Name: リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶ高解像度タイムラプスイメージングによるHUVECの微小管ダイナミクスと細胞遊走の自動解析法。スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いた生細胞イメージングで、血管新生における内皮細胞の細胞骨格動態を詳細に観察・定量化する技術を習得できます。

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plusTipTracker MT解析ソフトウェアを開発するために、これらの研究に用いられる蛍光cDNA構築物の多くの、そしてキャサリンアップルゲートとGaudenz Danuserを提供するための指導や議論のための博士クレアM.ウォーターマン、ミシェル・ベアードとマイク・ダビッドソンに感謝します。この作業は、部分的には、国立心臓肺血液研究所（NHLBI）と国立衛生研究所（NIH）からKAMへの助成金によって、サポートされていました。 （グラント：4K22HL113069）。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

形態と移行実験でのHUVECを使用します。 HUVECを内EB3標識MT成長ダイナミクスの生細胞のイメージングは​​、それらが次にECMシグナリングキューに割り当てることができるように、MTの成長及びHUVECの形態の変化を測定し、評価するために適切で再現可能な細胞培養条件を必要とします。 HUVECを、細胞の形状と運動性を研究するための優れたモデルを表します。彼らは両方の可溶性および物理的なシグナリングの合図に応答して劇的な形態を呈し、蛍光標識cDNAでのトランスフェクションに非常に適している、と彼らは、適切な細胞培養条件65-70を提供する際、血管管の中に自分自身を整理する能力を維持します。などのHUVECのような初代細胞培養物は、細胞が健康であることを保証するために、彼らは実験中に正常に動作することを慎重な取り扱いと細胞継代数の監視を必要とします。例えば、cytoskeleを調べる実験を行いますHUVECをは一般的に15に通路12の周囲に不均一な形態を表示するために始めるとトンおよび/または細胞形態は、HUVECを、第十細胞培養継代を超えた実験のために使用すべきではありません。 細胞密度はまた、HUVECの健康と増殖の重要な調節因子です。調査を分岐HUVEC（上記プロトコル10.1から10.4を参照）は、ECMと相互作用して、分枝状突起を拡張するために、細胞を物理的空間を提供するために、比較的低い細胞密度培養物を使用します。これとは対照的に、（プロトコルの10.5から10.8を参照）創傷縁の移行研究において、HUVECを前に創傷に、単層培養されています。このように、創傷縁HUVECを、比較的非分岐形態を示し、先端の突起を拡張し、それらが創傷に遊走するようにそれらのすぐ隣との細胞間相互作用を示します。 リビングのHUVECにおけるトラッキングMTダイナミクスの注意事項とメリット。 ディスク顕微鏡を回転することに優れたアプローチであります高時間分解能での共焦点画像の鮮明さを必要とする実験的な仮説をテストします。適切なカメラとレーザモジュールと、この顕微鏡法は、低放射蛍光に敏感であり、蛍光顕微鏡の他のタイプと比較して低減退色するのを助けることができます。異なる種々の細胞型において、EB3標識アプローチを使用して、MTの増殖動態の包括的測定値を生成するために必要とされる重要なことに、このアプローチは、高時間分解能イメージング中程度によく適しています。 標識成長MTプラス端のEB3方法は、蛍光標識MTの他の方法に比べて顕著な利点を有するが、それはまた、固有の欠点を有します。例えば、積極的に分解MTの集団と安定、非ダイナミックのMT 71-74の集団の両方を含む、任意の時点で成長していないMT配列の割合があります。 EB3は、MTのこれら2つの集団にラベルを付けないであろうとしたがって、これら2つの集団の貢献は、実験データの分析には含まれません。全体MTのアレイを評価するための代替方法は、MTの全ての集団に組み込まれており、成長縮小、および安定MTの識別を可能にする、蛍光標識チューブリンの発現に焦点を当てています。しかし、全体MT配列を標識微小管組織化中心（MTOC）にセルの中心と隣接する周辺MTアレイの比較的高い密度の細胞の近くにはないMTの端部の画像解析を行う際に不都合を作成周辺75-77。生細胞内の蛍光チューブリンと蛍光EB3とMTの2色同時標識を用いた実験は、チューブリン標識MTの大半はまたEB3標識78であることを、定性的に明らかにしました。さらに、蛍光チューブリンで標識されたMTの自動追跡の効率的な方法がなかったです。これは、そのデータcol​​lec手段蛍光チューブリンを発現する細胞におけるションとMTダイナミクスの測定は、個々のMTの手の追跡、エラーが発生しやすいと面倒なプロセスを必要とします。その結果、EB3標識MTの自動化コンピューター分析は、それが多くの細胞タイプで、実験計画35,79の種々内MT動態実験に適用することができるように、MT動態を測定するための好ましい方法となっています。 HUVEC形態および移行にMT成長ダイナミクスのリンク。 細胞骨格の研究者の観点から、plusTipTracker自動追跡分析の1極めて有用な適応は、全細胞およびMTの成長ダイナミクスの地域変化の両方を測定し、評価する能力です。偏光になるため、細胞のための要件は、指向性細胞遊走に不可欠な前提条件です。このように、偏光シグナルキューが長い方向の細胞遊走のための重要な駆動因子として知られている30,31,51,54,56,80,81 </SUP&gt;。例えば、VEGFのような水溶性のシグナル伝達分子は、アクチン重合および内皮細胞型2,82-87におけるVEGFキューに向かってMTの成長を誘導します。さらに、（例えば、コンプライアンス及び次元mechanosensing用）ECMとの物理的相互作用に応答して、HUVECを局所的にMAPが分岐状突起を伸長内のMTの成長を促進するために調節することにより、それらのMT動態を調節し、これは方向にHUVECの移動を案内しますキュー5,31,88。したがって、細胞外シグナル伝達の合図に応答して、分極が細胞骨格の動態の局所的変化の実験的評価の必要性を強調しています。 （EB3アプローチを使用して）MT成長動態およびHUVEC細胞の遊走の同時生細胞画像化は、MTSは、秒の時間スケール上に成長するので、細胞の形態及び方向移動の変化が時間の時間スケールで発生しながら、行うことが非常に困難です。しかし、両方のプロセスが密接リンケですD。また、第2タイムスケール上で蛍光標識EB3の連続的な、迅速な画像化はEB3信号の光退色をもたらします。 EB3（1〜2分取得シリーズ）30分ごとに成功しているの短いイメージングシリーズを行うことにより、この問題を克服しようとする試みが、唯一EB3の最適な発現を持っていたECの少数で達成することができ、それが有害表示されませんでした繰り返しレーザー照射5への影響。 MT成長ダイナミクスは、細胞の形態と遊走の変化に寄与するかの解釈を可能にする別のアプローチは、関心のplusTipTracker領域（ROI）ツール35（プロトコル6.6を参照）です。全細胞MT成長がMT成長トラックは次いで、抽出し、分析することが可能なユーザ定義の領域に副分割するトラックのこの方法は可能にします。例えば、セルの「非分岐」領域に対する「分岐」の比較は、MTSがより多くのを成長させることを明らかにしました低いより永続的分岐した領域内の非分岐状細胞外周5と比較して。偏創傷縁のHUVECでは、前縁及び後縁のMT成長ダイナミクスの比較はMCAKに誘導されるMTの解体後縁を前縁内で特異的に阻害するが、されていないことを明らかにしました。先頭およびRac1の、および/またはMCAKのリン酸化変異体を発現たHUVECにおけるエッジMT成長ダイナミクスを末尾の地域内の評価はさらに、オーロラキナーゼのRac1の誘導活性化を具体的かつ局所的にHUVECの偏光と方向性のある移動を駆動するために、前縁内MCAKの活性を阻害することが明らかとなりました31。このように、MTの成長のダイナミクスと分枝状突起および/または創傷縁HUVECの前縁内のMT​​成長ダイナミクスの地域評価の自動追跡の組み合わせは、私たちはHUVECの形態および移行にMTの成長のダイナミクスをリンクすることができました。 記載されているプロトコルは、デザイン性ありdはHUVECの文化や実験的調査のため、一般的に簡単で、再現性の高い方法を提供します。それにもかかわらず、プロトコルの詳細の多くは、今度は、実験的な方法論を実施するのエラーや困難のための機会を提供し、複雑で時間がかかります。それは、プロトコルを通じて潜在的な問題に対処しようとしたが、ここではあまり一般的ではないか、そうでなければ方法論のプロトコル内のノートと略記されている潜在的な問題の追加、詳細なトラブルシューティングが提供されます。 ポリアクリルアミド基板（プロトコル2.2）で被覆カバーガラスに関連して、発生する一般的な問題は、カバーガラスを活性化ガラスにポリアクリルアミドを結合する、ポリアクリルアミドを活性化し、その後、ポリアクリルアミドにECMを結合する複雑な性質です。一つの特に困難と潜在的に問題のステップは、ポリAの曝露後のフィブロネクチン/ポリアクリルアミドゲル上のHUVECを培養され、2 mMのスルホ - SANPAHにcrylamideコーティングしたカバースリップ（上記のステップ2.2.2.6）。これは、スルホ - SANPAHが完全にECMの共役以下の実験システムから削除され、これらの基板上でのHUVECの培養の成功に不可欠です。これは、最良のddH 2 Oで洗浄し、一晩振盪機上でのddH 2 O中でカバースリップをインキュベートすることによって達成することができます。ポリアクリルアミドのECM上で培養した細胞は生存する、または生存率が予想よりも小さい場合、フィブロネクチン（ステップ2.2.2.9）への結合体化の後にスルホ - SANPAHの洗濯を増加させ、繰り返されない場合は、潜在的にこの問題を軽減することが推奨されます。 プロトコル3（カバースリップ上のcDNAのトランスフェクションおよびHUVEC文化）に関連して、エレクトロポレーション手順の成功に大きな影響をプラスチックフラスコからそれらを削除するには、両方の細胞のトリプシン処理中に、HUVECの取り扱いである、との結論を以下エレクトロポレーションは（上記、3.3から3.4ステップ）。気にすることが重要です完全にトリプシンでながらたHUVECを監視し、フラスコ（通常は1~2分）の表面に「切り上げ」に細胞に必要な時間を超えません。トリプシンでの過度の時間は、典型的には、細胞は、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ（ステップ3.4）上にプレーティングされるまでに実現した後、基板に取り付けられるように失敗していないHUVEC死の主要な原因です。 エレクトロポレーション緩衝液中で長い時間のために中断したときに同じような重要なのは、HUVECを（最も主要な細胞型は）うまくいきません。ユーザは、エレクトロポレーションを必要とする5つ以上の状態を有する場合、より大きな規模の実験の間、例えば、1つずつ、個々のチューブ（トランスフェクションあたり1管）でペレット化した細胞を維持するために、それらを混合した方がよいです、エレクトロポレーションの前にすぐにエレクトロポレーションバッファーインチこのアプローチは、エレクトロポレーションバッファーと最大化HUVECの生存にインキュベーション時間を最小限に抑えます。さらに、完全培養培地中の即時の救助もCRでありますitical以下のエレクトロポレーション。レスキュー1分の遅延または複数、次のエレクトロポレーションは、ほぼ完全なHUVECの死に至ることができますので、避けるべきです。 関連細胞遊走アッセイ（プロトコル9）、極めて高い密度でHUVECを培養する技術は、フィブロネクチンコーティングしたカバースリップの乾燥を必要とする（プ​​ロトコル3を参照）、従来のHUVEC細胞培養法の（ステップ9.2に記載の）臨界変形に依存しますカバーガラスの非常に小さな領域にHUVECの培養を可能にするためです。カバーガラスが完全に乾燥されていない場合、またはフィブロネクチンとカバーガラスのコーティングの前には（2.1または2.2ステップ）効率的でなかった場合、多くの場合、カバーガラス上に置かれているメディアを含む細胞は、その表面張力を失い、に拡大しますそれにより、カバースリップ上の細胞の密度を減少させるカバースリップの縁、。この潜在的な問題を解決する一つの方法は、その後、カバーガラスからメディアを吸引することであり、5-10分間のバイオセーフティキャビネットの背面に（まだ35ミリメートル皿で）カバースリップを配置。この適応は、皿を乾燥させるのを助けるために、キャビネット内の空気の流れを可能にするように助けることができます。目に見える液体が空気乾燥した後、カバーガラス上に残っている場合、液体スポットを吸引し、再び生物学的安全キャビネットの中5-10追加分間風乾させます。完全にこの潜在的な問題を回避する方法がないことに注意することは重要ですが、それはプロトコルの反復練習の問題のあまりになるん。これは、余分なカバースリップを準備し、道に沿って問題が発生した場合には、すぐに行く余分たHUVECを持つように、（一般的に、または任意のアッセイ）細胞遊走アッセイのためにカバースリップを準備するときようにしても、トラブルシューティングの推奨事項です。 念頭に置いてこれらのトラブルシューティングの考慮事項と、議論のプロトコルおよび将来の細胞生物学研究におけるその意味の有用性を強調することも重要です。 polyacrへの適用イルアミドアプローチは、広範囲であり、（上述の）細胞ECMの関与の二次元の研究だけでなく、三次元の調査5だけでなく、。このアプリケーションは、HUVECを、生理的環境での細胞の形状および遊走を調節する方法の我々の理解を高めることに重要であると研究者らに細胞骨格の変化に調整されているかの形態学的変化の基本的な理解を提供する必要があります。ここで説明するプロトコルは、MTの増殖動態の測定に焦点を当てているが、プロトコルの大部分は、細胞 - ECM相互作用の他の微視的測定可能な態様の任意の数を測定するように適合されるべきであることができます。 MTダイナミクスに関しては、提示されたプロトコルを使用して調べることができ、少なくとも14キネシン89の家族、HUVEC極性と向かう移行に貢献する潜在的な役割を持つ各、すべてのを含め、多数のMAPがあります。 今後の捜査すべきLSO疾患状態正常対に細胞ECMの関与を対象とします。ここで提示HUVECプロト​​コルは少数を示すために、正常な血管恒常的プロセスの調査に、だけでなく、心臓病、網膜症、腫瘍の増殖と転移を含む疾患状態に適用可能です。顕微鏡的研究と従順準拠のコンジュゲートする目に見えて透明のECMおよびポリアクリルアミドの基板は、内皮細胞の血管の血管新生が高い空間分解能と時間分解能で監視することができるような細胞ECMエンゲージメント研究のためにできるようになります。実験的アプローチのこれらのタイプは、すでに重要な内皮細胞形状の違い、極性、遊走、及びこれらのプロセス5,31,90を調節するタンパク質の影響を明らかにするために始めています。今後の取組みは、ECMのコンプライアンスと次元mechanosensingの組み合わせが局所的に標的とし、細胞骨格の動態を調節するタンパク質を制御する働きをすることができる方法を特定することを目指すべきです。

血管新生は、分極方向の特異性と移行、および血液供給を必要とする組織に新しい血管系を形成するために、内皮細胞（EC）を促進する細胞外シグナリングの合図によって誘発されます。血管新生を駆動するために考え要因は、細胞外マトリックス（ECM）からの信号です。物理的な合図に応答して、電気部品は、血管網1,2の形成方向移動を案内する方向特異性を有する新しいブランチを拡張します。 ECの形態および分岐のアーキテクチャは、アクトミオシン収縮3の調節に調整されている方法で、微小管（MT）細胞骨格の局所的な規制によって定義されます。形成するために、ECの枝ためには、ミオシンIIは、局所的にローカライズされた膜の突起部4で、その結果、ダウンレギュレートされなければなりません。同時に、細胞内の同じ場所に、MTの成長のダイナミクスは、分岐エロンを促進するために遅く、持続的なMTの成長で得られた修飾になりますゲーションと安定性5。このコーディネート細胞骨格の調節は電気部品が指向性の移行を容易にするために、それらの形態を分極することができます。 偏細胞形態の開発は、偏MTアセンブリ6が必要です。上皮細胞の移行では、MTが特に細胞7-9の先端でゆっくりと持続的に成長します。ニューロンにおいてながら、軸索や樹状突起の開始および伸長は、MTSがないだけで存在していることが必要ですが、彼 ​​らは、動的に組み立ておよび分解10-15のプロセスを受けていること。このように、MTの成長ダイナミクスの局所的な制御は、細胞の構造を決定したECは、そのECMをナビゲートとして細胞形態の急速な改造を可能にします。 MT成長ダイナミクスは、分子モータータンパク質と非モータータンパク質の家族によって規制されている、微小管結合タンパク質または微小管相互作用タンパク質（以下REFEと呼ばれます）のMAPとRRED。 MAPは、ローカルに典型的には、細胞- ECMインタフェース16,17で開始シグナル伝達カスケードを介して、アクティブまたは不活性化することができます。 MTに結合し、MTの組立・分解の動態を変化させることによって、一度アクティブ、MAPの機能。これにより、局所的に細胞の形状や極性18-20を促進するために、MTのダイナミクスを調節するように機能します。有糸分裂セントロメア関連キネシン（MCAK）はMTの終了やカップルMTの解体21-23へのATP加水分解に特異的に結合するキネシン13家族のMAPです。 MCAKのこの機能的役割は、紡錘体24-28内の重要なだけでなく、相間29,30の間にあることが知られています。間期のEC内では、MCAK媒介MTの分解はRac1の低分子量GTPaseの活性化を誘導し、エッジを創傷に応答して、MCAKのローカライズされたオーロラ誘導リン酸化によって調節されます。このシグナル伝達カスケードの結果はルに向かって偏MTの成長の結果、ECの立ち上がりでMCAKの阻害であります電気部品31の移行の後縁のエッジとMCAKに誘導されるMTの分解をading。 MTの成長動態を測定するための従来の方法は、典型的には、蛍光標識されたチューブリンまたは、より最近では、蛍光標識されたMTエンド結合タンパク質1または3（それぞれEB1またはEB3）のいずれかの手の追跡を使用しています。蛍光チューブリンアプローチは全体MT配列を標識するという利点を有します。有糸分裂細胞型の大部分は相間8,32,33中のMTの半径方向の配列を維持するためしかし、中心体周辺のMTは非常に緻密であり、その結果、蛍光チューブリンとMTの成長および分解を追跡することは、通常、周辺に限られていますセル領域。これらの制限のために、蛍光標識されたEBタンパク質（EB1またはEB3）の利用はMTのダイナミクスを測定するためのより一般的なアプローチとなっています。 EBをのみMTの成長に加えて、両端にラベルを付けているので、彼らは明るい蛍光が来て、（1-3μm）のような小さい表示されますTS、極めて限定されたバックグラウンド蛍光34-37でMT重合の容易に識別可能なマーカーを提供します。 MT配列のサブセットのみのEBラベルがEBアプローチの主要な強さを表しているという事実は、それはまた、1つの重要な制限を強調しているが、その非成長のMTは、EB3アプローチによって標識されていません。それにもかかわらず、測定し、時間をかけてEB3彗星を追跡し、サブセルラー領域内のMTの成長を視覚化する能力は、MTの組織の地域の評価を必要とするアプリケーションのために、このアプローチに最適です。 MTの成長動態を測定するための従来の方法のもう一つの重要な制限は、非常に大きなデータセットとデータ分析に必要な時間でした。この制限は、高時間分解能でのEBの彗星の数百の手の追跡のための必要性に由来します。また、これらの測定は、細胞の統計的に有意な数で行い、また、コントロールとexperimeの様々な環境下で実行される必要がありますNTAL条件。最近では、これらの制約は、生細胞35にタイムラプス顕微鏡を用いて具体的に追跡EB3彗星に向けコンピュータ解析技術によって克服されました。適切に使用される場合、この計算手法は、MTの重合を測定するハイスループット方法を提供することに加えて手追跡に関連付けられた人的ミスの可能性を制限するの両方に役立ちます。 MatLabのベースのソフトウェアパッケージ、plusTipTrackerを使用して、MTダイナミクスの計算分析、蛍光標識されたEB3彗星5,31,35,38を追跡することによって、MTの成長の測定を可能にします。また、plusTipTrackerソフトウェアが成長しているMTのトラック内EB3彗星の消失に基づいて、MTの破局イベント（ 別名解体）の計算を可能にし、興味のあるユーザ定義領域内のMT成長ダイナミクスのサブセルラー（ 別名地域）分析を可能にします。私たちの研究のために、MTの成長ダイナミクスは内比較しました非分岐の領域対、または細胞立ち下がりエッジに対するリードする内分岐鎖状の領域。 plusTipTrackerソフトウェアから出力されたデータは、個々の細胞および細胞下領域のカラーコード化されたトラックオーバーレイを生成するために使用することができます。 ここでは、MTの成長のダイナミクスと形態と方向性のある移動を分岐ECの規制にこのMT分解酵素の寄与を調節するのにMCAKの役割を調査するために使用する方法を説明します。我々のアプローチは、簡単に培養し、プラスミドcDNAの電気穿孔によって誘発される、一過性トランスフェクションに非常に適している初代ヒト細胞株、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、使用していました。私たちは、その後、高解像度を使用し、タンパク質3（EB3）と分裂セントロメア関連キネシン（MCAK）特異的cDNAのバインディングMTエンドでトランスフェクトしたHUVECのタイムラプス蛍光顕微鏡は、MTのダイナミクスへの影響はHUVECをトランスフェクト評価するために構築します。 EB3のPlusTipTrackerベースの計算画像解析MTプラス端はMT成長ダイナミクスの実験操作の効果を測定し、比較するために、タイムラプス画像でMTの成長速度とMT成長寿命を測定することであった標識。この方法論は、MTのダイナミクスの研究とサブセルラー領域内のMTダイナミクスの規制が分岐ECおよび移行の血管形成過程にどのように寄与するかを、ローカライズの同定を可能にします。これらの技術は、蛍光生細胞中で標識し、発現させることができる任意のMAPの調査に適用可能です。

<table><tbody><tr><td>オーロラ A 阻害剤 I</td><td>セレック ケミカルズ</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>2% ビス溶液</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-アミノプロピルトリメチルオキシシラン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% アクリルアミド</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405、488、561、640 nm ハイパワー MLC400 レーザーコンバイナーモジュール</td><td>アジレント・テクノロジー</td>ズ <td>99462</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>抗...マウスIgG免疫沈降ビーズ</td><td>TrueBlot試薬;株式会社ロックランド</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>アンチ&ndash;ウサギIgG免疫沈降ビーズ</td><td>TrueBlot試薬;株式会社ロックランド</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m、DAPI-ETエミッションフィルター</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m エミッションフィルター</td><td>クロマテクノロジー社</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m 蛍光フィルター</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m 蛍光フィルター</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン画分V</td><td>RPI 製品</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>クララ冷却電荷結合デバイス カメラ</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 ロバ 抗ウサギ</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>ダイライト 649 ヤギ アンチラット</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MVシングルクォート供給&成長因子(内容は下記参照)</td><td>ロンザ</td><td>CC-4143</td><td></td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ脳エキス 2.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 IUペン/ ml、10,000 &#181;g 溶連菌感染症/ml)&nbsp;10.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>電子シャッター</td><td>サッター機器</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>EMD ミリポア</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT プロテアーゼ阻害剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP ヤギ抗マウス</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP ヤギ抗ウサギ</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>免疫ブロット PVDF 膜</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>ラノリン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>マグネシウム硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコン TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>電動ステージ</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>取付媒体</td><td>ダコ</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>マウス アンチオーロラ A</td><td>アブカム</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>マウス アンチGAPDH</td><td>アブカム</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗チューブリン (DM1A)</td><td>細胞シグナル技術</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>マニキュア 電子</td><td>顕微鏡 科学</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements ソフトウェア</td><td>ニコン</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオフェクターキットV</td><td>ロンザ</td><td>VACA-1003</td><td>エレクトロポレーションバッファー</td></tr><tr><td>パラフィン</td><td>が含まれていますサーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &#181;g Strep/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>ワセリン</td><td>ダウ コーニング</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>パイプ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウサギ 抗 GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ 抗 &ndash;pT288&ndash;オーロラアブ</td><td>カム</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>ラットアンチ&ndash;&α;-チューブリン</td><td>AbD セロテック</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>水素化ホウ素ナトリウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク&nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 化学発光基板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermoフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

既存の血管系から新しい血管系が形成される生理学的過程は、個々の内皮細胞(EC)内の形態学的変化を引き起こす特定のシグナル伝達イベントを必要とします。これらのプロセスは、創傷治癒などの恒常性維持に不可欠であり、腫瘍の成長と転移を促進するためにも重要です。ECの形態は、アクチンと微小管(MT)のダイナミクスの厳密に制御されたシステムである細胞骨格の組織化によって定義され、血管新生の必須成分であるECの分岐、極性、および方向移動を制御することが知られています。MTダイナミクスを研究するために、高分解能蛍光顕微鏡と蛍光標識されたMTプラスエンドの計算画像解析を組み合わせて、MT成長ダイナミクスとEC分岐形態および方向性移動の制御を調査しました。蛍光標識されたMT末端結合タンパク質3(EB3)および有糸分裂セントロメア関連キネシン(MCAK)特異的cDNAコンストラクトによるトランスフェクション後に、生きたヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)のタイムラプスイメージングを行い、MTダイナミクスへの影響を評価しました。PlusTipTrackerソフトウェアを使用して、EB3で標識されたMTと末端を追跡し、タイムラプス画像でMTの成長速度とMTの成長寿命を測定しました。この方法論により、MTダイナミクスの研究と、細胞内領域内のMTダイナミクスの局在化制御がECの分岐と移動の血管新生プロセスにどのように寄与するかの特定が可能になります。

ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)培養のためのプロトコール、蛍光標識された微小管増殖マーカーの一過性トランスフェクション、生細胞イメージング、および間期微小管成長ダイナミクスの自動分析が詳細に説明されています。

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

本手順の目的は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を培養し、生細胞タイムラプスイメージングを用いて細胞骨格のダイナミクスと細胞遊走を解析することです。本ビデオで解説する手法は、細胞生物学、分子生物学、およびメカノバイオロジーの分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。例えば、本プロトコルは、異なるECMとの結合によって細胞の形態や運動性がどのように調節されるかを特定するために利用できます。サンプル調製の手順は実行が困難であるため、視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。プロセス全体を通して、細胞をタイミングよく精密に扱うことが求められるためです。本手法は血管新生中の血管内皮細胞の遊走に関する知見を提供できますが、実質的にあらゆる接着細胞モデルシステムの顕微鏡観察にも適用可能です。ピンセットを使用して、100% ethanolの保存瓶からカバーガラスを取り出し、ブンゼンバーナーの炎に通して滅菌させます。その後、35 millimeterのシャーレに配置します。サンプルごとに1枚のカバーガラスを用意してください。1.5 mLマイクロ遠心チューブに、1 mg/mLのフィブロネクチンストック溶液10 µLとPBS 990 µLを加えます。次に、この溶液を各カバーガラスに250 µLずつピペットで滴下します。溶液を均一に広げ、表面全体を覆います。カバーガラスを37°Cで最低3時間インキュベートします。使用前に、各カバーガラスを2mLのPBSで3回洗浄します。血球計算盤を用いて培養したHUVECの数を測定し、非遊走実験ではカバーガラス1枚あたり100,000個、遊走実験ではカバーガラス1枚あたり500,000個の細胞を含む容量をマイクロ遠心チューブに移します。細胞を1,400 ×gで4分間遠心分離し、ペレット化します。遠心後、テストする各条件について、最大100万個の細胞を100 µLのエレクトロポレーションバッファーで再懸濁し、1 µgのcDNAと混合します。その後、細胞をエレクトロポレーションキュベットに移します。HUVECエレクトロポレーション用に指定されたプログラムを用いて、細胞とDNAの混合液をトランスフェクトします。次に、500 µLの完全内皮基底培地を加えてトランスフェクトした細胞を回収します。その後、適切な細胞量をフィブロネクチンコートしたカバーガラス上に播種します。cDNAコンストラクトを発現させるため、細胞を37°Cで3～4時間インキュベートします。イメージングの準備として、2.5 cm × 0.65 cmの両面テープ2片を用い、清潔なガラススライドの上端と下端に沿って水平に固定します。チャンバーを密閉するため、テープとスライドの端との間にわずかな隙間を空けておくことが重要です。カバーガラスの細胞側を下にして、カバーガラスの両端がテープに乗るように配置します。ピンセットを使用して軽く押し、カバーガラスを固定します。マイクロピペットを用いて、カバーガラスとスライドガラスの間にイメージング用培地を40 µL添加します。カバーガラスとスライドガラスの間の隙間がイメージング培地で完全に満たされていることを確認してください。必要に応じて、余分な培地をペーパーワイプで拭き取ります。スライドのすべての端を温めたVALAPで封止してください。ガラスカバースリップを軽く押し、漏れがないか確認します。マウントして密封したカバースリップを、37 °Cに予熱した顕微鏡ステージに設置します。回転ディスク共焦点顕微鏡を用いて、タイムラプス画像シーケンス、青色蛍光タンパク質画像、およびDIC画像を取得します。付属文書に記載されている通り、微小管のダイナミクスおよび共局在を解析します。細胞遊走アッセイを行うには、エレクトロポレーション工程の後、80 µLの完全内皮基底培地を添加して、トランスフェクションした細胞を回復させます。その後、80 µLのサンプル全量を、乾燥させたフィブロネクチンコートカバーグラスの中央に1滴としてピペッティングします。液滴を広げないでください。カバーガラスに接触した際に80 µLの液滴が分離するのを防ぐため、カバーガラスを乾燥させる必要があります。この手法により、HUVECをカバーガラスの狭い範囲に濃縮させることができ、細胞のコンフルエントな単層の迅速な形成を促進します。カバースリップを37°Cで3〜4時間インキュベートし、細胞が密な単層（コンフルエントなモノレイヤー）になるまで接着させます。その後、完全内皮基底培地でスライドを2回洗浄し、接着しなかった細胞を除去します。HUVEC単層に創傷端を作成するため、ピンセットでカバースリップを軽く固定し、カミソリの刃で細胞単層の中央をしっかりと直線的に引き切ります。細胞を37°Cのインキュベーター内で3時間回復させます。その後、前述と同様にカバーガラスを組み立ててイメージング用にマウントします。10倍、開口数0.45の位相差対物レンズと、開口数0.52の長作動距離コンデンサーを用い、10分間隔で12時間にわたり位相差像を取得します。画像取得ソフトウェアのND Acquisitionパネルを使用します。最後に、付属資料に記載されている通りにHUVECの分枝と遊走を定量化します。HUVECに微小管末端結合タンパク質であるmApple標識EB3を発現させるためトランスフェクションを行い、タイムラプス画像を撮影しました。左側にEB3の生画像を示します。右側には、plusTipTrackerソフトウェアによって追跡された青色のEB3コメットを示します。各フレーム内で検出されたコメットを、フレーム間の位置変化に基づいてリンクさせることで、ここに示すようにEB3の軌跡および視覚的なEB3トラックオーバーレイを生成しました。低速で短寿命の微小管成長を赤色で、低速で長寿命の微小管成長を緑色で、高速で短寿命の微小管成長を黄色で、そして高速で長寿命の微小管成長を青色で示しています。血管内皮細胞の分枝を解析するため、個々のHUVECのDIC像および蛍光像を60倍の倍率で撮影しました。蛍光像において、細胞の辺縁に沿って境界線を手動で描画しました。その後、分枝を横切り、分枝の両側で曲率が最大となる点を通る直線を描くことで、分枝の起点（origin）を定義した。幅よりも長さが長く、かつ長さが最低10 micronsある分枝をカウントし、分枝の起点から遠位端までの長さを測定した。血管内皮細胞の創傷辺縁への遊走を評価するため、HUVECを高密度で培養し、本ビデオで説明した通り、創傷形成後に生細胞タイムラプスイメージングを行った。ここに示すように、傷口縁の血管内皮細胞が傷領域に向かって方向性を持って移動しました。この移動は、核小体を基準マーカーとして用いて、移動速度、持続性、および移動距離を追跡することで分析されました。このビデオを視聴することで、細胞形状や細胞骨格ダイナミクスのイメージング実験、あるいは傷口縁の細胞移動研究に向けて、HUVECをどのように培養、トランスフェクションし、準備させるかについて十分に理解できるはずです。本手順に続き、修飾されたECMへの細胞接着に関するさらなる疑問を解決するために、ポリアクリルアミドまたはコラーゲン結合などの他の手法を実施することができます。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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生物学

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学ぶ高解像度タイムラプスイメージングによるHUVECの微小管ダイナミクスと細胞遊走の自動解析法。スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いた生細胞イメージングで、血管新生における内皮細胞の細胞骨格動態を詳細に観察・定量化する技術を習得できます。

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

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