リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

この手順の全体的な目標は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を培養し、生細胞のタイムラプスイメージングを使用して細胞骨格のダイナミクスと細胞移動を分析することです。このビデオで説明する方法は、細胞、分子、およびメカノバイオロジーの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、このプロトコルを使用して、異なるECMの関与によって細胞の形状と運動性がどのように調節されるかを特定することができます。

サンプル調製ステップは実行が難しいため、視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。彼らは、プロセス全体を通してタイムリーに細胞を正確に取り扱う必要があります。この方法は、血管新生中の内皮細胞の運動性に関する洞察を得ることができますが、事実上あらゆる接着細胞モデルシステムの顕微鏡的研究にも適用できます。

鉗子を使用して、100%エタノール貯蔵ジャーからカバースリップを拾い上げ、ブンゼンバーナー炎に通して滅菌します。次に、35mmのシャーレに入れます。サンプルごとに1枚のカバースリップを準備します。

1.5ミリリットルの微量遠心チューブに、1ミリリットルあたり1ミリグラムのフィブロネクチンストック溶液と990マイクロリットルのPBSを10マイクロリットル加えます。次に、250マイクロリットルの溶液を各カバーガラスにピペットで移します。溶液を均一に広げて表面を覆います。

カバーガラスを摂氏37度で最低3時間インキュベートします。使用する前に、各カバーガラスを2ミリリットルのPBSで3回すすいでください。血球計算盤を使用して、培養HUVECの数を決定し、非移行実験の場合はカバーガラスあたり100, 000細胞、移動実験の場合はカバーガラス1枚あたり500, 000細胞を含む容量を微量遠心チューブに移します。

細胞をGの1倍、400倍で4分間回転させてペレット化します。スピン後、試験する各条件について、100マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーに最大100万個の細胞を再懸濁し、それらを1マイクログラムのcDNAと組み合わせます。細胞をエレクトロポレーションキュベットに移します。

HUVECエレクトロポレーション用に指定されたプログラムを使用して、細胞とDNA混合物をトランスフェクションします。次に、トランスフェクションされた細胞をレスキューし、500マイクロリットルの完全内皮基礎培地を添加します。次に、フィブロネクチンでコーティングされたカバースリップに適切な細胞量をプレートします。

細胞を摂氏37度で3〜4時間インキュベートして、cDNAコンストラクトの発現時間を確保します。イメージングの準備として、2.5 cm x 0.65 cmの両面テープを2枚取り、きれいなスライドガラスの上端と下端に沿って水平に固定します。テープとスライドエッジとの間には、チャンバーをシールするためのスペースを少し空けることが重要であることに注意してください。

カバースリップの 2 つの端がテープに載るように、カバースリップをセル側を下にして取り付けます。鉗子を使用して軽く押し下げ、カバースリップを固定します。マイクロピペットを使用して、カバーガラスとスライドの間に40マイクロリットルのイメージング媒体を追加します。

カバーガラスとスライドの間のスペースがイメージングメディアで完全に満たされていることを確認してください。必要に応じて、紙のワイプで余分な媒体を拭き取ります。すべてのスライドエッジを温かいVALAPでシールします。

ガラスカバースリップをそっと押して、漏れがないか確認します。取り付けて密封したカバースリップを、摂氏37度に予熱した顕微鏡ステージに置きます。スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して、タイムラプス画像シーケンス、青色蛍光タンパク質画像、およびDIC画像をキャプチャします。

添付のドキュメントで説明されているように、微小管のダイナミクスと共局在を解析します。細胞遊走アッセイを行うには、エレクトロポレーションステップの後、80マイクロリットルの完全内皮基礎培地を添加してトランスフェクションした細胞をレスキューします。次に、80マイクロリットルのサンプル全体を1滴として、乾燥したフィブロネクチンコーティングされたカバースリップの中央にピペットで移します。

滴を広げないでください。カバーガラスに接触したときに80マイクロリットルの落下が分離するのを防ぐために、カバーガラスを乾燥させる必要があります。このアプローチにより、HUVECをカバーガラスの小さな領域に集中させることができ、それにより、細胞のコンフルエント単層の迅速な形成が促進されます。

カバーガラスを摂氏37度で3〜4時間インキュベートして、細胞がコンフルエント単層に付着するのを待ちます。次に、スライドを完全な内皮基礎培地で2回すすぎ、付着していない細胞を取り除きます。HUVEC単層に創傷エッジを作成するには、鉗子を使用してカバーガラスを所定の位置に優しく保持し、細胞単層の中心を横切ってカミソリの刃をしっかりと引きずります。

細胞を摂氏37度のインキュベーターで3時間回復させます。次に、以前と同様にイメージング用のカバースリップを組み立てて取り付けます。10X0.45開口数位相対物レンズと0.52開口長作動距離コンデンサーを使用して、10分間隔で12時間位相コントラスト画像を取得します。

画像取得ソフトウェアプログラムのND取得パネルを使用します。最後に、添付のドキュメントで説明されているように、HUVEC の分岐と移行を定量化します。HUVECをトランスフェクションして、微小管末端結合タンパク質であるmApple標識EB3を発現させ、タイムラプス画像を撮影しました。

EB3の生画像を左に示します。plusTipTrackerソフトウェアで追跡した青色EB3彗星を右に示します。各フレーム内で検出された彗星は、フレーム間の位置の変化に基づいてリンクされ、ここに示すようにEB3トラックと視覚的なEB3トラックオーバーレイが生成されました。

低速で短寿命の微小管の成長を赤で示し、低速で長寿命の微小管の成長を緑で示し、高速で短寿命の微小管の成長を黄色で示し、高速で長寿命の微小管の成長を青色で示しています。内皮細胞の分枝を解析するために、DICと個々のHUVECの蛍光画像を60倍の倍率で撮影しました。蛍光画像のセルエッジの周囲に境界を手作業で描きました。

次に、枝の原点は、枝を横切って、枝の両側の最大曲率角を通る直線を引くことによって定義されました。幅よりも長く、長さが最小10ミクロンの枝をカウントし、枝の起点から枝の遠位端までの長さを測定しました。内皮細胞の創傷端遊走を評価するために、HUVECを高密度で培養し、このビデオで説明されているように、創傷後に生細胞のタイムラプスイメージングを行いました。

ここに示すように、創傷端内皮細胞は創傷領域に方向的に移動しました。この動きは、核小体を信認マーカーとして使用して解析し、移動速度、持続性、および距離を追跡しました。このビデオを見れば、細胞形状や細胞骨格ダイナミクスイメージング実験、または創傷端細胞遊走研究のためのHUVECの培養、トランスフェクション、調製の方法について十分に理解できるはずです。

この手順に続いて、ポリアクリルアミドやコラーゲン結合などの他の方法を実行して、修飾されたECMの細胞関与に関連する追加の質問に答えることができます。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。