運動後の組織。6食作用およびOBの活動は、顆粒球や単球機能、7の最も一般的な尺度であり、なぜなら、感染プロセスと修復プロセスの両方におけるそれらの中心的役割の自然免疫細胞機能の指標として好ましいです。 この原稿utiliに記載のアッセイ全血における顆粒球や単球食作用およびOBの活動の定量的な決意を提供するために、サイトメーターの基本的な流れをZES。それは、アッセイは、時間のかかる精製操作なしで行われることを可能にするため、この技術では全血を使用することが有利です。このアッセイは、容易に研究設計および実験室機能の様々に適応するように修正することができます。例えば、リャオらは 、その好中球OB活性を示すために同様の技術を利用したが、外傷性脳損傷後に増加し、好中球の食作用低下する。8の別の実施例では、McFarlin らは 、アロ使用するこの技術のエレガントな修飾（APC記載しました）それらの食作用およびOB活動に関して顆粒球を分類するCD66bと画像ベースのフローサイトメトリーと高性能タンデムAPC共役CD45標識を抱合。7,9 私たちの研究グループは、このテの様々な適応を使用していますほぼ20年間、太りすぎ肥満、および運動競技集団における先天性免疫機能の指標としてchnique。10,11のテキストは、以下のこのアッセイを実行するためのステップバイステップの手順を読者に提供し、読者が適応させることができる領域を強調表示します彼らの研究のニーズを満たすことができます。

<table><tbody><tr><td>12 x 75 mm チューブ、キャップ付き</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>サンプルあたり 2 本のチューブ (「H」と「F」) とバッチごとに 3 本のチューブが必要になります (アッセイコントロール用、「F」、「H」、「BLOOD ONLY」)。</td></tr><tr><td>PBS(10x)、pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>ボトルトップ 0.2 & マイクロ;m セルロースアセテートフィルター(容量500ml)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>09-741-07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>グルコース、粉末</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸 (無水、細胞培養試験済み、植物細胞培養試験済み)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>ジヒドロエチジウム (ヒドロエチジン) (HE)</td><td>Life Technologies</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)無水ライフ</td><td>テクノロジー</td><td>ズD12345</td><td></td></tr>黄色<tr><td>ブドウ球菌&nbsp;(タンパク質を含まない木材株 A) BioParticles, フルオレセインコンジュゲート (FITC)</td><td>Life Technologies</td><td>S2851</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;(タンパク質を含まない木材株 A) BioParticles, unlabeled</td><td>Life Technologies</td><td>S-2859</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>7.2 mg K2EDTA, 噴霧乾燥VWRを含む4.0mlの気管</td><td></td><td>BD367861</td><td>サンプルごとに1本のK2EDTA採血チューブが必要になります。</td></tr><tr><td>4.0 mlの真空管 68 USP単位 リチウムヘパリン、スプレーコーティングされた</td><td>VWR</td><td>BD367884</td><td>サンプルごとに1本のリチウムヘパリン採血チューブが必要になります。</td></tr><tr><td>コールターAc&middot;T 5diff CP</td><td>ベックマン・コールター</td><td>6605705</td><td>すなわち、血液分析装置</td></tr><tr><td>コールター Ac&middot;T 5diffリンス</td><td>ベックマンコールター</td><td>8547167</td><td></td></tr><tr><td>コールターAc&middot;T 5diff Fix</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff WBC Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff Hgb Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff Cal キャリブレーター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>コールター Ac&middot;T 5diff Control Plus</td><td>ベックマン・コールター</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff 希釈剤</td><td>ベックマン・コールター</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;l 延長長ピペットチップ</td><td>VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>断熱アイスパン</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>氷水浴用。</td></tr><tr><td>オープンメタルチューブラック</td><td>VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>TQ-Prep Workstation</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605429</td><td>i.e.、自動細胞溶解調製ワークステーション</td></tr><tr><td>ImmunoPrep 試薬システム</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546999</td><td>i.e.、RBC lyse/WBC fix 試薬システム</td></tr><tr><td>Cytomics FC500 MCL フローサイトメトリーシステム(CXPソフトウェア付き</td><td>) ベックマン・コールター</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlowシース液</td><td>ベックマン・コールター</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>コールター CLENZ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check Fluorospheres&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td> <td>6605359、アライメントおよび流体系検証</td></tr><tr><td>フロージョソフトウェア</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>、フローサイトメトリー解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>マイクロソフト</td><td></td><td>マイクロソフト Excel</td><td>i.e.、電子スプレッドシートプログラム</td></tr></tbody></table>

ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

顆粒球および単球の食作用および酸化的バースト(OB)活性アッセイは、自然免疫系の研究に使用できます。この原稿は、このアッセイを運動免疫学の武器に加えるために必要な方法論を提供します。このアッセイの最初のステップは、全血(ヘパリン)の2つのアリコート(「H」と「F」)を調製することです。次に、ジヒドロエチジウムをHアリコートに添加し、両方のアリコートを温水浴でインキュベートした後、冷水浴でインキュベートします。次に、Hアリコートに黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)を、Fアリコート(細菌:食細胞=8:1)にフルオレセインイソチオシアネート標識黄色ブドウ球菌を添加し、両アリコートを温水浴でインキュベートした後、冷水浴でインキュベートします。次に、トリパンブルーを各アリコートに添加して細胞外蛍光を消光し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。次に、赤血球を溶解し、白血球を固定します。最後に、フローサイトメーターと適切な解析ソフトウェアを使用して、顆粒球および単球の食作用とOB活性を測定します。このアッセイは20年以上使用されています。重くて長時間の運動の後、アスリートは食作用の有意ではあるが一時的な増加とOB活動の長期にわたる減少を経験します。運動後の食作用の増加は、炎症と相関しています。正常体重の個人とは対照的に、顆粒球および単球食作用は、過体重および肥満の参加者で慢性的に上昇し、C反応性タンパク質とわずかに相関しています。要約すると、このフローサイトメトリーベースのアッセイは、食細胞の食作用とOB活性を測定し、運動および肥満誘発性炎症の追加測定として使用できます。

長時間の集中的な運動は、ナチュラルキラー細胞機能、ウイルス感染に対するマクロファージのサイトカイン媒介応答、および顆粒球と単球の食作用およびOBの活性を含む先天性免疫機能に重大な影響を持っています。複数の研究は、筋損傷および代謝要求により誘発される炎症を反映して、大幅に運動後、その顆粒球と単球貪食増加を示しています。これとは対照的に、顆粒球および単球OBの活動は、運動後に減少し、感染に対する感受性の増加の1免疫の指標とすることができます。例えば、 図1は、Sの食作用を示し、顆粒球によって黄色ブドウ球菌は、次の朝までに正常に戻って、75キロのサイクリング試合（70％VO 2MAX）の直後に増加し、1.5時間です。単球の食作用は、同様に、運動のこのレベルによって影響される。 図2は、顆粒球のOBの活動が減少であることを示しています75キロのサイクリング後少なくとも21時間、D。単球のOB活性はまた、75キロのサイクリング後に減少されます。 <p...

この原稿の目的は、ヒトの血液サンプルにおける単球および顆粒球の食作用と酸化的バースト活性を測定する方法を提示することです。

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

このアッセイの全体的な目的は、全血中の顆粒球および単球における食作用と酸化バースト活性を測定することです。この手法は、特定の食事介入が運動に対する免疫応答にどのような影響を与えるかなど、免疫学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法の主な利点は、シンプルで簡便なアッセイであるため、利用可能な研究室のリソースや研究目的に応じて容易に修正できる点にあります。私たちは過去20年間にわたり、多くの運動試験においてこの自然免疫機能の指標を用いてきました。これらのデータの一部については、ビデオの後半で共有します。手順を開始する前に、血液分析装置を使用して、製造元の指示に従い、血液サンプルの全血球計算および白血球分画分析を行ってください。サンプルの白血球数（cells/mL）ならびに好中球および単球の割合（%）を記録してください。次に、各実験チューブおよびコントロールチューブについて、延長チップを用いて、リチウムヘパリン採血管から各全血検体100 µLを、適切にラベルを貼った12 × 75 mmチューブの底に分注します。すべての血液の分注が完了したら、HEコントロールチューブを含む、赤インクで「H」と表記されたラベルのチューブに、HE作動液10 µLを加えます。チューブのキャップを取り外します。サンプルを短時間ボルテックスし、チューブをオープンメタルラックに入れ、5分ごとに軽く揺らしながら37°Cの温水浴でインキュベートします。15分後、ラックとチューブを素早く氷水浴に移し、同様に5分ごとに軽く揺らしながら12分間冷却します。インキュベーションの終了後、赤インクで「H」と表記されたチューブ（HEコントロールチューブを含む）に、適切な量の非標識S.aureusワーキングソリューションを加えます。キャップを閉めた状態で、チューブを短時間ボルテックスします。次に、黒いインクで「F」と表記されたチューブ（FITCコントロールチューブを含む）に、適量のFITC標識S.aureus作業溶液を加え、サンプルを短時間ボルテックスします。続いて、すべてのチューブを37°Cの恒温水槽で20分間インキュベートし、その間5分ごとに振盪させます。その後、氷水で1分間冷却します。サンプルを室温に置いた後、リピーターピペットを使用して、すべてのチューブに氷冷したクエンチ溶液を100 µL加え、サンプルをボルテックスします。サンプルを氷上に戻します。1分後、リピーターピペットを使用して、各チューブに氷冷したPBSを1 mL加えます。その後、チューブをボルテックスし、サンプルにPBSをさらに2 mL加えます。次に、細胞を遠心分離し、上澄み液を吸引除去します。リピーターピペットを用いて、氷冷したFBS 50 µLをチューブに加えます。ボルテックス後、すべてのチューブをカルーセルに移動させます。自動細胞溶解調製ワークステーションを使用し、製造元の指示に従って赤血球を溶解し、白血球を固定します。フローサイトメトリーでアッセイ結果を解析するには、フローサイトメトリーシステムのデータ取得ソフトウェアを開き、新しいプロトコルを作成します。食作用アッセイにはFL1パラメータにFITCを、酸化バースト活性アッセイにはFL2パラメータにHEを選択します。前方散乱光（FSC）対側方散乱光（SSC）のドットプロット、FL1ヒストグラム、およびFL2ヒストグラムを作成します。次に、前方散乱光対側方散乱光プロット上で白血球、顆粒球、および単球の集団に対してポリゴナル領域を設定し、ヒストグラム上に線形領域を設定します。次に、血液のみの陰性コントロールサンプルを実行し、続いてHEおよびFITC陽性コントロールサンプルを実行します。ヒストグラムを確認し、必要に応じてFITCおよびPEチャネルの光電子増倍管電圧を調整してください。その後、コントロールサンプルのデータ収集を開始します。15分間の平衡化時間を置いた後、ワークリストの順序に従って実験サンプルをカルーセルにロードし、研究サンプルの解析を開始します。サンプルの食細胞活性を評価するために、まず、すべてのFラベル済みサンプルとコントロールのリストモードデータファイルを単一のフォルダにまとめ、それらのファイルをフローサイトメトリー解析ソフトウェアのサンプルスペースにドラッグします。コントロールサンプルをダブルクリックし、ポリゴンゲートセレクターを使用して、チャートの端にあるすべての細胞が含まれるように注意しながら、全白血球集団のゲートを設定します。このゲートにWBCというラベルを付けます。WBCゲートをダブルクリックし、楕円形ゲートセレクターを使用してリンパ球ゲートを設定します。ゲートに適切なラベルを付け、細胞が容易に観察できるよう、ゲートのデータパーセント表示を脇にドラッグします。次に、ポリゴンゲートセレクターを使用して、顆粒球ゲートおよび単球ゲートを設定します。各ゲートに適切にラベルを付け、ゲートデータのパーセント表示を横にドラッグします。FITCコントロールサンプルをダブルクリックし、次に顆粒球ゲートを選択して、ドロップダウンメニューからX軸をFL1に、Y軸を側方散乱光（SS）に設定します。四角形ゲートセレクターを使用して、食作用陰性ゲートと食作用陽性ゲートを設定します。顆粒球集団の食作用陽性ゲートをハイライトします。次に、「Workspace」をクリックして「Add Statistic」を選択します。「Geometric Mean」と「FL1」をハイライトして、食作用陽性顆粒球の蛍光強度を生成し、「Add」をクリックします。その後、親統計量の頻度（frequency of parent statistic）を選択して「Add」をクリックし、顆粒球のうち食作用陽性であるものの割合を算出します。これらの設定をすべての研究サンプルに適用するには、FITCコントロールサンプルで作成したすべてのゲートと統計項目を選択し、グループパネルの「All Samples」エリアにドラッグします。作業内容を、リストモードデータフォルダが含まれているフォルダと同じフォルダにWSPファイルとして保存します。次に、データセット内の最初の実験サンプルをクリックし、白血球ゲートが各サンプルの細胞分布に適切に適合しているかを確認し、必要に応じてゲートの端を調整してください。次に、最初の実験サンプルの白血球ゲートをクリックし、顆粒球、単球、およびリンパ球のゲートが各サンプルの細胞分布に適合しているかを確認し、必要に応じてゲートを調整します。ファイルを保存した後、テーブルエディターアイコンをクリックし、関心のある各統計量をテーブルにドラッグします。[Create Table] をクリックしてデータをスプレッドシート形式で表示し、作業内容を XLSX ファイルとして保存します。次に、先ほど示した方法で、H標識した酸化バースト活性サンプルおよびコントロールのリストモードデータファイルの解析を繰り返します。この代表的な実験で示されたように、顆粒球によるS.aureusの食作用は、75kmのサイクリング走行直後および1.5時間後に増加し、翌朝までには正常に戻ります。顆粒球の酸化バースト活性は、このレベルの運動後、少なくとも21時間にわたって低下します。さらに、106名の過体重または肥満の女性を対象とした本解析では、顆粒球の貪食能と血清C反応性タンパク質値との間に緩やかな相関が認められました。これは、安静時の被験者における顆粒球および単球の高い貪食能が、全身性炎症の指標となる可能性を示唆しています。本手法に習熟すれば、適切に実施した場合、約7時間で30検体の処理を完了できます。この手順を行う際は、検体間の不自然なばらつきを最小限に抑えるため、細菌を添加する前に検体を完全に冷却させることが重要です。この手順に続いて、サイトカイン定量などの他の方法を実施することで、介入が炎症反応に及ぼす影響を判定できます。本手法の開発により、免疫学分野の研究者が、さまざまなライフスタイルの変化やヒトの自然免疫機能の影響を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、フローサイトメーターを用いて顆粒球および単球の食作用と活性酸素産生能（オキシダティブバースト活性）を測定する方法について、十分な理解を得られるはずです。ヒト血液の取り扱いは極めて危険であるため、本手順を実施する際は、適切なPPE（個人用保護具）の着用などの予防策を常に講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、ヒト白血球によるFITC標識病原性真菌胞子の食作用を定量化する方法を示しています。食作用した胞子は、対比染色によって細胞付着胞子から識別され、続いてフローサイトメトリー分析が行われます。...

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不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

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単球マクロファージアッセイを用いた赤血球抗体の意義の予測

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in vitroでのラットマクロファージによる同種および異種赤血球の食作用の定量的評価

学ぶヒト血液中の顆粒球と単球の食作用および酸化バースト活動測定法。フローサイトメトリーと血液分析を用いて、運動や食事介入による免疫応答を評価する実験手法を解説します。

ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

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