マウスC1498細胞株およびその関連白血病マウスモデルを特徴付けるための詳細なプロトコル

本手順の目的は、マウスC1498細胞の特性解析、およびマウスへの静脈内投与後に誘導される急性白血病の解析を行うことです。本手順の主な利点は、C1498細胞の投与後に誘導されるマウス骨髄単球性白血病が、ヒトの疾患の多くの特徴を呈することです。この動物モデルは、白血病の発症や免疫不全に至るメカニズムなど、血液学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

この動物モデルの意義は、新しい化学療法剤および免疫療法の薬剤の試験を容易にすることから、白血病の治療にまで及びます。まず、5〜6週齢の雌のコンジェニックC57black 6マウスを、滅菌済みのラミナーフローフード内に移動させます。次に、動物を固定器具にセットします。

次に、29ゲージの針を装着した1 mLシリンジに、100 µLの細胞懸濁液を充填します。尾の遠位端を固定し、70%エタノールに浸したガーゼで尾の皮膚を消毒します。その後、側尾静脈に1×10⁶個の細胞をゆっくりと注入します。

すべての細胞を注入し終えたら、針を抜き、滅菌ガーゼを用いて注入部位を軽く圧迫します。その後、動物をケージに戻し、数週間にわたって注意深く観察します。17〜19日後、麻酔をかけた白血病モデル動物の眼内角にキャピラリーチューブを挿入します。

眼窩静脈洞から毛細管チューブに100から200 µLの血液を採取します。チューブを取り出し、滅菌ガーゼスポンジを眼に軽く当てて止血します。その後、血液をEDTAチューブに移し、単核細胞の分離を行うまで氷上で保存します。

血液単核細胞を分離するために、まず、1 mM EDTAを添加したPBSを最終容量が500 µLになるまで加えます。次に、サンプルをマイクロ遠心チューブに移します。続いて、30Gの針を装着した1 mLシリンジを用いて、層が混ざらないように注意しながら、血液の下に分離溶液を500 µL慎重に重層させます。

遠心分離により細胞を分離し、ピペットを用いて不透明な白色の単核細胞層を新しいマイクロ遠心チューブに移します。次に、免疫細胞を1 mLのPBSで洗浄します。遠心分離後、ペレットを600 µLのFACSバッファーに再懸濁し、染色およびフローサイトメトリーによる解析に供します。

骨髄を分離するために、マウスをプラスチックボードの上に仰向けに置き、肢を固定します。70% ethanolで動物を消毒します。次に、関節より上の大腿骨の頂端部で各肢を切断し、脛骨をそっと引っ張って大腿骨から切り離します。

ピンセットとハサミを使用して骨から皮膚と筋肉を取り除き、骨を氷上のペトリ皿に移します。ハサミで末端部を除去します。次に、5 mLの冷PBSが入った10 mLシリンジに取り付けた26Gの針を、骨の端に1本ずつ挿入し、骨髄を皿の中に洗い出します。

細胞懸濁液を針先に数回通し、骨髄細胞を分散させます。次に、細胞を新しい70 micronフィルターでろ過し、50 milliliterコニカルチューブに回収して単一細胞懸濁液を得ます。細胞を遠心分離し、ペレットを2 milliliterの溶解バッファーで再懸濁します。

直ちにチューブに最大 50 milliliters の冷 PBS を満たし、細胞を遠心分離します。次に、骨髄ペレットを冷 FACS バッファーを用いて 1 × 10⁶ cells/milliliter に再懸濁します。染色前の骨髄細胞を準備するため、まずフィルターカード付きの使い捨てチャンバーにスライドを挿入し、そのチャンバーをサイトセントリフュージにセットします。

各フィルターカードチャンバーに100 µLのFACS緩衝液を加え、スライドを短時間遠心分離します。遠心終了後、各チャンバーに100 µLの細胞を加え、細胞を遠心分離します。その後、スライドを慎重にチャンバーから取り出し、風乾させます。

骨髄細胞を染色するため、スライドをMay-Grünwald液を含むコプリンジャーに5分間浸します。次に、スライドをpH 6.8の緩衝液が入ったジャーに1分間移します。その後、スライドをGiemsa R液に10分間移します。

続いて、pH中性の水で10秒間洗浄します。洗浄後、スライドを風乾させ、各サンプルに封入剤を1滴滴下します。次に、カバーガラスの一端をスライド上に置き、気泡が入らないよう軽く押さえながら、慎重に細胞の上にカバーガラスを下ろします。

対照群の動物と比較して、C1498細胞を注入した動物では、細胞の芽球様の外見から観察されるように、骨髄へのC1498細胞の大量浸潤が認められます。骨髄に浸潤したC1498細胞は、それぞれ単球系および顆粒球系の表現型を示しており、これは急性骨髄単球性白血病に特徴的な、単芽球および骨髄芽球であることを示しています。C1498を注入したマウスの血液試料における単核細胞分画のフローサイトメトリー分析では、全白血球集団の約4分の1が白血病細胞で構成されていることが示されています。

Tリンパ球およびBリンパ球の頻度は、コントロール群とC1498注入動物の間で同様でした。しかしながら、単球の頻度はC1498注入マウスにおいてより高いレベルで観察されており、これは急性骨髄単球性白血病の特徴です。細胞化学的染色およびMay-Grunwald Giemsa染色法を行う際は、適切なpH値、温度、およびインキュベーション時間を維持することが重要です。

このビデオを視聴することで、急性骨髄単球性白血病の特性評価方法について十分に理解できるはずです。この手法の開発後、血液学分野の研究者は、他の動物モデルにおける自然発症および誘発性急性白血病の性質を探索することが可能となりました。