Name: マウスC1498細胞株およびその関連白血病マウスモデルを特徴付けるための詳細なプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学ぶマウスC1498細胞株と急性骨髄性単球性白血病の特徴付け法。流式細胞計測と細胞化学染色を用いて、骨髄浸潤や単球頻度の変化を解析し、ヒト疾患に類似した病態メカニズムと治療法の検討に活用する。

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著者は、この作業を支援してくださった「Ligue Nationale contre le Cancer」(Comité du Septentrion)、SIRIC ONCOLille(Grant INCa-DGOS-INSERM 6041)、およびInstitut pour la Recherche sur le Cancer de Lille(IRCL)に感謝したいと思います。彼らは、デルフィーヌ・タイリューと動物施設のスタッフに、ネズミを収容し、彼らの福祉を維持してくれたことに感謝しています。また、Raphaëlle Caillerez氏とNathalie Jouy氏には、顕微鏡検査とフローサイトメトリーにおけるそれぞれの協力に感謝します。

<ol><li>Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, Ø, Selheim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present+and+future+subclassification+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 17 (1), 6-19 (2016).</li>
<li>Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+characteristics+of+free+C1498+%28granulocytic+leukemia%29+tumor+cells+in+the+peritoneal+fluid+and+the+blood+of+C57+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice.</a> Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).</li>
<li>Tanaka, K. K., Roberts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+studies+of+E.L.4+lymphoma+and+C+Leukemia+in+susceptible+%28C57BL%29+and+resistant+%28B10.D2%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Biological studies of E.L.4 lymphoma and C Leukemia in susceptible (C57BL) and resistant (B10.D2) mice.</a> Cancer Res. 24 (1498), 1785-1797 (1964).</li>
<li>Law, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+influence+affecting+growth+of+transplantable+leukemias+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of an influence affecting growth of transplantable leukemias in mice.</a> Cancer Res. 4, 257-260 (1944).</li>
<li>Graham, J. D., McMahon Welch, C., Patchen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+an+implanted+murine+myelogenous+leukemia+C1498%5BTitle%5D)+AND+%22Ohio+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies of an implanted murine myelogenous leukemia C1498.</a> Ohio J. Sci. 75 (4), 202-208 (1975).</li>
<li>Boyer, M. W., Orchard, P. J., Gorden, K. B., Anderson, P. M., Mclvor, R. S., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+on+intercellular+adhesion+molecule+recognition+and+local+interleukin-2+provision+in+generation+of+an+in+vivo+CD8%2B+T-cell+immune+response+to+murine+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dependency on intercellular adhesion molecule recognition and local interleukin-2 provision in generation of an in vivo CD8+ T-cell immune response to murine myeloid leukemia.</a> Blood. 85 (9), 2498-2506 (1995).</li>
<li>Labelle, J. L., Truitt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+NKT+cell+tumor+previously+described+as+an+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine NKT cell tumor previously described as an acute myelogenous leukemia.</a> Leuk. Lymphoma. 43 (8), 1637-1644 (2002).</li>
<li>Bradner, W. T., Pindell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukemia+as+a+screen+for+cancer+chemotherapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukemia as a screen for cancer chemotherapeutic agents.</a> Cancer Res. 26 (4), Pt 2 375-390 (1966).</li>
<li>Lin, J. M., Li, B., Rimmer, E., VanRoey, M., Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+anti-tumor+efficacy+of+a+GM-CSF-secreting+tumor+cell+immunotherapy+in+preclinical+models+by+cytosine+arabinoside%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the anti-tumor efficacy of a GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy in preclinical models by cytosine arabinoside.</a> Exp. Hematol. 36 (3), 319-329 (2008).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobinson%2C+JP+%22Handbook+of+Flow+Cytometry+Methods%22">Handbook of Flow Cytometry Methods</a>. , Wiley-Liss, Inc. New York, NY. (1993).</li>
<li>Xu, Y., McKenna, R. W., Wilson, K. S., Karandikar, N. J., Schultz, R. A., Kroft, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+identification+of+acute+myeloid+leukemia+with+monocytic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic identification of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation.</a> Leukemia. 20 (7), 1321-1324 (2006).</li>
<li>Hassan, K., Qureshi, M., Shafi, S., Ikram, N., Akhtar, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia-FAB+classification+and+its+correlation+with+clinico-haematological+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pak.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia-FAB classification and its correlation with clinico-haematological features.</a> J. Pak. Med. Assoc. 43 (10), 200-203 (1993).</li>
<li>Quesenberry, P. J., Rappeport, J. M., Fountebouni, A., Sullivan, R., Zuckerman, K., Ryan, M. Inhibition of normal murine hematopoiesis by leukemic cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuesenberry%2C+PJ+%22N.Engl.J.+Med%22">N.Engl.J. Med</a>. 299 (2), 71-75 (1978).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181 (8), 5791-5802 (2008).</li>
<li>Loder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+development+in+the+spleen+takes+place+in+discrete+steps+and+is+determined+by+the+quality+of+B+cell+receptor-derived+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals.</a> J. Exp. Med. 190 (1), 75-89 (1999).</li>
<li>Robbins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extramedullary+hematopoiesis+generates+Ly-6C%28high%29+monocytes+that+infiltrate+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions.</a> Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

以前の研究では、C1498細胞株は、急性顆粒球5、骨髄6またはNKT 7細胞白血病のインデューサーとして記載されました。しかし、文献で実証データが存在しないか、または不完全のいずれかでした。ここに提示プロトコルは、培養されたC1498細胞を特徴付けるために、それらが注入された後にマウスにおいて誘導される白血病の性質を決定するために、フローサイトメトリー、免疫蛍光、MGG染色および細胞化学的アッセイなどの様々な技術を使用します。 我々は免疫染色した後にインビトロで培養C1498細胞の表現型およびフローサイトメトリー分析時に行われたこれらの細胞は、以前に文献6,7に記載されているいくつかの細胞表面造血マーカーを発現しているため、我々はいくつかの制限を観察しました。我々の結果と一致して、ラブレらは 、フローcytometを使用C1498細胞に成熟したTCRの細胞表面発現を観察しませんでしたRY染色。それらはCD3εとTCRVβ8.2のmRNA 7を検出した後、しかし、それらは、NKT細胞株であるためにそれらを検討しました。我々はまた、細胞（&gt; 70％）のほとんどでTCRVβ鎖およびCD3ε分子の細胞内発現を観察したが、Macの-3分子の同時細胞内発現もあったので、それらの造血系統を決定することができませんでした。 ミエロペルオキシダーゼ、MGG染色および細胞化学を用いた機能性エステラーゼを分析するためのアセスメントは、C1498細胞株は骨髄起源を持っていたし、芽球と骨髄芽球から構成されていたことを実証しました。これらの結果は、フローサイトメトリー染色分析で得られたのMac-3 +細胞の割合と一致しました。定量的ではないものの、これらの手順を実行するためのキーの実験を表します。確かに、彼らは、これまでのところ、ないまたはfを表現する造血細胞の系譜と分化ステージを特徴付けるための最良の既存の方法のままEW特定の表現型マーカー。 染色フローサイトメトリーは、C1498細胞を静脈内注射した後にコンジェニックマウスにおける急性白血病の開発を実証するために役に立ちました。末梢血および様々な臓器に浸潤CD45.2 + C1498細胞を単離し、それらの周波数が決定されました。定量化はまた、免疫表現後固有髄質および脾細胞を分析するために行きました。彼らはいくつかの造血マーカーを発現したとして、C1498細胞の表現型は臓器で調べたときの制限事項が発生した（そのうちのほんの数は、B220 +でした）。観察された急性白血病の性質を定義するには、メイグリュンワルドギムザ染色し、単球及び顆粒球エステラーゼの活性の分析は、骨髄を用いて行きました。結果は、C1498細胞は骨髄単球性白血病の発症を明らかにし、彼らの骨髄芽球と単芽の形態および機能を維持したことを示しました。 <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt;細胞化学反応およびMGG染色を行う際のpHのエラーは結果の誤った解釈につながることができますので、このプロトコルに記載の重要なステップのための配慮では、特に注意がpHに与えられるべきです。顆粒球およびリンパ球はまた、より高いpH値で、このテストのために陽性に染色することができますので、例えば、α-ナフチル酪酸エステラーゼ活性は6.0のpHで単球細胞に特異的です。細胞を固定すると、MGG染色を行う前に、推奨、我々はC1498細胞を用いたエステラーゼ細胞化学反応を行う場合にのみCAFの固定は満足な結果を提供したことを示したされていません。フローサイトメトリーによりCD115分子とその検出の発現を維持するために、試料（ 例えば 、血液、骨髄、脾臓細胞）の全ては、手順の間、氷上に維持されるべきです。染色は、フローサイトメトリーおよび/または免疫蛍光実験を、抗体の参照、それらの記憶再において観察されていない場合表彰及びその希釈物をチェックする必要があります。材料/機器テーブルで指定された参考文献は、フローサイトメトリーまたは免疫蛍光アプリケーションに設定されています。一次/二次抗体またはその共役フルオロフォアは不適当なストレージにそれらの活性を失っている可能性がある（ 例えば 、光または熱への曝露）、不適切な希釈、広範な凍結/解凍または汚染されたバッファを使用。それらが正常に機能していることを確認するために、ポジティブコントロールを実行します。目的のタンパク質を発現することが知られているマウスの骨髄または脾臓由来の細胞を使用します。高いバックグラウンドや非特異的な染色を避けるために、細胞が適切に洗浄し、（免疫蛍光のための）高湿度に保ち、指示通り抗体が希釈されていることをされていることを確認してください。正確に試料中のバックグラウンドレベルを決定するために、アイソタイプコントロール抗体と一次抗体のための同じ濃度および希釈を使用してください。エステラーゼ細胞化学実験のために、試薬は、精製マウス脾臓顆粒球（Ly6G +）および単球（CD115 +）細胞を含む陽性および陰性対照スライドを使用して試験することができます。 この研究で記載された手順は、C1498細胞の注射後のマウスにおいて観察された白血病の特徴の多くは、ヒト急性骨髄単球性白血病11,12と共通の特徴を共有していることを示しました。侵入した白血病細胞（前駆細胞および前駆体）は、成熟および未成熟骨髄造血細胞の減少をもたらしました。単球細胞であるとしてC1498細胞は、末梢血中の高頻度（&gt; 20％）で存在します。肝腫および脾腫は、白血病細胞の浸潤から生じることが観察された、およびBリンパ球および骨髄細胞の大幅な増加も脾腫を伴うことが観察されました。血小板数は、血液分析器を用いて推定したときに血小板減少も観察されました。 それはショーでしたnは、 試験管内実験で使用して、C1498細胞は、可溶性因子13を分泌することにより、通常のマウスの造血を阻害すること。いくつかの腫瘍のマウスモデルにおいて、（単球および顆粒球細胞を含む）、未熟骨髄細胞はまた、抗腫瘍特異的T細胞活性化および増殖14を阻害する脾臓を骨髄から移行することが示されています。このように、骨髄中で観察された造血細胞の減少は、造血および/またはそれらの移民からの欠乏のいずれかから生じた可能性があります。この後者のメカニズムは、末梢血中の単球の存在または脾臓の拡大骨髄性画分の観察を説明することができます。これらの細胞は、改善された脾臓造血由来していることができることも考えられます。実際に、定常状態の条件下で、脾臓B細胞のいくつかのサブセットは、成熟Bリンパ球15の前駆体として同定されました。また、炎症性の条件の下で、のmedullary幹および前駆細胞は、成熟単球16の産生を誘導するために脾臓に移転することが示されています。このプロトコルは、私たちは、白血病の発症に関与しているメカニズムに関する結論を引き出すことはできません。また、付加的な機能だけでなく、分子アッセイは、そうするために採用されるべきです。しかし、これらのデータは、急性骨髄性白血病の臨床的特徴についての詳細な情報が含まれており、研究者が新たな治療薬の効果を評価し、理解するのに役立ちます。

急性骨髄性白血病（AML）は、成熟の異なる段階でブロックされた造血骨髄細胞の制御されない増殖を特徴とします。この調節不全は、顆粒球、単球、赤血球またはmegaryocytic分化経路1に影響を与えることができます。 AML細胞は、血小板減少、リンパ球減少症および貧血になる造血障害につながる、骨髄に蓄積します。白血病細胞は、血液および非リンパ系器官に侵入します。 C1498マウスモデルは、文献には、血液中に侵入を記述するがん細胞が1941年に白血病10ヶ月齢のC57BL / 6（H-2 b）の雌性マウスから単離されたので、急性白血病のためのモデルとして何十年も使用されてきました増殖性の高いC1498細胞による、造血器官（ 例えば 、脾臓およびリンパ節）および非造血器官（ 例えば 、肝臓、肺、卵巣、及び腎臓）それらが中を経由して注入した後に感受性マウス2-4にtravenous、皮下または腹腔内経路。しかし、このマウスモデルは、2,5顆粒球または骨髄のいずれか6白血病を誘発することが報告されました。より最近では、2002年に発表された研究は、マウスNKT細胞白血病7などの癌のこのタイプを記載しました。このように、文献はこのC1498細胞株の性質と、それは、マウスにおいて誘導関連白血病に関する異なります。 70年代 - これらの矛盾は、詳細の欠如および細胞に関する更新公開されている情報と多くの研究は、1950年に行われたため、一般的には白血病疾患が主な原因です。 ここでは、C1498細胞を特徴付けるし、マウスにそれらの静脈内注射によって誘発される白血病疾患の性質を分析する方法を説明するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルの最初のセクションは、 インビトロで培養されたC1498細胞の説明に捧げられています。蛍光抗表面および細胞内の造血マーカーに対して指向体は、フローサイトメトリーを用いてそれらの表現型を決定するために使用しました。ミエロペルオキシダーゼの存在は、免疫蛍光顕微鏡を用いて評価し、その造血系及び分化段階はエステラーゼの活性を評価するために細胞化学を用いて評価し、メイグリュンワルドギムザ染色を行いました。 C1498細胞は、その後マウスに注射し、そして誘導された急性白血病の疾患は、この原稿の第二の部分に記載されています。同様の技術は、周波数および骨髄中の白血病および固有細胞、末梢血、脾臓および非造血器官（肝臓、肺）の表現型を決定するために使用しました。 このプロトコルは、非常に再現性があり、ここで提示されたデータは、研究者が新たな治療戦略の効果を評価するのに役立ちます。この白血病のマウスモデルは、すでに免疫療法に近づく試験するために使用されていますND異なる癌化学療法薬8,9。それらの有効性は、腫瘍負荷と生存率の変化を決定することによって評価しました。このプロトコルは、治療中の白血病および他の造血細胞集団の分布と生存についての追加情報を提供するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>C1498 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB 49</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Ly5.1</td><td>Charles River</td><td>B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl</td><td></td></tr><tr><td>Cells culture reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、Gibco (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン、Gibco&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate, Gibco (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry staining reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse B220 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0452</td><td>クローン RA3-6B2, 最終希釈 1/100</td></tr><tr><td>抗マウス B220 ビオチン (2)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0452</td><td>クローン RA3-6B2, 1/400</td></tr><tr><td>抗マウス CD3 eFluor450 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0032</td><td>クローン 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>抗マウス CD3 PE (2)</td><td>BD biosciences</td><td>555275</td><td>クローン 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>抗マウス CD3 PE-Cy5 (3)</td><td>ebiosciences</td><td>15-0031</td><td>クローン 145-2C11, 1/100</td></tr><tr><td>抗マウスCD4 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0041</td><td>clone GK1.5, 1/500</td></tr><tr><td>anti-mouse CD4 PE (2)</td><td>ebiosciences</td><td>12-0041</td><td>clone GK1.5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse CD8 biotin (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0081</td><td>clone 53-6.7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD8 eFluor450 (2)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0081</td><td>clone 53-6.7, 1/500</td></tr><tr><td>anti-mouse CD11a biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-0111</td><td>クローンM17/4、1/100</td></tr><tr><td>抗マウスCD11b PE&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>12-0112</td><td>クローン M1/70, 1/200</td></tr><tr><td>抗マウス CD16/32 ビオチン</td><td>ebiosciences</td><td>13-0161</td><td>クローン 93, 1/400</td></tr><tr><td>精製抗マウス CD16/32 (FcR ブロッキング)&nbsp;</td><td>BD biosciences</td><td>553141</td><td>クローン 2.4G2</td></tr><tr><td>抗マウス CD18 ビオチン (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0181</td><td>クローン M18/2, 1/100</td></tr><tr><td>抗マウス CD18 FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-0181</td><td>クローン M18/2, 1/50</td></tr><tr><td>抗マウス CD19 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0193</td><td>クローン 1D3, 1/200</td></tr><tr><td>抗マウス CD21/35 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0211</td><td>クローン 8D9, 1/50</td></tr><tr><td>抗マウスCD31 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0311</td>クローン<td>390、1/100</td></tr><tr><td>抗マウスCD34 eFluor660</td><td>ebiosciences</td><td>50-0341</td><td>クローンRAM34、1/20</td></tr><tr><td>抗マウスCD44 PE</td><td>BD biosciences</td><td>553134</td><td>クローンIM7、1/50</td></tr><tr><td>抗マウスCD45.2 FITC&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>11-0454</td><td>クローン 104, 1/100</td></tr><tr><td>抗マウス CD49b/Pan NK PE&</td><td>nbsp;BD biosciences</td><td>553858</td><td>クローン DX5、1/50</td></tr><tr><td>抗マウス CD80 biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-0801</td><td>クローン 16-10A1、1/200</td></tr><tr><td>抗マウス CD86 biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-0862</td><td>クローン GL1、1/200</td></tr><tr><td>抗マウス CD107b (Mac-3) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5989</td><td>クローン M3/84、1/40</td></tr><tr><td>抗マウス CD115 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1152</td><td>クローン AFS98、1/100</td></tr><tr><td>抗マウス CD117 eFluor450</td><td>ebiosciences</td><td>48-1171</td><td>クローン 2B8, 1/100</td></tr><tr><td>抗マウス CD127 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1271</td><td>クローン A7R34, 1/100</td></tr><tr><td>抗マウス CD150 APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-1501</td><td>クローン 9D1, 1/20</td></tr><tr><td>抗マウス CD274 (PD-L1) ビオチン</td><td>ebiosciences</td><td>13-5982</td><td>クローン MIH5, 1/200</td></tr><tr><td>抗マウス Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5981</td><td>クローン D7, 1/100</td></tr><tr><td>抗マウス Ly-6C APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-5932</td><td>クローン HK1.4, 1/200</td></tr><tr><td>抗マウス Ly-6G&nbsp;(Gr-1) ビオチン (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-5931</td><td>クローン RB6-8C5, 1/400</td></tr><tr><td>抗マウス Ly-6G FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-9668</td><td>クローン 1A8, 1/50</td></tr><tr><td>抗マウス MHC クラス I (H-2Db) ビオチン</td><td>ebiosciences</td><td>13-5999</td><td>クローン 28-14-8, 1/50</td></tr><tr><td>抗マウス MHC クラス II (I-A/I-E) PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-5321</td><td>クローン M5/114.15.2, 1/1000</td></tr><tr><td>抗マウス NK1.1 PE</td><td>BD biosciences</td><td>557391</td><td>クローン PK136, 1/50</td></tr><tr><td>anti-mouse TCRVb FITC</td><td>BD biosciences</td><td>553170</td><td>clone H57-597, 1/50</td></tr><tr><td>streptavidin PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-4317</td><td>&nbsp;&nbsp;1/200</td></tr><tr><td>免疫蛍光染色試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗マウスミエロペルオキシダーゼ(重鎖抗体)&nbsp;</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーsc-16129</td><td>1/10(20 & micro;g/ml)</td></tr><tr><td>&nbsp;抗ヤギIgG(テキサスレッド共役抗体)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-076-147</td><td>1/250</td></tr><tr><td>正常ロバ血清</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst solution</td><td>BD Biosciences</td><td>561908</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>封入剤1(フルオロマウント)&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>メルク ミリポア</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>エステラーゼ 細胞化学染色試薬</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナフトール AS-D クロロ酢酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>色素溶液 (Fast Red Violet LB Base solution)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>912</td><td></td></tr><tr><td>pH6.3 バッファー濃縮物 (TRIZMAL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>913</td><td></td></tr><tr><td>亜硝酸ナトリウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS3</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr>ホル<tr><td>ムアルデヒド溶液、37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>&α;-ナフチル酪酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>亜硝酸ナトリウム錠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1809</td><td></td></tr><tr><td>パラロサニリン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1804</td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1808</td><td>1/10</td></tr><tr><td>封入剤 2 (クリアマウント)</td><td>Invitrogen</td><td>00-8010</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml;nwald Giemsa染色試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml;nwald solution</td><td>RAL Diagnostics</td><td>320070</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa R solution&nbsp;</td><td>RAL診断</td><td>320310</td><td>&nbsp;&nbsp;1/20</td></tr><tr><td>pH 6.8 緩衝液</td><td>RAL 診断</td><td>330368</td><td></td></tr><tr><td>その他の材料、試薬、機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ケタミン 1000 (100 mg/ml)</td><td>VIRBAC</td><td>3597132111010</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン セダキシラン (20 mg/ml)</td><td>CEVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホビンアルブミン血清 (BSA) 粉末</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP671</td><td></td></tr><tr><td>PBS溶液(1倍濃縮液)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>サポニン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>超高純度 0.5 M EDTA 溶液、pH 8.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>分離溶液 (Pancoll Mouse)</td><td>PANBIOTECH</td><td>P04-64100</td><td></td></tr><tr><td>溶解バッファー (赤血球溶解バッファー) (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>1/10</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SS267</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液(0.4%)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15250-061</td><td>1/2</td></tr><tr><td>50 mlチューブ(ファルコン)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 & マイクロ;m セルストレーナー(ファルコン)&nbsp;</td><td>コーニング ライフサイエンス</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;チャンバー&フィルターカード (EZ Cytofunnel Shandon)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glasses, 24 x 24mm</td><td>Knittel Glass</td><td>VD1 2424 Y100</td><td></td></tr><tr><td>Slides (Starfrost - ground edges 90)</td><td>Knittel Glass</td><td>VS1137# 077FKB</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454034</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette 150 mm (capillary tube)</td><td>Fisherbrand</td><td>1154-6963</td><td></td></tr><tr><td>26G針</td><td>テルモ</td><td>NN-2613R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;インスリン注射器と針 29 G</td><td>テルモ</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>30 G 針&nbsp;</td><td>ベクトン&Dickinson</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリーチューブ (青)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>2523749</td><td></td></tr><tr><td>撥水ペン (Dakopen)</td><td>Dako</td><td>S200230</td><td></td></tr><tr><td>シャープ滅菌ハサミ&nbsp;</td><td>Nessi-care</td><td>SCI-01</td><td></td></tr><tr><td>滅菌鉗子</td><td>Dominique Dutscher</td><td>956506</td><td></td></tr><tr><td>Thoma cell counting chamber</td><td>VWR</td><td>631-0397</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (Fisherbrand プラスチック)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ (1.5 ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>円筒形拘束具 15 -30 gm</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml シリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS-10L</td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ガーゼスポンジ</td><td>URGO</td><td>501580</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスc1498細胞株およびその関連白血病マウスモデルを特徴付けるための詳細なプロトコル

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

1941これらの注射は、急性白血病の発症をもたらすので、同系またはジェニックマウスへのC1498細胞の静脈内注射が行われています。しかし、この病気の性質は、文献に十分に文書化されていません。ここでは、 インビトロでの C1498細胞を特徴付けるためのin vivoで誘導される白血病の性質を決定するための技術的なプロトコルを提供します。この手順の最初の部分は、造血系および培養C1498細胞の分化段階を決定することに焦点を当てています。これを達成するために、マルチパラメトリックフローサイトメトリー染色は、造血細胞マーカーを検出するために使用されます。免疫蛍光顕微鏡法、細胞化学およびメイグリュンワルドギムザ染色は、その後、それぞれ、ミエロペルオキシダーゼの発現、エステラーゼおよび細胞形態の活性を評価するために行われます。このプロトコルの第2の部分は、 内に誘導される白血病疾患を記述するに専用されています生体内。後者は、血液中の白血病および内在細胞の頻度を決定することによって達成造血器官（ 例えば 、骨髄および脾臓）および非リンパ組織（ 例えば 、肝臓および肺）特異的染色を使用してフローサイトメトリー分析を流すことができます。白血病の性質は、その後、骨髄中の特定のエステラーゼのためのメイ・グリュンワルドギムザ染色および染色を用いて確認されます。ここでは、年齢をマッチさせたC1498-とPBSを注射したマウスでは、このプロトコルを用いて得られた結果を示します。

C1498マウスモデルを特徴づけるために、我々は、2つの主要な手順で進めました。まず、C1498細胞は、 インビトロでの造血系および成熟段階（ 図1）を決定するために特徴づけました。これらの細胞は、その後、コンジェニックマウスに注射し、および誘導白血病疾患の性質は、異なる特徴を決定するために評価した。白血病細胞浸潤、それらの表現型は、骨髄中の造血細胞（成熟及び前駆細胞/前駆体）の定量化、周波数C1498細胞や血液や臓器の腫脹（脾臓、肝臓、および肺）と細胞組成の評価で成熟造血細胞の。 インビトロでの C1498細胞の表現型を特徴づけるために、細胞は、造血前駆体および成熟細胞（ 表1）で表される分子に対する抗体で標識し、その結果を流れcytometを用いて分析しました。RY。 C1498細胞は、Mac-1（CD11bの/ CD18）（約7％）、B220（&gt; 25％）の細胞表面発現について陽性であり、それらはCD3ε、T細胞受容体（TCR）のVβ鎖およびMacの細胞内発現を示し-3（ 図2AおよびB）。細胞は、細胞表面マーカーLy6G、Ly6C、CD115、CD21 / CD35、CD19、CD3、CD4、CD8、NK1.1、および汎NK分子についてとCD4とCD8の細胞内発現について陰性であった（データは示していません） 。次いで、それらを、造血幹細胞および前駆細胞（ 表1）のマーカーを調べました。彼らはまた、CD117、CD34、SCA-1、CD150およびCD16 / 32の細胞表面発現について陰性であった（データは示さず）。これらの白血病細胞は、その後、接着、抗原の提示および共刺激分子の発現を決定するために試験しました。細胞は、表面マーカーLFA-1（のCD11a / CD18）、CD44、CD31（PECAM-1）、及びH-2D bは発現され、CD80、CD86およびCD274（データは示していない）、MHCクラスII陰性でした。 C1498細胞トンherefore骨髄（マック-1、Macの-3）およびリンパ系マーカー（B220、CD3、TCR）の両方を発現していました。 より自分の造血系統を特徴づけるために、ミエロペルオキシダーゼの発現は、免疫蛍光顕微鏡を用いて評価しました。細胞のすべてが彼らの骨髄起源（ 図3A）を検証ミエロペルオキシダーゼ、陽性でした。細胞の大部分はまた、αナフチル酪酸エステラーゼ（ 図3B、左パネル ）について陽性染色され、そのうちのいくつかは、ナフトールAS-Dクロロ酢酸エステラーゼ（黒矢印）（ 図3B、右パネル ）について染色しました。結果は、細胞が単球および顆粒細胞の混合物を含有していることを示しています。メイグリュンワルドギムザ染色を行った後、C1498細胞は、核内で3〜5核小体、核周囲ハロ、多数の空胞及び好塩基性細胞質（ 図3C、高い核-細胞質比でブラスト様形態を表示することが観察されました）。目私たちは、C1498細胞株は、単芽球と骨髄芽球で構成されています。 C1498細胞（CD45.2 +）を、静脈内でCD45.1 +マウスに注射しました。マウスは、細胞を注入した17〜19日後に死亡しました。彼らは病気で死亡前に白血病のタイプを分析することができるように、これらのマウスを屠殺しました。 PBSを注射した対照マウスは、比較のために同一の時点で分析しました。 C1498細胞を注射したマウスは、メイグリュンワルドギムザ染色が（ 図4A）を実施した後の細胞の爆発のような外観によって示されるように、彼らの骨髄にC1498細胞の大量の浸潤を示しました。彼らはまた、急性骨髄性白血病の特徴である単芽球と骨髄芽細胞の蓄積を実証し、その単球及び顆粒球の表現型（ 図4BおよびC）を保存しました。 Dに骨髄造血細胞の数は、白血病細胞の浸潤、CD45.2 + C1498細胞、Bリンパ球、単球及び（前駆細胞、前駆体および成熟した細胞を含む）、顆粒球集団以下低かった免疫蛍光染色およびサイトメトリー分析マルチパラメトリックフローを用いて定量したかどうかをetermine。白血病細胞は、造血細胞（データは示していない）の16〜36％を占めました。他の細胞型は、全ての平均で顆粒球細胞および3倍の平均の4倍、B細胞サブセットの平均で5倍（PBSを注射したマウスよりもC1498を注射したマウスにおいて有意に低い数字に存在しましたCへの単球サブセットのために）（ 図5A）。 白血病と対照マウスの血液試料中の単核細胞の頻度の調査は、それらがリンパ球（ 図6A）の匹敵する割合が、単球の高い周波数を含むことを示しましたそして白血病細胞。これらの特性は、急性骨髄性白血病11（ 図6B）の代表です。 急性骨髄単球性白血病12の他の機能の中に、C1498-注射したマウスは、腫れ肝臓（肝腫）、肺および脾臓（脾腫）（ 図7A）を提示します。 CD45.2 + C1498細胞の様々な周波数は、免疫蛍光染色を使用して、これらの器官において検出され、解析（ 図7B）フローサイトメトリーました。脾腫浸潤した単球の高い数に起因することができ、我々はまた、脾臓集団の割合を推定しました。 Bリンパ球、単球内の細胞および顆粒細胞画分の数は2倍の平均値で、有意に大きかった、2.5倍と3倍、それぞれ、制御脾臓（ 図7C）に比べて白血病脾臓インチ薄ページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig1.jpg" /> 図1. 体外培養C1498細胞株および急性白血病のin vivoでの説明に特徴付けるためのプロトコルのセットアップの概略図。造血系および組織培養C1498細胞の分化段階を最初に決定しました。 C1498細胞は、その後、急性白血病の発達を誘導するためにコンジェニックマウスに注射しました。骨髄、末梢血、脾臓、肝臓および肺組織の単離は、C1498細胞浸潤後の周波数、表現型および形態学的変化を決定しました。 IV：静脈内MGG：メイグリュンワルドギムザ<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html>広告/ 54270 / 54270fig2.jpg &quot;/&gt; in vitroで培養。ドットプロットおよび細胞表面（A）および細胞内（B）のヒストグラム代表的なフローサイトメトリー後のC1498細胞の図2.表現型分析は、造血成熟細胞分化に関連した分子が示されているC1498-表明しました。 C1498細胞は、細胞表面のCD11b、CD18およびB220マーカーまたはそのアイソタイプコントロールに特異的であった蛍光抗体を用いて、培養物から回収し、洗浄し、標識しました。細胞内染色のために、細胞を固定し、透過およびMac-3に対する抗体、CD3ε、およびTCR（T細胞受容体）のVβ鎖またはそのアイソタイプコントロールの共通のエピトープを用いて標識しました。分析は、生きた細胞でゲーティングを使用して実施した。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html> ntent「FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig3.jpg" /> 図3.機能および培養C1498細胞の形態学的特徴付け 。 C1498細胞を培養物から採取し、顕微鏡用スライド上に遠心分離した。（A）ミエロペルオキシダーゼの発現のために染色が免疫蛍光を用いて行った。（B）細胞化学反応は、αナフチル酪酸エステラーゼ（NBE）およびナフトールAS-Dクロロアセテートエステラーゼを分析するために使用しました。 （CAE）C1498細胞における活性。細胞は茶色と赤紫色、大型の細胞質顆粒は、それぞれ、観察された各ラベルについて陽性であると考えられた。C1498細胞の（C）、メイグリュンワルドギムザ（MGG）染色。各染色実験では、顕微鏡対物倍率が示されています。各画像は、3つの別々の実験の代表です。large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig4.jpg" /> 図4.骨髄、PBS中のモルフォロジーおよびC1498-注射したマウス。骨髄細胞を、PBSおよびC1498細胞を注射したマウスから単離し、顕微鏡用スライド上に遠心分離した。（A）メイグリュンワルドギムザ（MGG）染色。（B ）α-ナフチル酪酸エステラーゼ（NBE）および（C）ナフトールAS-Dクロロエステラーゼ（CAE）関数は、細胞化学を用いて評価しました。パネルAでは、バンド（未成熟）またはセグメント（成熟した）好中球は、PBSを注射したマウスよりもC1498-注射したマウスの骨髄中の見えにくいです。パネルBおよびCは、制御骨髄において観察された数字と比較すると、白血病、骨髄中の単球や顆粒球細胞の蓄積があったことを示しています。すべて顕微鏡分析は、100X倍率の対物レンズを用いて行った。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig5.jpg" /> 髄様、PBS中の集団とC1498-注射したマウスの図5.定量分析。骨髄細胞を、PBSおよびC1498細胞を注射したマウスから単離し、細胞計数を行った後に推定しました。異なる細胞集団の頻度は、免疫染色及びサイトメトリー分析生細胞ゲーティング流れ後に測定した。（A）B細胞サブセットは、中のBリンパ球（B）、顆粒球細胞を成熟プロB細胞の段階でCD19 + B220 +細胞を含まCD3 -前駆体Aを含めてのCD11b + Ly6G +系統、ND未熟および成熟顆粒（C）単球サブセットはCD3のように定義された- 。CD115 +および単球ステージを成熟させる前駆内のセルが含まれていました。 n = 7匹のマウス/群、およびデータは、平均±SEMを示すヒストグラムとして提示されています。 ***はp &lt;0.0001 **、P &lt;0.01、PBS処置およびC1498-注射したマウスを比較した対応のないスチューデントt検定。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig6.jpg" /> PBS処置およびC1498-注射したマウスにおける単核細胞サブセットの図6.血液分析 。それぞれ、PBSおよびC1498の中でCD3 +およびB220 +細胞と定義した（A）TおよびBリンパ球の割合、のドットプロット代表的なフローサイトメトリー細胞を注射しました。及びCD115 + Ly6C high細胞-マウス（B）C1498の白血病とコントロールにおける単球細胞の頻度は、（PBS）マウスは、CD115 + Ly6Cを分析することによって決定しました。分析は、生細胞をゲーティングすることによって行いました。白血病マウスおよび対照マウスを比較するために、CD45.2 + C1498細胞が除外された。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig7.jpg" /> 白血病およびコントロールマウスにおける脾臓集団の図7.推定。 （A）は、肝臓、肺および脾臓の代表的な写真は、対照マウスと比較して、白血病マウスの腫脹。脾臓を採取し、秤量し、脾細胞を組織破壊、次のカウントしたした。デフにおける白血病細胞の頻度を表す（B）ヒストグラムを免疫染色は、CD45.2 +細胞について実施し、結果は、フローサイトメトリーを用いて分析した。（C）脾臓Bの試算、顆粒球及び単球細胞数免疫染色した後、分析ゲートフローサイトメトリー後erent器官、生CD19 + B220 +を同定しました、CD3 -のCD11b + Ly6G +、CD3 -のCD11b + Ly6C -およびCD3 -のCD11b + Ly6C high細胞。肺、脾臓および肝臓のために示されたスケールバーは1cmに示しています。 n = 5から8マウス/群、およびデータは、平均±SEMとしてヒストグラムで表現されている*はp &lt;0.05; PBS処置およびC1498-注射したマウスを比較**は p = 0.0033、対応のないスチューデントのt検定。。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig7large.jpg" target="_blank">してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbodY&gt; <tr><td> 細胞型 </td><td> 膜または細胞内分子 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 前駆体および成熟した細胞 </td><td></td></tr><tr><td> NK細胞</td><td> NK1.1 +、パンのNK + </td></tr><tr><td> NKT細胞</td><td> NK1.1 +、汎NK +、TCR Vbeta +（8.2）、CD3 + </td></tr><tr><td> Tリンパ球</td><td> TCR Vbeta +、CD3 +、CD4 +、CD8 + </td></tr><tr><td> B細胞前駆体およびBリンパ球</td><td> B220 +、CD19 +、CD21 / 35 + </td></tr><tr><td>顆粒球前駆体および顆粒球</td><td> Ly6G +、Macの-1 +、CD11bの+ </td></tr><tr><td>単球前駆体及び単球/マクロファージ</td><td> CD11b +、Macの-1 +、Macの-3 +、CD21 / 35 +、CD115 +、Ly6Chi </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 前駆細胞 </td><td></td></tr><tr><td>多能性前駆細胞</td><td> CD117 +のSca-1+ CD34 +（LIN-CD150-） </td></tr><tr><td>リンパプライミング多能前駆細胞</td><td> CD117hi SCA-1hi CD127 +（LIN-） </td></tr><tr><td>リンパ球系共通前駆細胞</td><td> CD117lo SCA-1LO CD127 +（LIN-） </td></tr><tr><td>骨髄系共通前駆細胞</td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34int（LIN-SCA-1-） </td></tr><tr><td>顆粒球 - マクロファージ前駆細胞</td><td> CD16 / 32hi CD117 + CD34hi（LIN-SCA-1-） </td></tr><tr><td>巨核球、赤血球前駆細胞</td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34lo（LIN-SCA-1-） </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 造血幹細胞 </td><td> CD117 + SCA-1 + CD150 +（LIN-CD34-） </td></tr></tbody></table> 表造血細胞系統および分化の1マーカー。 CD：CD分類。林：成熟細胞のマーカー; LO：低発現;こんにちは：高発現; int型：中間式。 NK：ナチュラルキラー細胞; TCR：T細胞受容体。

この原稿は、in vitroおよびその注射後にマウスにおいて誘導される急性白血病に C1498細胞培養物を特徴付けるために使用することができる技術的手順を提供します。表現型および機能的分析は、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、細胞化学およびメイグリュンワルドギムザ染色を使用して実行されます。

マウスC1498細胞株およびその関連白血病マウスモデルを特徴付けるための詳細なプロトコル

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

本手順の目的は、マウスC1498細胞の特性解析、およびマウスへの静脈内投与後に誘導される急性白血病の解析を行うことです。本手順の主な利点は、C1498細胞の投与後に誘導されるマウス骨髄単球性白血病が、ヒトの疾患の多くの特徴を呈することです。この動物モデルは、白血病の発症や免疫不全に至るメカニズムなど、血液学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この動物モデルの意義は、新しい化学療法剤および免疫療法の薬剤の試験を容易にすることから、白血病の治療にまで及びます。まず、5〜6週齢の雌のコンジェニックC57black 6マウスを、滅菌済みのラミナーフローフード内に移動させます。次に、動物を固定器具にセットします。次に、29ゲージの針を装着した1 mLシリンジに、100 µLの細胞懸濁液を充填します。尾の遠位端を固定し、70%エタノールに浸したガーゼで尾の皮膚を消毒します。その後、側尾静脈に1×10⁶個の細胞をゆっくりと注入します。すべての細胞を注入し終えたら、針を抜き、滅菌ガーゼを用いて注入部位を軽く圧迫します。その後、動物をケージに戻し、数週間にわたって注意深く観察します。17〜19日後、麻酔をかけた白血病モデル動物の眼内角にキャピラリーチューブを挿入します。眼窩静脈洞から毛細管チューブに100から200 µLの血液を採取します。チューブを取り出し、滅菌ガーゼスポンジを眼に軽く当てて止血します。その後、血液をEDTAチューブに移し、単核細胞の分離を行うまで氷上で保存します。血液単核細胞を分離するために、まず、1 mM EDTAを添加したPBSを最終容量が500 µLになるまで加えます。次に、サンプルをマイクロ遠心チューブに移します。続いて、30Gの針を装着した1 mLシリンジを用いて、層が混ざらないように注意しながら、血液の下に分離溶液を500 µL慎重に重層させます。遠心分離により細胞を分離し、ピペットを用いて不透明な白色の単核細胞層を新しいマイクロ遠心チューブに移します。次に、免疫細胞を1 mLのPBSで洗浄します。遠心分離後、ペレットを600 µLのFACSバッファーに再懸濁し、染色およびフローサイトメトリーによる解析に供します。骨髄を分離するために、マウスをプラスチックボードの上に仰向けに置き、肢を固定します。70% ethanolで動物を消毒します。次に、関節より上の大腿骨の頂端部で各肢を切断し、脛骨をそっと引っ張って大腿骨から切り離します。ピンセットとハサミを使用して骨から皮膚と筋肉を取り除き、骨を氷上のペトリ皿に移します。ハサミで末端部を除去します。次に、5 mLの冷PBSが入った10 mLシリンジに取り付けた26Gの針を、骨の端に1本ずつ挿入し、骨髄を皿の中に洗い出します。細胞懸濁液を針先に数回通し、骨髄細胞を分散させます。次に、細胞を新しい70 micronフィルターでろ過し、50 milliliterコニカルチューブに回収して単一細胞懸濁液を得ます。細胞を遠心分離し、ペレットを2 milliliterの溶解バッファーで再懸濁します。直ちにチューブに最大 50 milliliters の冷 PBS を満たし、細胞を遠心分離します。次に、骨髄ペレットを冷 FACS バッファーを用いて 1 × 10⁶ cells/milliliter に再懸濁します。染色前の骨髄細胞を準備するため、まずフィルターカード付きの使い捨てチャンバーにスライドを挿入し、そのチャンバーをサイトセントリフュージにセットします。各フィルターカードチャンバーに100 µLのFACS緩衝液を加え、スライドを短時間遠心分離します。遠心終了後、各チャンバーに100 µLの細胞を加え、細胞を遠心分離します。その後、スライドを慎重にチャンバーから取り出し、風乾させます。骨髄細胞を染色するため、スライドをMay-Grünwald液を含むコプリンジャーに5分間浸します。次に、スライドをpH 6.8の緩衝液が入ったジャーに1分間移します。その後、スライドをGiemsa R液に10分間移します。続いて、pH中性の水で10秒間洗浄します。洗浄後、スライドを風乾させ、各サンプルに封入剤を1滴滴下します。次に、カバーガラスの一端をスライド上に置き、気泡が入らないよう軽く押さえながら、慎重に細胞の上にカバーガラスを下ろします。対照群の動物と比較して、C1498細胞を注入した動物では、細胞の芽球様の外見から観察されるように、骨髄へのC1498細胞の大量浸潤が認められます。骨髄に浸潤したC1498細胞は、それぞれ単球系および顆粒球系の表現型を示しており、これは急性骨髄単球性白血病に特徴的な、単芽球および骨髄芽球であることを示しています。C1498を注入したマウスの血液試料における単核細胞分画のフローサイトメトリー分析では、全白血球集団の約4分の1が白血病細胞で構成されていることが示されています。Tリンパ球およびBリンパ球の頻度は、コントロール群とC1498注入動物の間で同様でした。しかしながら、単球の頻度はC1498注入マウスにおいてより高いレベルで観察されており、これは急性骨髄単球性白血病の特徴です。細胞化学的染色およびMay-Grunwald Giemsa染色法を行う際は、適切なpH値、温度、およびインキュベーション時間を維持することが重要です。このビデオを視聴することで、急性骨髄単球性白血病の特性評価方法について十分に理解できるはずです。この手法の開発後、血液学分野の研究者は、他の動物モデルにおける自然発症および誘発性急性白血病の性質を探索することが可能となりました。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

循環腫瘍細胞（CTCの）は、いくつかの転移性癌において予後である。この原稿は、ゴールドスタンダードCellSearchシステム（CSS）CTC列挙プラットフォームについて説明し、一般的な誤分類のエラーを強調しています。さらに、2つの適合プロトコルはこの技術を用いた転移の前臨床マウスモデルでのCTCおよびCTC列挙のユーザ定義のマーカーの特徴付けのために記載されている。...

臨床および前臨床研究用途のための半自動循環腫瘍細胞（CTC）アッセイの適応

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。...

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

bm12リンパ球のC57BL/6レシピエントへの移植は、全身性エリテマトーデスの確立されたモデルです。ここでは、このモデルを使用して疾患を開始する方法と、フローサイトメトリーによってT濾胞ヘルパー細胞、胚中心B細胞、および形質細胞を特徴付ける方法について説明します。...

C57BL / 6マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）のBM12誘導モデル

この原稿は、形質導入移植マウスモデルを確立するために使用される方法論の説明を提供します。骨髄移植を行う際に避けるべき技術的なエラーについて詳細に説明されています。高ウイルス力価、トランスフェクション/形質導入、および照射の重要性を明確に理解する必要があります。...

骨髄増殖性腫瘍の形質導入 - 移植マウスモデル

ここでは、in vitro および in vivo 遺伝子とヒト化マウスモデルを使用して白血病の薬剤標的として C-fos と Dusp1...

C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法

急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルから、マウスの健康な造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるミトコンドリア活性酸素種(ROS)を検出するために多パラメータフローサイトメトリーを用いる方法について説明する。MLL-AF9.

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

このプロトコルでは、マウス胸腺からのダブルネガティブ胸腺細胞の単離とそれに続くレトロウイルス形質導入、およびさらなる機能分析のためのデルタ様4発現骨髄間質細胞株共培養システム(OP9-DL4)での共培養について説明します。...

T細胞白血病における癌遺伝子研究のためのデルタ様4発現間質細胞上でのマウス胸腺細胞の共培養と形質導入

このプロトコルは、免疫腫瘍学研究のためのヒト免疫系(HIS)マウスの生成について概説しています。このモデルに移植されたヒト腫瘍に対するヒト免疫療法を試験するためのこのモデルの使用における指示および考慮事項は、腫瘍に対するヒト免疫系の応答を特徴付けることに重点を置いたものとして提示されている。...

ヒト腫瘍を有するヒト化マウスモデルにおける癌免疫療法の試験

ここでは、白血病細胞の腹腔内注射を利用して、マウスの急性骨髄性白血病(AML)を確立し、増殖させます。この新しい方法は、AML細胞の連続移植に効果的であり、マウスへの静脈内注射で困難や矛盾を経験する可能性のある人の代替手段として役立ちます。...

マウスにおける急性骨髄性白血病発症のための腹腔内移植

ここでは、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病のマウスモデルから骨髄微小環境集団を分離および特徴付けるための詳細なプロトコルが提示されます。この技術は、疾患の進行に伴う内皮細胞や間葉系間質細胞を含む非造血骨髄ニッチの変化を特定します。...

骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病における骨髄微小環境集団の同定

このプロトコルは、導入化学療法に対する反応のダイナミクスに基づいて、急性リンパ芽球性白血病の再発を生成するためのマウスモデルを説明することを目的としています。...

急性リンパ芽球性白血病に対する導入化学療法への白血病再発のマウスモデル

学ぶマウスC1498細胞株と急性骨髄性単球性白血病の特徴付け法。流式細胞計測と細胞化学染色を用いて、骨髄浸潤や単球頻度の変化を解析し、ヒト疾患に類似した病態メカニズムと治療法の検討に活用する。

マウスC1498細胞株およびその関連白血病マウスモデルを特徴付けるための詳細なプロトコル

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