リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

本手順の目的は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を培養し、生細胞タイムラプスイメージングを用いて細胞骨格のダイナミクスと細胞遊走を解析することです。本ビデオで解説する手法は、細胞生物学、分子生物学、およびメカノバイオロジーの分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。例えば、本プロトコルは、異なるECMとの結合によって細胞の形態や運動性がどのように調節されるかを特定するために利用できます。

サンプル調製の手順は実行が困難であるため、視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。プロセス全体を通して、細胞をタイミングよく精密に扱うことが求められるためです。本手法は血管新生中の血管内皮細胞の遊走に関する知見を提供できますが、実質的にあらゆる接着細胞モデルシステムの顕微鏡観察にも適用可能です。

ピンセットを使用して、100% ethanolの保存瓶からカバーガラスを取り出し、ブンゼンバーナーの炎に通して滅菌させます。その後、35 millimeterのシャーレに配置します。サンプルごとに1枚のカバーガラスを用意してください。

1.5 mLマイクロ遠心チューブに、1 mg/mLのフィブロネクチンストック溶液10 µLとPBS 990 µLを加えます。次に、この溶液を各カバーガラスに250 µLずつピペットで滴下します。溶液を均一に広げ、表面全体を覆います。

カバーガラスを37°Cで最低3時間インキュベートします。使用前に、各カバーガラスを2mLのPBSで3回洗浄します。血球計算盤を用いて培養したHUVECの数を測定し、非遊走実験ではカバーガラス1枚あたり100,000個、遊走実験ではカバーガラス1枚あたり500,000個の細胞を含む容量をマイクロ遠心チューブに移します。

細胞を1,400 ×gで4分間遠心分離し、ペレット化します。遠心後、テストする各条件について、最大100万個の細胞を100 µLのエレクトロポレーションバッファーで再懸濁し、1 µgのcDNAと混合します。その後、細胞をエレクトロポレーションキュベットに移します。

HUVECエレクトロポレーション用に指定されたプログラムを用いて、細胞とDNAの混合液をトランスフェクトします。次に、500 µLの完全内皮基底培地を加えてトランスフェクトした細胞を回収します。その後、適切な細胞量をフィブロネクチンコートしたカバーガラス上に播種します。

cDNAコンストラクトを発現させるため、細胞を37°Cで3～4時間インキュベートします。イメージングの準備として、2.5 cm × 0.65 cmの両面テープ2片を用い、清潔なガラススライドの上端と下端に沿って水平に固定します。チャンバーを密閉するため、テープとスライドの端との間にわずかな隙間を空けておくことが重要です。

カバーガラスの細胞側を下にして、カバーガラスの両端がテープに乗るように配置します。ピンセットを使用して軽く押し、カバーガラスを固定します。マイクロピペットを用いて、カバーガラスとスライドガラスの間にイメージング用培地を40 µL添加します。

カバーガラスとスライドガラスの間の隙間がイメージング培地で完全に満たされていることを確認してください。必要に応じて、余分な培地をペーパーワイプで拭き取ります。スライドのすべての端を温めたVALAPで封止してください。

ガラスカバースリップを軽く押し、漏れがないか確認します。マウントして密封したカバースリップを、37 °Cに予熱した顕微鏡ステージに設置します。回転ディスク共焦点顕微鏡を用いて、タイムラプス画像シーケンス、青色蛍光タンパク質画像、およびDIC画像を取得します。

付属文書に記載されている通り、微小管のダイナミクスおよび共局在を解析します。細胞遊走アッセイを行うには、エレクトロポレーション工程の後、80 µLの完全内皮基底培地を添加して、トランスフェクションした細胞を回復させます。その後、80 µLのサンプル全量を、乾燥させたフィブロネクチンコートカバーグラスの中央に1滴としてピペッティングします。

液滴を広げないでください。カバーガラスに接触した際に80 µLの液滴が分離するのを防ぐため、カバーガラスを乾燥させる必要があります。この手法により、HUVECをカバーガラスの狭い範囲に濃縮させることができ、細胞のコンフルエントな単層の迅速な形成を促進します。

カバースリップを37°Cで3〜4時間インキュベートし、細胞が密な単層（コンフルエントなモノレイヤー）になるまで接着させます。その後、完全内皮基底培地でスライドを2回洗浄し、接着しなかった細胞を除去します。HUVEC単層に創傷端を作成するため、ピンセットでカバースリップを軽く固定し、カミソリの刃で細胞単層の中央をしっかりと直線的に引き切ります。

細胞を37°Cのインキュベーター内で3時間回復させます。その後、前述と同様にカバーガラスを組み立ててイメージング用にマウントします。10倍、開口数0.45の位相差対物レンズと、開口数0.52の長作動距離コンデンサーを用い、10分間隔で12時間にわたり位相差像を取得します。

画像取得ソフトウェアのND Acquisitionパネルを使用します。最後に、付属資料に記載されている通りにHUVECの分枝と遊走を定量化します。HUVECに微小管末端結合タンパク質であるmApple標識EB3を発現させるためトランスフェクションを行い、タイムラプス画像を撮影しました。

左側にEB3の生画像を示します。右側には、plusTipTrackerソフトウェアによって追跡された青色のEB3コメットを示します。各フレーム内で検出されたコメットを、フレーム間の位置変化に基づいてリンクさせることで、ここに示すようにEB3の軌跡および視覚的なEB3トラックオーバーレイを生成しました。

低速で短寿命の微小管成長を赤色で、低速で長寿命の微小管成長を緑色で、高速で短寿命の微小管成長を黄色で、そして高速で長寿命の微小管成長を青色で示しています。血管内皮細胞の分枝を解析するため、個々のHUVECのDIC像および蛍光像を60倍の倍率で撮影しました。蛍光像において、細胞の辺縁に沿って境界線を手動で描画しました。

その後、分枝を横切り、分枝の両側で曲率が最大となる点を通る直線を描くことで、分枝の起点（origin）を定義した。幅よりも長さが長く、かつ長さが最低10 micronsある分枝をカウントし、分枝の起点から遠位端までの長さを測定した。血管内皮細胞の創傷辺縁への遊走を評価するため、HUVECを高密度で培養し、本ビデオで説明した通り、創傷形成後に生細胞タイムラプスイメージングを行った。

ここに示すように、傷口縁の血管内皮細胞が傷領域に向かって方向性を持って移動しました。この移動は、核小体を基準マーカーとして用いて、移動速度、持続性、および移動距離を追跡することで分析されました。このビデオを視聴することで、細胞形状や細胞骨格ダイナミクスのイメージング実験、あるいは傷口縁の細胞移動研究に向けて、HUVECをどのように培養、トランスフェクションし、準備させるかについて十分に理解できるはずです。

本手順に続き、修飾されたECMへの細胞接着に関するさらなる疑問を解決するために、ポリアクリルアミドまたはコラーゲン結合などの他の手法を実施することができます。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。