マウスC1498細胞株およびその関連白血病マウスモデルを特徴付けるための詳細なプロトコル

この手順の全体的な目標は、マウスC1498細胞と、マウスへの静脈注射後にそれらが誘発する急性白血病を特徴づけることです。この手順の主な利点は、C1498細胞注射後に誘発されるマウス骨髄単球性白血病がヒト疾患の多くの特徴を示すことです。この動物モデルは、白血病の発症や免疫不全につながるメカニズムは何かなど、血液学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この動物モデルの意味は、新しい化学療法剤や免疫剤の試験を容易にするため、白血病の治療にまで及びます。まず、生後5〜6週齢の雌のコンジェニックC57ブラック6マウスを滅菌層流フードに移します。次に、動物を拘束具に入れます。

次に、100マイクロリットルの細胞が入った29ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器をロードします。遠位端の尾をつかみ、70%エタノールを染み込ませたガーゼで尾の皮膚を消毒します。側尾静脈に1〜6個目の細胞を1回10

すべての細胞が送達されたら、針を取り外し、滅菌ガーゼで注射の様子で穏やかな圧力をかけます。その後、次の数週間は慎重に監視しながら動物をケージに戻します。17〜19日後、麻酔をかけた白血病動物の眼の内側眼瞼に毛細血管を挿入します。

100〜200マイクロリットルの血液がオリブタル洞から毛細管に引き出されます。チューブを取り外し、滅菌ガーゼスポンジを目に優しく塗布して出血を抑えます。次に、血液をEDTAチューブに移し、単核細胞が分離されるまでチューブを氷上に保存します。

血液単核細胞を単離するには、まず、最終容量500マイクロリットルまで1ミリモルEDTAを補充したPBSを追加します。次に、サンプルを微量遠心チューブに移します。次に、30ゲージの針が付いた1ミリリットルの注射器を使用して、500マイクロリットルの分離液を血液の下に慎重に重ねます。

遠心分離によって細胞を分離し、ピペットを使用して不透明な白い単核細胞層を新しい微量遠心チューブに移します。次に、免疫細胞を1ミリリットルのPBSで洗浄します。それらを遠心分離し、ペレットを600マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁して染色し、フローサイトメトリーで分析します。

骨髄を分離するには、マウスをプラスチックボードの上に仰向けに置き、動物の手足を固定します。動物を70%エタノールで消毒します。次に、関節の上の大腿骨の上部にある各脚を切り、脛骨をそっと引っ張って大腿骨から切り離します。

鉗子とハサミを使用して骨から皮膚と筋肉を取り除き、骨を氷の上のシャーレに移します。はさみを使って四肢を取り除きます。次に、5ミリリットルの冷たいPBSが入った10ミリリットルの注射器に取り付けられた26ゲージの針を一度に1つの骨の端に挿入し、骨の骨髄を皿に洗い流します。

細胞懸濁液を針先に数回通し、骨髄細胞を破壊します。次に、新しい70ミクロンフィルターで細胞を50ミリリットルの円錐管にろ過し、単一細胞懸濁液を得ます。細胞を遠心分離し、ペレットを2ミリリットルの溶解緩衝液に再懸濁します。

すぐにチューブに最大50ミリリットルの冷たいPBSを入れ、細胞を遠心分離します。次いで、骨髄ペレットを1ミリリットルあたり10〜6細胞ずつ冷FACS緩衝液中に1回で再懸濁する。骨髄細胞を染色するために最初に準備するには、スライドをフィルターカードがあらかじめ取り付けられている使い捨てチャンバーに入れ、チャンバーを細胞遠心分離機に入れます。

各フィルターカードチャンバーに100マイクロリットルのFACSバッファーを追加し、スライドを短時間遠心分離します。スピンの終わりに、各チャンバーに100マイクロリットルの細胞を加え、細胞を遠心分離します。次に、スライドをチャンバーから慎重に取り外して、空気乾燥させます。

骨髄細胞を染色するために、スライドをMay-Grunwald溶液が入ったコプリンジャーに5分間浸します。次に、スライドをpH 6.8の緩衝液の瓶に1分間移します。次に、スライドをGiemsa R溶液に10分間移します。

その後、pH中性水で10秒間洗浄します。洗浄後、スライドを自然乾燥させ、各サンプルに1滴の封入剤を塗布します。次に、カバーガラスの一方の端をスライドに置き、カバーガラスをセル上に慎重に下げ、静かに押して気泡を取り除きます。

対照動物と比較して、C1498細胞を注入した動物は、細胞の芽球のような外観によって観察されるように、骨髄にC1498細胞の大規模な浸潤を示します。C1498細胞に浸潤する骨髄は、急性骨髄単球性白血病に特徴的な、単芽球性細胞と骨髄芽球性細胞をそれぞれ示す単球性および顆粒球性の表現型を示します。C1498を注射したマウスの血液サンプル中の単核細胞頻度のフローサイトメトリー解析では、全白血球集団の約4分の1が白血病細胞で構成されていることが示されています。

Tリンパ球とBリンパ球の頻度は、対照動物とC1498注射動物の間で類似しています。しかし、単球の頻度は、急性骨髄単球性白血病の特徴であるC1498注射マウスでより高いレベルで観察されます。細胞化学およびMay-Grunwald Gimsaの手順を実行する際には、適切なpH値、温度、およびインキュベーション時間を維持することを覚えておくことが重要です。

このビデオを見た後、急性骨髄単球性白血病の特徴付け方法についてよく理解しているはずです。その開発後、この技術は、血液学の分野の研究者が他の動物モデルにおける自然発生的および誘発性急性白血病の性質を探求する道を開きました。