Name: ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学ぶヒト血液中の顆粒球と単球の食作用および酸化バースト活動測定法。フローサイトメトリーと血液分析を用いて、運動や食事介入による免疫応答を評価する実験手法を解説します。

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著者は、この手順の最適化中に彼らの援助のためにザック・シュー、ケーシー・ジョン、およびリンCialdella-カムを承認したいと思います。

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この原稿は、顆粒球と単球機能の2つのインジケータの決意のためのステップバイステップのプロトコルを提供します。私たちは、このアッセイの成功に不可欠ないくつかの手順を確認しています。そのような工程は、細菌の添加の直前に発生した氷浴インキュベーションです。すべてのサンプルの徹底的な冷却は、食作​​用およびOB活性に対する温度の影響を最小限に抑えることができます。もう一つの重要なステップは、各サンプルに細菌を添加することです。 8：1の細菌：食細胞の比率は、最適な結果が得られます。しかし、他の研究者は、この比は、適切な結果を生成するように変更する必要があることを見つけることができます。もう一つの重要なステップは、白血球を赤血球を溶解し、修正するためのRBCの溶解およびWBCの固定試薬の使用です。このような試薬の使用は、赤血球の完全な溶解を確実にかつ安全に4℃で一晩処理したサンプルを保存してから、次の日に、フローサイトメーターを介してそれらを実行するために研究者を可能にします。以前の研究（未発表）インド語RBCの溶解およびWBCの固定データの整合性を損なうことなく、などの多くの12のような時間で固定したサンプルのフローサイトメトリーを遅延させるた...

顆粒球及び単球貪食/酸化的バースト（OB）活性アッセイ頻繁に長時間の、集中運動後の先天性免疫機能に関する情報を収集するために使用されるシンプルな、ストレートフォワードの手法である。1-4に対する免疫系の応答を研究するときこれらは宿主防御において中心的な役割を果たし、感染部位に蓄積するための第一の免疫細胞であるため、刺激、顆粒球および単球は、特に重要である。5好中球、顆粒球の種類は、損傷した筋肉内に移行する最初の細胞であります激しい運動後の組織。6食作用およびOBの活動は、顆粒球や単球機能、7の最も一般的な尺度であり、なぜなら、感染プロセスと修復プロセスの両方におけるそれらの中心的役割の自然免疫細胞機能の指標として好ましいです。 この原稿utiliに記載のアッセイ全血における顆粒球や単球食作用およびOBの活動の定量的な決意を提供するために、サイトメーターの基本的な流れをZES。それは、アッセイは、時間のかかる精製操作なしで行われることを可能にするため、この技術では全血を使用することが有利です。このアッセイは、容易に研究設計および実験室機能の様々に適応するように修正することができます。例えば、リャオらは 、その好中球OB活性を示すために同様の技術を利用したが、外傷性脳損傷後に増加し、好中球の食作用低下する。8の別の実施例では、McFarlin らは 、アロ使用するこの技術のエレガントな修飾（APC記載しました）それらの食作用およびOB活動に関して顆粒球を分類するCD66bと画像ベースのフローサイトメトリーと高性能タンデムAPC共役CD45標識を抱合。7,9 私たちの研究グループは、このテの様々な適応を使用していますほぼ20年間、太りすぎ肥満、および運動競技集団における先天性免疫機能の指標としてchnique。10,11のテキストは、以下のこのアッセイを実行するためのステップバイステップの手順を読者に提供し、読者が適応させることができる領域を強調表示します彼らの研究のニーズを満たすことができます。

<table><tbody><tr><td>12 x 75 mm チューブ、キャップ付き</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>サンプルあたり 2 本のチューブ (「H」と「F」) とバッチごとに 3 本のチューブが必要になります (アッセイコントロール用、「F」、「H」、「BLOOD ONLY」)。</td></tr><tr><td>PBS(10x)、pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>ボトルトップ 0.2 & マイクロ;m セルロースアセテートフィルター(容量500ml)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>09-741-07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>グルコース、粉末</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸 (無水、細胞培養試験済み、植物細胞培養試験済み)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>ジヒドロエチジウム (ヒドロエチジン) (HE)</td><td>Life Technologies</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)無水ライフ</td><td>テクノロジー</td><td>ズD12345</td><td></td></tr>黄色<tr><td>ブドウ球菌&nbsp;(タンパク質を含まない木材株 A) BioParticles, フルオレセインコンジュゲート (FITC)</td><td>Life Technologies</td><td>S2851</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;(タンパク質を含まない木材株 A) BioParticles, unlabeled</td><td>Life Technologies</td><td>S-2859</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>7.2 mg K2EDTA, 噴霧乾燥VWRを含む4.0mlの気管</td><td></td><td>BD367861</td><td>サンプルごとに1本のK2EDTA採血チューブが必要になります。</td></tr><tr><td>4.0 mlの真空管 68 USP単位 リチウムヘパリン、スプレーコーティングされた</td><td>VWR</td><td>BD367884</td><td>サンプルごとに1本のリチウムヘパリン採血チューブが必要になります。</td></tr><tr><td>コールターAc&middot;T 5diff CP</td><td>ベックマン・コールター</td><td>6605705</td><td>すなわち、血液分析装置</td></tr><tr><td>コールター Ac&middot;T 5diffリンス</td><td>ベックマンコールター</td><td>8547167</td><td></td></tr><tr><td>コールターAc&middot;T 5diff Fix</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff WBC Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff Hgb Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot;T 5diff Cal キャリブレーター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>コールター Ac&middot;T 5diff Control Plus</td><td>ベックマン・コールター</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff 希釈剤</td><td>ベックマン・コールター</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;l 延長長ピペットチップ</td><td>VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>断熱アイスパン</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>氷水浴用。</td></tr><tr><td>オープンメタルチューブラック</td><td>VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>TQ-Prep Workstation</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605429</td><td>i.e.、自動細胞溶解調製ワークステーション</td></tr><tr><td>ImmunoPrep 試薬システム</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546999</td><td>i.e.、RBC lyse/WBC fix 試薬システム</td></tr><tr><td>Cytomics FC500 MCL フローサイトメトリーシステム(CXPソフトウェア付き</td><td>) ベックマン・コールター</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlowシース液</td><td>ベックマン・コールター</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>コールター CLENZ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check Fluorospheres&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td> <td>6605359、アライメントおよび流体系検証</td></tr><tr><td>フロージョソフトウェア</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>、フローサイトメトリー解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>マイクロソフト</td><td></td><td>マイクロソフト Excel</td><td>i.e.、電子スプレッドシートプログラム</td></tr></tbody></table>

ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

顆粒球および単球の食作用および酸化的バースト(OB)活性アッセイは、自然免疫系の研究に使用できます。この原稿は、このアッセイを運動免疫学の武器に加えるために必要な方法論を提供します。このアッセイの最初のステップは、全血(ヘパリン)の2つのアリコート(「H」と「F」)を調製することです。次に、ジヒドロエチジウムをHアリコートに添加し、両方のアリコートを温水浴でインキュベートした後、冷水浴でインキュベートします。次に、Hアリコートに黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)を、Fアリコート(細菌:食細胞=8:1)にフルオレセインイソチオシアネート標識黄色ブドウ球菌を添加し、両アリコートを温水浴でインキュベートした後、冷水浴でインキュベートします。次に、トリパンブルーを各アリコートに添加して細胞外蛍光を消光し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。次に、赤血球を溶解し、白血球を固定します。最後に、フローサイトメーターと適切な解析ソフトウェアを使用して、顆粒球および単球の食作用とOB活性を測定します。このアッセイは20年以上使用されています。重くて長時間の運動の後、アスリートは食作用の有意ではあるが一時的な増加とOB活動の長期にわたる減少を経験します。運動後の食作用の増加は、炎症と相関しています。正常体重の個人とは対照的に、顆粒球および単球食作用は、過体重および肥満の参加者で慢性的に上昇し、C反応性タンパク質とわずかに相関しています。要約すると、このフローサイトメトリーベースのアッセイは、食細胞の食作用とOB活性を測定し、運動および肥満誘発性炎症の追加測定として使用できます。

長時間の集中的な運動は、ナチュラルキラー細胞機能、ウイルス感染に対するマクロファージのサイトカイン媒介応答、および顆粒球と単球の食作用およびOBの活性を含む先天性免疫機能に重大な影響を持っています。複数の研究は、筋損傷および代謝要求により誘発される炎症を反映して、大幅に運動後、その顆粒球と単球貪食増加を示しています。これとは対照的に、顆粒球および単球OBの活動は、運動後に減少し、感染に対する感受性の増加の1免疫の指標とすることができます。例えば、 図1は、Sの食作用を示し、顆粒球によって黄色ブドウ球菌は、次の朝までに正常に戻って、75キロのサイクリング試合（70％VO 2MAX）の直後に増加し、1.5時間です。単球の食作用は、同様に、運動のこのレベルによって影響される。 図2は、顆粒球のOBの活動が減少であることを示しています75キロのサイクリング後少なくとも21時間、D。単球のOB活性はまた、75キロのサイクリング後に減少されます。 <p...

この原稿の目的は、ヒトの血液サンプルにおける単球および顆粒球の食作用と酸化的バースト活性を測定する方法を提示することです。

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

このアッセイの全体的な目的は、全血中の顆粒球および単球における食作用と酸化バースト活性を測定することです。この手法は、特定の食事介入が運動に対する免疫応答にどのような影響を与えるかなど、免疫学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法の主な利点は、シンプルで簡便なアッセイであるため、利用可能な研究室のリソースや研究目的に応じて容易に修正できる点にあります。私たちは過去20年間にわたり、多くの運動試験においてこの自然免疫機能の指標を用いてきました。これらのデータの一部については、ビデオの後半で共有します。手順を開始する前に、血液分析装置を使用して、製造元の指示に従い、血液サンプルの全血球計算および白血球分画分析を行ってください。サンプルの白血球数（cells/mL）ならびに好中球および単球の割合（%）を記録してください。次に、各実験チューブおよびコントロールチューブについて、延長チップを用いて、リチウムヘパリン採血管から各全血検体100 µLを、適切にラベルを貼った12 × 75 mmチューブの底に分注します。すべての血液の分注が完了したら、HEコントロールチューブを含む、赤インクで「H」と表記されたラベルのチューブに、HE作動液10 µLを加えます。チューブのキャップを取り外します。サンプルを短時間ボルテックスし、チューブをオープンメタルラックに入れ、5分ごとに軽く揺らしながら37°Cの温水浴でインキュベートします。15分後、ラックとチューブを素早く氷水浴に移し、同様に5分ごとに軽く揺らしながら12分間冷却します。インキュベーションの終了後、赤インクで「H」と表記されたチューブ（HEコントロールチューブを含む）に、適切な量の非標識S.aureusワーキングソリューションを加えます。キャップを閉めた状態で、チューブを短時間ボルテックスします。次に、黒いインクで「F」と表記されたチューブ（FITCコントロールチューブを含む）に、適量のFITC標識S.aureus作業溶液を加え、サンプルを短時間ボルテックスします。続いて、すべてのチューブを37°Cの恒温水槽で20分間インキュベートし、その間5分ごとに振盪させます。その後、氷水で1分間冷却します。サンプルを室温に置いた後、リピーターピペットを使用して、すべてのチューブに氷冷したクエンチ溶液を100 µL加え、サンプルをボルテックスします。サンプルを氷上に戻します。1分後、リピーターピペットを使用して、各チューブに氷冷したPBSを1 mL加えます。その後、チューブをボルテックスし、サンプルにPBSをさらに2 mL加えます。次に、細胞を遠心分離し、上澄み液を吸引除去します。リピーターピペットを用いて、氷冷したFBS 50 µLをチューブに加えます。ボルテックス後、すべてのチューブをカルーセルに移動させます。自動

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このビデオは、フローサイトメトリーを介してヒトの血液中の細胞による食作用活性を確認するアッセイを示しています。顆粒球と単球は、それぞれ飲み込まれた細菌の存在と酸化バースト活性を確認する緑と赤の蛍光を示すことにより、食作用を確認します。...

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このビデオでは、末梢血の初代単球を利用して、ポリD抗体オプソニン化R2R2赤血球によるFcγ受容体媒介性食作用を評価する単球単層アッセイを紹介しています。...

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不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

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