Name: 以下のための遺伝学的および生化学的アプローチインビボとインビトロタンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 学ぶライアノジン受容体のオリゴマー化評価法。酵母ツーハイブリッド、コイムノプレシピテーション、化学架橋を用いてタンパク質相互作用と自己会合を解析し、心臓不整脈の分子メカニズム解明に貢献する。

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この作品は、SZ（FS / 08/063とFS / 15/31494分の30）に英国心臓財団のフェローシップによってサポートされていました。

<ol><li>Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+interactions+within+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Structural and functional interactions within ryanodine receptor.</a> Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-terminus+oligomerisation+is+conserved+in+intracellular+calcium+release+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels.</a> Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).</li>
<li>Zissimopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminus+oligomerization+regulates+the+function+of+cardiac+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).</li>
<li>Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+aberrant+N-terminus+inter-subunit+interactions+in+mutant+pro-arrhythmic+cardiac+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors.</a> Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).</li>
<li>Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail.</a> Biochem J. 376, 795-799 (2003).</li>
<li>Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interactions%3A+two+methods+for+assessment+of+the+reliability+of+high+throughput+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).</li>
<li>Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continued+evolution+of+two-hybrid+screening+approaches+in+yeast%3A+how+to+outwit+different+preys+with+different+baits%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits.</a> Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).</li>
<li>Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+genetic+in+vivo+methods+for+protein-protein+interaction+studies%3A+from+the+yeast+two-hybrid+system+to+the+mammalian+split-luciferase+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).</li>
<li>Yang, M., Wu, Z., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-peptide+interactions+analyzed+with+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system.</a> Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).</li>
<li>Elion, E. A. Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElion%2C+EA+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , (2007).</li>
<li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Chapter 9, Calcium phosphate transfection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKingston%2C+RE+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22">Curr Protoc Mol Biol</a>. , (2003).</li>
<li>Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hax-1+identified+as+a+two-pore+channel+%28TPC%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein.</a> FEBS letters. , (2013).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+FKBP12.6+with+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain.</a> J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+binding+of+ryanodine+receptors+carrying+mutations+associated+with+arrhythmogenic+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease.</a> Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).</li>
<li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li>
<li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+approaches+to+the+analysis+of+multiprotein+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes.</a> Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).</li>
<li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaraldehyde%3A+behavior+in+aqueous+solution%2C+reaction+with+proteins%2C+and+application+to+enzyme+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).</li>
<li>Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+mechanism+and+end+products+of+glutaraldehyde+crosslinking+reaction+by+X-ray+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis.</a> Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+domain+of+the+human+cardiac+muscle+ryanodine+receptor+does+not+mediate+interaction+with+FKBP12.6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6.</a> Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).</li>
<li>Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+interaction+with+the+SNARE-associated+protein+snapin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin.</a> J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+sensitivity+of+the+ryanodine+receptor+interaction+with+FK506-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein.</a> J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparities+in+the+association+of+the+ryanodine+receptor+and+the+FK506-binding+proteins+in+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+125%22%5BJournal%5D)">Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart.</a> J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).</li>
<li>Ali, M. H., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+oligomerization%3A+how+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein oligomerization: how and why.</a> Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).</li>
<li>Hashimoto, K., Panchenko, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+oligomerization%2C+the+critical+role+of+insertions+and+deletions+in+maintaining+different+oligomeric+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).</li>
<li>Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+stability+of+proteins+in+aqueous+solution%3A+mechanism+and+driving+forces+in+nonnative+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation.</a> Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).</li>
<li>Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+and+quantitation+of+protein+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The detection and quantitation of protein oligomerization.</a> Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).</li>
<li>Kaczor, A. A., Selent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+G+protein-coupled+receptors%3A+biochemical+and+biophysical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods.</a> Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).</li>
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著者は宣言することは何もありません。

タンパク質のホモオリゴマーの形成は、転写因子、酵素、イオンチャンネルおよび受容体25,26の活性を調節する基本的な生物学的プロセスです。重要なことは、タンパク質のオリゴマー化はまた、神経変性および催不整脈心臓病4,27などの病理学的な意味を持ちます。この記事で概説した方法は、タンパク質の自己会合およびオリゴマー化を媒介するドメイン - ドメイン相互作用を同定するために使用されます。以下では、各プロトコル内の重要なステップでポイントして、我々は重要な考慮事項、制限事項およびトラブルシューティングについて説明します。 Y2H系は、その比較的高いスループットスクリーニング、使いやすさと再現性の高い結果の潜在的な相互作用タンパク質パートナーをスクリーニングするために最初に使用することができます。 Y2H手順は、標準的な（プレートまたはシェーカー）インキュベーター、ルーム封じ込め施設で微生物検査室で行われます。 FRの使用β-Galのアッセイで最高の結果を得るために、新たに（古い5日まで）酵母コロニーを増殖させ（ステップ1.2.3）を使用すべきであるのに対し、eshly調製したコンピテント細胞（ステップ1.1.8）は、高効率の酵母形質転換のために重要です。 GAL4以外の転写因子および/または代替/追加のレポーター遺伝子に基づいたシステムは、利用可能であるため、ベイトおよびプレイプラスミドは、適切なY2H株と一致する必要があります。 いくつかの株は、HIS3レポーター遺伝子7,8のいずれかの構成的発現をクエンチするために、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール、HIS3タンパク質の競合的阻害剤の存在下で培養すべきです。餌とターゲット融合タンパク質の発現は、17を免疫ブロッティングによって確認する必要があります。場合餌に/餌の融合タンパク質は、酵母に対して毒性である、より低い許容タンパク質レベルはベイト/獲物発現が異なるプロモーターによって駆動される別のベクターにクローニングすることにより達成することができます。また、Tを確保するために不可欠です帽子餌/獲物の融合タンパク質は、自律的なレポーター遺伝子活性は表示されません。自律的なレポーター遺伝子の活性化は、2試験タンパク質のGAL4 DNA-BDとAD融合体を交換することにより、責任領域を除去するための構築物を修飾することによって救出することができます。それらが細胞内膜区画における融合タンパク質のミスフォールディングまたは誤局在を引き起こす可能性があるため、また、膜貫通ドメインは、より良好な餌/餌構築物から省略されています。実際、Y2H系の主な欠点は、餌とターゲットタンパク質は、偽陽性または偽陰性の相互作用6-9で、その結果、離れてそれらの生理学的細胞内位置から酵母核に局在し、潜在的に特定の翻訳後修飾を欠いているということです。 哺乳動物の異種発現系は、立体構造、翻訳後修飾および細胞内局在性の観点から、哺乳動物の内在性膜タンパク質の研究に適しています。最も広く使用される細胞のトランスフェクション法の一つは、主に最小限の設備および試薬11,15を必要とするリン酸カルシウム沈殿です。別の方法、すなわちエレクトロポレーション、リポソーム、カチオン性脂質およびポリマーは、使用される細胞株および構築物に依存して、より高いトランスフェクション効率をもたらすことができます。一般的に、トランスフェクション効率に影響を与える主な要因は、プラスミドDNAの質および細胞の健康/生存率です。最高純度の（260nmの/ 280nmの吸光度比〜1.8）と活発に分裂する細胞のプラスミドDNAを使用した場合に最良の結果が達成されます。外来DNAを取る能力が媒体11に曝露された細胞の表面領域に関連しているので、70％コンフルエンス（ステップ2.1.2） -細胞は、したがって、これ以上60以下でトランスフェクトされるべきです。さらに、トランスフェクション（ステップ2.1.3）中の培養培地中の抗生物質の含有が増加した細胞死の15のために推奨されません。 Fまたは特に、リン酸カルシウム沈殿、入念な準備及びpH調整（7.05まで正確に）2×HBS溶液を（ステップ2.1.1）、そして激しく混合（ステップ2.1.5）によりプラスミドDNA /カルシウム/リン酸複合体の適切な形成は、高効率トランスフェクションのための重要なステップ。一般的に、24内の一過性トランスフェクションピークによってタンパク質の発現 - 72時間。 細胞を回収したら、その後の手順は、プロテアーゼ活性を最小化するために4℃で実施しなければならない、およびプロテアーゼ阻害剤の添加が推奨されます。染色体DNAは、溶液粘度が増加し、非特異的結合を高めることができるので、細胞の均質化は、核を除去するための遠心分離工程が続くべきです。従って、等浸透圧緩衝液中で機械的手段により均質化は、通常、（0.3 M）のスクロースまたは（150 mM）のNaCl中で、好ましいです。一般に、スクロースベースの緩衝液は、タンパク質安定性を増強し、潜在的な非天然タンパク質凝集を減少させることが知られているが、Pのためにタンパク質表面上の基準の水和は、静電タンパク質間相互作用が好まれています。逆に、塩系緩衝剤は、より疎水性に基づく相互作用28に向かってバイアスを有する、タンパク質表面上の荷電したアミノ酸側鎖基の正味の電荷に影響を与えます。 共IPは、特に天然の組織からのタンパク質 - タンパク質相互作用を評価するための最も一般的に用いられる生化学アッセイです。その主な欠点は、IPおよびイムノ10,16,18で使用するために検証され、高度に特異的な抗体のための必要条件です。従って、組換えタンパク質は、多くの場合、 例えば 、ペプチドエピトープでタグ付けされている。、インフルエンザ赤血球凝集素（YPYDVPDYA）またはヒトCMYC（EQKLISEEDL）、高親和性特異的な抗体が市販されています。必要であれば、免疫沈降抗体は、化学的共沈PRを明瞭に免疫ブロッティング段階でその溶出および検出を回避するために、プロテインA樹脂に結合させることができます16 otein;これを達成するために、我々が正常に化学架橋剤3,3&#39;-ジチオビス（sulfosuccinimidylpropionate）24を使用しています。適切な界面活性剤は、IP緩衝液中に含まれ、均質化細胞の不溶性物質は、非特異的結合（ステップ3.1.3）を最小化するために遠心分離によって除去されることが不可欠です。洗剤の選択と集中が重要な考慮事項です：強力な洗剤および/またはより高い濃度は、実質的に非特定の結合を減少させるだけでなく、X廃止することがあります。より低濃度またはより穏やかな洗剤は弱い相互作用が観察されることを可能にする一方で、Yのタンパク質相互作用をするがよいです過剰な非特異的結合をもたらします。中間強度の界面活性剤は、 例えば 、好ましい、トリトンX-100を0.5に- 1％の濃度です。さらに、非特異的結合を減少させるために、中性タンパク質（100μg/ mlの、例えば、ウシ血清アルブミン）をIP緩衝液中に含めることができ、および/ ​​または細胞溶解物は、事前cleareすることができ単独のプロテインA樹脂とのインキュベーションの前でD。洗浄回数はX用に最適化されるべきである：Yのペアは、試験された、一般的にIPバッファ（ステップ3.1.9）で3 10分間の洗浄。いずれの場合も、免疫沈降抗体として、非免疫IgGと共IPサンプルは常に陰性対照（ステップ3.1.6）を提供するために並列に処理されるべきです。 化学的架橋の主な利点は、それがタンパク質のホモオリゴマーの化学量論組成に知らせることです。それは特殊な装置を必要とせず、それが相互作用するタンパク質19,20の間に熱的および化学的に安定な架橋を生成するので、グルタルアルデヒドは、一般的に使用される架橋剤です。これらは、化学反応を停止しますので、遊離アミノ基を有する化合物は、アッセイバッファ（ステップ3.2.1）から除外されるべきです。グルタルアルデヒド濃度と反応時間（ステップ3.2.4）は、関心のオリゴマータンパク質複合体のために最適化されるべきです。この技術の主な欠点、especi全細胞調製物に対して行わ味方場合、生物学的意義を欠く人工タンパク質凝集体を得ることができ、化学反応の非特異性です。 代替インビボで （ 例えば 、蛍光共鳴エネルギー転移、二分子蛍光又はルミネセンス相補性）およびインビトロ技術（ 例えば 、サイズ排除クロマトグラフィー、分析的超遠心分離、等温滴定熱量測定）タンパク質の自己会合及び評価の特徴付けのために利用可能ですオリゴマーの化学量論29,30の。それぞれの方法は、独自の長所と短所があり、それは、タンパク質精製/安定性及び装置/試薬の利用可能性に応じて、特定のタンパク質の研究のために、より適切であり得ます。ここで詳細に説明した3つの相補的な方法、すなわちY2H、共IP及び架橋は、RyR2のホモoligomeための説得力のある証拠を提供するために組み合わせて使用​​されています分離および生体細胞内のrを形成。

骨格筋および心筋の収縮はのRyRにより媒介筋小胞体のCa 2+放出によって誘発されます。 4つの同一のサブユニットから成る機能チャネルと3の哺乳動物のRyRアイソフォームがあります。それぞれのRyRサブユニットは、大きな細胞質調節N末端 ​​部分及び高コンダクタンスの Ca 2+の細孔を形成する膜貫通ドメインを含む小さなC末端部分から成ります。異常内およびサブユニット間相互作用は、のRyRチャネルの機能障害の根底にある神経筋や心臓障害1になります。 RyR構造に関与する特定のドメインの同定および特徴：機能の関係はのRyRの病態生理の理解のために、したがって重要です。 伝統的な生化学的タンパク質 - タンパク質相互作用の技術は、多くの場合、細菌中で産生され精製されたタンパク質の実質的な量を、必要とします。これはのRyR、非常に大きな膜pの場合には現実的ではありませんその組換えフラグメントが細菌発現および精製が容易に受け入れられないのに対し、〜5000個のアミノ酸からなるrotein。したがって、真核生物宿主細胞を含む代替的な発現系は、哺乳動物の内在性膜タンパク質のために必要とされます。我々は以前、まとめN末端 ​​の四三の哺乳動物のRyRが2,3アイソフォーム間で保存されている構造的特徴であることを実証するためにY2H、共同IPおよび架橋アッセイを採用しています。重要なことは、我々は催不整脈性心疾患に関連した単一点変異は、N末端 ​​の自己会合および機能不全のRyRチャネル4の結果を破壊することを見出しました。我々はまたのRyR細胞質のC末端尾部5と同様に、相同細胞内Ca 2+放出チャネル、イノシトール1,4,5-トリスリン酸受容体2のN末端 ​​のオリゴマー化の研究にこれらの技術を適用しています。 Y2Hアッセイでは、interacti二つのタンパク質（XとY）の間に機能的な転写因子（GAL4）およびレポーター遺伝子6-9の続く活性化を再構成することによって測定されます。 DNA結合ドメイン（DNA-BD）/タンパク質Xの融合（ベイト）と活性化ドメイン（AD）/タンパク質Y 2つの異なるクローニングベクターは、GAL4の2つの物理的に分離、独立したドメインを有する2つの試験タンパク質の融合体を生成するために使用されます融合（ターゲット）。 Y2Hタンパク質がGAL4 DNA-BDと同じタンパク質のAD融合物を生成することによって、それ自体と相互作用するかどうかをテストするために使用することができます。遺伝的に改変されたY2H株はGAL4とGAL80欠損（GAL80タンパク質がGAL4のリプレッサーである）、ならびにTRP1およびLEU2が欠損（それぞれ、ベイトおよびプレイプラスミドのための栄養選択を提供するために）です。酵母核に、組換えDNA-BDとADペプチドは唯一の彼らの融合 &#39;Xを通じてハイブリッドGAL4転写因子を生成するために物理的に近接させられる：Y int型eraction。このアプローチは、レポーター遺伝子（β-ガラクトシダーゼ（β-Gal）のためのLacZ符号化）と発色性（ヒスチジン生合成に必要な酵素のHIS3エンコーディング ）原栄養の並列転写活性化を介してタンパク質-タンパク質相互作用を検出するための迅速な遺伝子スクリーニングを可能にします。 Y2Hの主な利点は、それが弱いまたは一過性のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するin vivoアッセイであることです。また、検出は、餌と対象タンパク質の精製または特定の抗体の生成を必要とせず、簡単な（メディアヒスチジンを欠く中で）増殖選択の使用または比色の（β-Galの）アッセイを伴います。また、Y2Hはまた、ライブラリーのタンパク質のcDNAへの直接アクセスを与えるベイトタンパク質の新規の結合パートナー、ランダム未知のクローン（GAL4 ADに融合したcDNAライブラリークローン）のコレクションをスクリーニングすることができます。 Y2H観測を拡張するために、INDEPENDENT生化学的技術を使用することができます。共IP及びイムノブロッティングと組み合わせた架橋アッセイは、複雑なサンプル混合物中のタンパク質の関連を検出するために用いられる方法、 例えば 、全細胞溶解物10です。それらの主な利点は、組換えタンパク質の使用を必要とする他の方法とは異なり、天然の組織からのタンパク質 - タンパク質相互作用について報告することです。組換えタンパク質は、典型的には、彼らが正しいコンホメーションおよび翻訳後修飾を有する可能性がある哺乳動物細胞株、ならびに細胞内局在性に発現し、また使用することができます。共IPと架橋がインビトロアッセイは、均質化細胞を利用しているので、2つのタンパク質パートナーは、無傷の細胞11に共局在しているかどうかを確認する必要があります。我々は日常的に一過性リン酸カルシウム沈殿法2を用いて、哺乳動物の内在性膜および細胞質タンパク質を発現する哺乳動物HEK293細胞のトランスフェクションを使用し-4,12-14は、詳細にここで説明しました。これは、効率的に細胞内にプラスミドDNAを送達するための安価な方法ですが、それは特定の使用の細胞株および細胞コンフルエンスと同様に、プラスミドDNA 11,15の純度に依存しています。 共IPアッセイは、推定上の相互作用パートナー10,16の同時精製を可能にする非変性条件下での細胞溶解物からの関心の天然または組換えタンパク質の単離を伴います。タンパク質は、2つの異なるエピトープを有する2つの異なる融合物を生成することによって、それ自体と相互作用するかどうかをテストするために使用することができる2つの独立した抗体の使用、タンパク質Xの単離のための免疫沈降用抗体、およびタンパク質パートナーYの検出のためのイムノブロッティング抗体を必要としますタグ（ 例えば 、HAおよびCMYC）。免疫沈降抗体は、プロテインAには、そのFc領域を介して結合した（プロテインG、抗体が発生した動物種に応じてか）されていますアガロース（またはセファロース）樹脂に結合しています。タンパク質Xは、抗体により沈殿させる：タンパク質 - 樹脂細胞溶解物、均質化された細胞の、すなわち界面活性剤可溶性分画とのインキュベーション後。タンパク質の免疫複合体は、SDSを含む緩衝液で溶出させ、続いてタンパク質Y 17の存在を検出するために抗体を用いるSDS-PAGEおよびイムノブロッティングにより分析します。共IPは、過剰非特異的結合を回避するために、界面活性剤、水溶性タンパク質を用いて実施されるべきです。 Y対10,16,18：洗剤とその濃度の選択だけでなく、洗浄回数は、各X用に最適化されるべきです。 架橋は、オリゴマータンパク質複合体の化学量論を決定するために使用されます。これは、隣接する相互作用プロトマーの間に共有結合を生成する化学反応に基づいており、従って、それはSDS-PAGEの分離の際、タンパク質のオリゴマー状態の保存を可能にします。多数の架橋レアージュがありますタンパク質、典型的には、第一級アミン、カルボン酸またはチオール基に異なる反応基をターゲットに様々な長さと化学のNTS。ここでは、（OHC（CH 2）3 CHO）、リジン残基19,20中に存在する遊離アミノ基と反応するいずれかの端部に2つのアルデヒド基を有するホモ二官能性架橋剤がグルタルアルデヒドの使用を記載しています。架橋は、付加物形成をもたらす濃度 - または時間依存的な様式で行われます。グルタルアルデヒドの反応は、ヒドラジン（H 2 NNH 2）で停止し、タンパク質試料をSDS-PAGEによって分析し、それらのオリゴマー化状態を評価するために17を免疫ブロッティングしています。私たちは、架橋がオリゴマー化を誘導するが、単に既存のタンパク質複合体との間で安定したブリッジを作成していないことに注意してください。架橋実験を実施する重要な考慮事項は、架橋剤の選択は、その濃度と反応時間19,20を含みます。

<table><tbody><tr><td>PART 1酵母2ハイブリッド</ストロング>プレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベータ</td><td>ーHereaus</td><td>B6120</td><td>30°Cで使用されます。C</td></tr><tr><td>オービタルシェーカーインキュベーター</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィック</td><td>INNOVA 4300</td><td>30°Cで使用;230 - 250 rpmで振とうとC</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>パーキンエルマー</td><td>ラムダバイオ+</td><td>酵母培養のOD600を測定するため; 液体b-Galアッセイマッチ</td></tr><tr><td>メーカー2ハイブリッドシステム2キット</td><td>タカラクロンテック</td><td>K1604-1</td><td>餌ベクトルpGBKT7、獲物ベクトルpACT2&nbsp;および酵母株Y190&nbsp;が含まれています。</td></tr><tr><td>酵母窒素ベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td>最小限の<td>SD成長培地を準備するために&nbsp;</td></tr><tr><td>ロイシンとトリプトファンを欠いたドロップアウトサプリメント</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>最小限のSD成長培地を調製する&nbsp;</td></tr><tr><td>ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンを欠くドロップアウトサプリメント</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>最小限のSD成長培地を準備するには&nbsp;</td></tr><tr><td>ニシン精巣キャリアDNA&nbsp;</td><td>タカラクロンテック</td><td>630440</td><td>酵母形質用</td></tr><tr><td>Whatman濾紙 グレード5&nbsp;</td><td>コロニーリフト濾紙用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td> b-Gal assay</tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&β;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>コロニーリフト濾紙用B-Gal Assay</td></tr><tr><td>ONPG (o-ニトロフェニル-β;-D-ガラクトピラノシド)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td> 液体<td>b-Galアッセイ</td></tr><tr><td>用<強い>パート2。哺乳類細胞株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293細胞株</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg;&nbsp;CRL-1573&貿易;</td><td></td></tr><tr><td>加湿インキュベーター(5%CO2、37°C;C)</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>哺乳類細胞の培養</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium)</td> <td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>哺乳類細胞の増殖培地の調製</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>哺乳類細胞の増殖培地の調製</td></tr><tr><td>ガラスビーズ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>細胞の均質化</td></tr><tr><td>ニードル 23 G (0.6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>細胞を均質化するための</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル (コンプリート)&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11873508001</td><td>タンパク質分解を防ぐために</td></tr><tr><td>パート3。in vitro生化学的方法&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN テトラセル (SDS-PAGE システム)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&nbsp;</td><td>ポリアクリルアミドゲル電気泳動用</td></tr><tr><td>トランスブロット SD (セミドライ転写システム)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1703940</td><td>電気泳動転写用</td></tr><tr><td>コンパクトX線フィルムプロセッサー</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>イムノブロッティング用</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>化学架橋</td></tr><tr><td>用 Protein-Aセファロースビーズ&nbsp;</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>17-5280-01&nbsp;</td><td>co-IPアッセイで使用</td></tr><tr><td>抗HA(Y-11ウサギポリクローナルIgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>Co-IPアッセイで使用するため</td></tr><tr><td>非免疫ウサギIgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>Co-IPアッセイ</td></tr>用<tr><td>抗cMyc(9E10マウスモノクローナルIgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-40</td><td>イムノブロッティング</td></tr>用 <tr><td>抗 HA (16B12 マウスモノクローナル IgG)</td> <td>コーヴァンス</td><td>MMS-101P</td><td>イムノブロッティング</td></tr>用 <tr><td>アンチマウス IgG-HRP</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー</td><td>sc-2005</td><td>イムノブロッティング</td></tr>用 <tr><td>ハイパーフィルム ECL</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>28906836</td><td>イムノブロッティング</td></tr>用 <tr><td>ECL ウェスタンブロッティング 基質</td><td>ピアス (ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>イムノブロッティング用</td></tr></tbody></table>

以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

オリゴマー化は、タンパク質が特定の細胞機能を達成するための構造的な要件であることがよくあります。例えば、リアノジン受容体(RyR)の四量体化は、機能的なCa2+放出チャネル細孔の形成に必要です。ここでは、酵母ツーハイブリッド(Y2H)、共免疫沈降(co-IP)、化学的架橋アッセイなど、タンパク質の自己会合を評価するための詳細なプロトコールについて説明します。Y2Hシステムでは、GAL4ベイトと被験タンパク質の標的融合を共発現する酵母のβ-ガラクトシダーゼアッセイにより、タンパク質の自己相互作用が検出されます。タンパク質の自己相互作用は、哺乳類のHEK293細胞で共発現した被験タンパク質のHAおよびcMycタグ付き融合体を用いたco-IPによってさらに評価されます。タンパク質ホモオリゴマーの精密化学量論は、HEK293細胞での発現後の架橋およびSDS-PAGE分析によって調べられます。これらの異なるが補完的な手法を使用して、RyR N末端ドメインの自己会合を一貫して観察し、四量体を形成するその固有の能力を実証しました。これらの方法は、他の哺乳類の内在性膜タンパク質のタンパク質間相互作用およびホモオリゴマー化研究に適用できます。

Y2Hシステムでは、餌は：餌の相互作用は、最初に（トリプトファン、ロイシンなど）、ヒスチジンを欠く培地中で酵母の増殖の選択によって試験され、その後、β-GAL酵素活性アッセイ（ 図1）によって評価しました。獲物タンパク質相互作用：中ヒスチジンを欠く中で培養した酵母は、餌の強さに依存遅い成長率を持っています。 β-Galのアッセイは、（のみトリプトファンおよびロイシンを欠く培地で培養）酵母で行わいずれか後者の収量定量結果で、（寒天プレート）固体支持体上または液体培地で成長しています。我々は成功したRyR2内のドメイン-ドメイン相互作用だけでなく、新規タンパク質パートナー2-4,12,21,22を識別するためにY2Hを使用しています。例えば、我々は、N末端断片との相互作用のためのRyR2ペプチド配列の全長にわたる構築重複する一連のスクリーニング（AD4L：のRyR2残基1 - 906のGAL4 ADと融合）3コロニーリフトフィルター紙β-GalのアッセイはBT4Lのための鮮やかな青色の酵母コロニー産：AD4Lペア（ 図2A）を 、AD4L自体と相互作用することを示す、すなわちBT4Lは（RyR2の残基1構築- GAL4と融合906 DNA-BD）。淡い青色のコロニーがBT8のために検出されました：極端なC末端ドメイン（BT8）との二弱い関連を示唆AD4Lペア、酵母、他の構築物で同時形質転換は、餌のための白、したがって、負のままであった：獲物タンパク質相互作用。液体β-Galのアッセイ（ 図2B）で得られた定量的結果は、堅牢なBT4Lを示した：AD4L相互作用同等の強度でp53タンパク質（PVA3）およびSV40ラージT抗原（PTD1）間の既知の関連を、BT8に対し：AD4L相互作用を（&lt;10％を対照と比較して）かなり弱かったです。 私たちは日常的に共同-IP実験（ 図3）は、fを行いますY2H所見2-4,12-14,21-24を強化するための独立した生化学的ア ​​ッセイとして、哺乳動物細胞株（HEK293）での一過性発現をollowing。 RyR2のN末端の自己相互作用を確認するために、RyR2の残基1をコードする二つの別々のプラスミド - CMYCまたはHAペプチドエピトープ（それぞれBT4L及びAD4L）のいずれかでタグ付け906は、リン酸カルシウム沈殿法を用いてHEK293細胞に同時トランスフェクトしました。 3。均質化した細胞の後の核画分を洗剤CHAPSで可溶化し、そして不溶性物質を、細胞溶解物を生成するために遠心分離によって除去しました。還元剤ジチオスレイトールで処理された細胞溶解物を、その後、HAタグ付きAD4Lを免疫沈降抗体HAおよびプロテインAセファロースビーズとインキュベートしました。 SDSを含む緩衝液で溶出共IP試料は、R、二つの別々のSDS-PAGEゲル（1/10と9/10 番目の分割）にロードおよびAB HAおよびAB CMYCを用いたイムノブロッティングにより分析しましたespectively。アブHAによるAD4Lの成功直接IP（〜100 kDa）がなく、非免疫ウサギIgG（ 図4A）を使用して、負の制御では、イムノブロット法により確認しました。重要なことは、CMYCタグ付きBT4L（〜100 kDa）がなく、免疫沈降AD4L（ 図4B）の不在下での負の制御では、唯一の抗体HA IPで回収しました。 Y2Hと共同IPアッセイは、RyR2のN末端の自己相互作用のための一貫性のある証拠を提供し、彼らはそれが唯一の二量体以上の複合体を形成する、すなわちかどうか、N末端ドメインのオリゴマー化状態に通知しませんでした。複合体が解離することに留意すべきであるとのみからなるサブユニットは、タンパク質 - タンパク質相互作用を廃止するためにSDS-のSDS-PAGE及び熱誘導タンパク質の変性によって検出されます。これを克服するために、我々は、化学的安定既存proteiをconjoins架橋（ 図5）を使用しその分子量をSDS-PAGEのサイズ分離2-5で調べることができ、n個のオリゴマー、。例えば、還元剤ジチオスレイトールで処理CMYC-BT4Lを発現するHEK293細胞ホモジネートを、グルタルアルデヒドと反応し、抗体CMYC（ 図6）を使用して、SDS-PAGEおよびイムノブロッティングによって分析しました。単量体（〜100 kDaの）に加えて、〜400キロダルトンの高分子量タンパク質バンドを、RyR2のN末端 ​​の四量体の形成3を示し、時間依存的に検出されました。特に、四量体は、最小限の二量体と観察トリマーバンドで、優勢なオリゴマー種でした。 15％勾配SDS-PAGEゲル3 -その見かけの分子量を決定するために、BT4Lオリゴマーは4を介して分離しました。私たちは30の範囲でタンパク質スタンダードを用いた分子質量/ゲル遅延標準曲線生産 - 460 kDaのを、私たちは358 kDaで15であることがオリゴマーを算出した（n = 4）。この見かけの分子量は、内​​に配置さBT4L四量体と一致していますネイティブのRyR2チャネル内の4つのサブユニットの配列から予想されるように、むしろ直線状に比べて円形のファッションを閉じました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> 図1. Y2Hフローチャート。酵母、同時形質転換餌とターゲットプラスミドで、培地ヒスチジンを欠く中で成長するために選択および/ ​​またはβ-Galの酵素活性についてアッセイされる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> 図2. Y2Hは、RyR2のN末端 ​​ドメインの自己相互作用を示唆している。ためにY2H系で試験したヒトのRyR2重複タンパク質断片の（餌）シリーズを描いた（A）の回路図<html> RyR2のN末端AD4L（獲物）との相互作用が構築します。コロニーリフトフィルター紙β-Galのアッセイによって得られた定性的結果は、「+」倍数かで示されている&quot; - &quot;負の相互作用のための陽性対照に対して標準化（B）定量的液体β-Galのアッセイ（PVA3は、GAL4 DNA-BDをコードします。 p53タンパク質との融合; PTD1は、SV40ラージT抗原とのGAL4 AD融合をコードします）。 3から変更された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> 図3 のCo-IPフローチャート。哺乳動物細胞、プラスミドXとYとの同時トランスフェクションは、SDS-PAGEおよびイムノブロッティングに続いて、共IPアッセイにおいて使用される細胞溶解物を生成するために均質化し、界面活性剤で可溶化されています。F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> 図4. 共同-IPは、哺乳動物細胞内のRyR2 N末端 ​​ドメインの自己相互作用を示します。HEK293細胞は、CMYCタグ付き（BT4L）の一過性同時発現およびHAタグ（AD4L）のRyR2 N末端 ​​ドメインの同時トランスフェクトしました（残基1から906）。陰性対照として、共同IPアッセイは非免疫ウサギIgGを用いて行ったのに対しAD4Lは、CHAPS可溶化及びジチオスレイトール処理したHEK293の溶解物からのAb HAを用いて免疫沈降させました。免疫沈降したタンパク質を、5分間85℃に加熱し、そして1/10またはIP試料の9/10 番目を装填別個の6％SDS-PAGEゲルを介して3時間20mAで分離しました。 polyvinyへ2時間80 Vで、以下のタンパク質の転送抗体HA（A）または抗体CMYC西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG、続いて、それぞれ、（B）、（1：10,000希釈）および増強化学発光検出：lideneジフルオリド膜は、免疫ブロット分析は、（千希釈1）を用いて行きました（1分間露光）。細胞溶解物のアリコートを、IP試料で処理体積の1/50には 、また、分子質量標準を提供するために含めました。 3から変更された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> プラスミドXをトランスフェクトし、図5 の架橋フローチャート。哺乳動物細胞は、SDS-PA続いて、均質化および架橋アッセイでグルタルアルデヒドとの反応に供されますGEおよびイムノ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> 図6. 架橋は、RyR2のN末端 ​​ドメイン四量体形成を示す HEK293細胞は、CMYCタグ付き（BT4L）のRyR2 N末端 ​​ドメイン（残基1から906）の一過性発現のためにトランスフェクトしました。還元剤ジチオスレイトールで処理した細胞ホモジネートを、示された時間ポイントのグルタルアルデヒドを用いてインキュベートしました。サンプルを5分間85℃に加熱し、3時間20mAでSDS-PAGE（6％ゲル）により分離しました。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG（1、続いて：（千希釈1）抗体CMYCをポリビニリデンジフルオリド膜上に2時間、80 Vでのタンパク質の転写後、免疫ブロット分析を用いて行きました。10,000希釈）および強化化学発光検出（1分間露光）。モノマー（M：〜100キロダルトン）と四量体（T）の形態は、矢印で示されています。 3から変更された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

細胞内貯蔵からのCa2+放出を媒介するホモ四量体イオンチャネルであるリアノジン受容体のオリゴマー化は、骨格筋と心筋の収縮に重要です。ここでは、タンパク質の自己会合を検出し、ホモオリゴマー化学量論を決定するための補完的なin vivoおよびin vitro法を紹介します。

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

酵母ツーハイブリッド法、共免疫沈降法、および化学架橋法というこれら3つの相補的な実験手法の全般的な目的は、タンパク質間相互作用、特に自己会合を評価し、タンパク質ホモオリゴマーの化学量論的組成を決定することです。これらの手法は、心不全などの心疾患分野における、心室不整脈や突然死の背景にある超ドライ受容体のオリゴマー化といった重要な疑問を解決するのに役立ちます。これらの手法の主な利点は、比較的ハイスループットなスクリーニングが可能であること、使いやすさ、および結果の再現性が高いことであり、同時に必要となる装置や試薬も最小限で済むことです。これらの手法の意義は、抗不整脈薬の分子的な作用機序の解明に寄与するため、不整脈性心疾患の治療へと展開されます。一般的に、共免疫沈降法に不慣れな方は、遠心分離ステップで上清を吸引する際に、非常に小さいプロテインアガロースビーズを誤って捨ててしまう可能性があるため、苦労することがあります。この酵母ツーハイブリッドアッセイでは、形質転換に対数増殖期中期の酵母細胞を使用します。遠心分離により細胞を回収し、各ペレットを5 mLの滅菌水に再懸濁して、細胞懸濁液をまとめます。細胞懸濁液を遠心分離します。上清を捨てた後、酵母ペレットを、調製したばかりの滅菌済み1xリチウムアセテートおよびTE 1 mLに再懸濁します。コンピテント酵母細胞は、調製後1時間以内に使用する必要があります。ベイトおよびターゲットの血漿DNAを100 µgのニシン精巣キャリアDNAと混合し、プラスミドサンプルを調製します。1.5 mLチューブに、コンピテント酵母懸濁液100 µLと1X酢酸リチウムおよびPEG溶液600 µLを加え、約30秒間ボルテックスします。振盪しながら30 °Cで30分間インキュベートします。80 µLのジメチルスルホキシドを加え、緩やかに転倒混和してよく混ぜ合わせます。42 °Cのウォーターバスで15分間ヒートショックを行い、その間2〜3分ごとに撹拌します。細胞懸濁液を氷上で2分間冷却した後、遠心分離して酵母を回収します。各細胞ペレットを100 µLの1× TEに再懸濁します。ベイトおよびターゲットの両プラスミドに選択圧を維持するため、細胞を適切な最小SD培地プレートに播種します。プレートを倒立させた状態で30 °Cで4〜5日間インキュベートします。酵母コロニーの直径が約2 mmになった時点で、本アッセイに使用可能となります。新しく調製したZバッファーおよびX-gal溶液2.5 millilitersを、清潔な100-millimeterプレートにピペットで分注し、セルロースフィルターペーパーをプレート内に配置します。解析対象の酵母コロニーが付着した新しいフィルターペーパーを、プレートの表面に重ねます。ピンセットを使用してフィルターペーパーをプレート上に軽く擦り付け、コロニーが密着するまで約5分間放置します。適切な個人用保護具を着用し、フィルターペーパーを慎重に持ち上げ、液体窒素の中に30秒間浸します。凍結したフィルターペーパーを室温で2分間解凍させます。100 mmプレート内のあらかじめ浸漬させたフィルターペーパーの上に、コロニー面を上にしてフィルターペーパーを置き、青色コロニーが出現するまで30 °Cでインキュベートします。トランスフェクションの前日に、100 mmペトリ皿で培養しているHEK293細胞に培地を添加し、翌日に細胞密度が60～70%になるように調整します。加湿インキュベーター内で16～18時間培養します。トランスフェクション当日に、24 µgのプラスミドDNAを60 µLの2.5 M塩化カルシウムおよび滅菌脱イオン水で希釈し、全量を600 µLにします。ボルテックスで混ぜ合わせる。600 µLの2X HEPES緩衝生理食塩水を含む50 mLチューブに、ボルテックスで絶えず激しく攪拌しながら、プラスミドDNAおよびカルシウム溶液を滴下して加える。室温で20分間インキュベートし、リン酸カルシウム・プラスミドDNA複合体を形成させる。20分間のインキュベーション後、短時間ボルテックスし、溶液をHEK293細胞に滴下して、ペトリ皿の全表面を覆われるように加えます。細胞を37 °C、5% CO₂条件下でインキュベートします。約6時間後、増殖培地を交換し、細胞をインキュベーターに戻します。トランスフェクションから24時間後、プロトコルの記載に従って細胞を回収します。細胞ペレットを500 µLの氷冷したホモジナイズ緩衝液で再懸濁し、ガラスビーズを入れた1.5 mLチューブに細胞懸濁液を移します。1 mmシリンジに取り付けた細い針を用いて、氷上で細胞をホモジナイズします。チューブのキャップを閉じたまま、針でキャップを貫通させ、ガラスビーズを用いて細胞懸濁液を激しく分散させます。4°Cで1500 ×g、10分間遠心分離し、核および未破砕細胞を除去します。共免疫沈降または架橋実験に使用するため、核後分画である上清を回収します。本手順を開始するには、核後細胞画分を0.5% CHAPSで可溶化し、4°Cで絶えず撹拌しながら少なくとも2時間インキュベートします。4°Cで20,000 ×gにて10分間遠心分離し、不溶性物質をペレット化します。上清を回収して保存してください。これを細胞溶解液と呼びます。プロトコルの本文に従い、免疫沈降バッファーでProtein Aアガロースビーズを調製します。Protein Aを含むチューブ1本に、免疫沈降抗体を1 µg加えます。陰性対照として、もう一方のプロテインA含有チューブに1 µgの非免疫IgGを加えます。4 °Cで、常に攪拌しながら少なくとも2時間インキュベートします。遠心分離によってビーズを回収し、ピペッティングにより上清を慎重に除きます。細胞溶解液 200 µL を、抗体と Protein-A ビーズを含む 2 本のチューブそれぞれに分注します。抗原抗体反応を促進させるため、4 °C で絶えず撹拌しながら 2 時間以上インキュベートします。ビーズを回収し、免疫沈降バッファー 200 µL で洗浄します。混合しながら4 °Cで10分間インキュベートします。3回洗浄した後、ピペッティングにより上清を慎重に取り除きます。ビーズに30 µLのタンパク質負荷バッファーを加え、4 °Cで1500 ×gにて2分間遠心分離します。後述するSDS-PAGEおよび免疫ブロッティングに使用するため、共免疫沈降（co-IP）サンプルを含む上清を回収します。化学的架橋を行うには、核除去後の細胞画分を遠心分離し、タンパク質凝集物をペレット化します。上清を回収し、20 µLずつ8つの分注管に分注します。1つのサンプルにのみ、0.0025% (v/v) グルタルアルデヒドを加えます。タイマーを開始し、室温で規定の時間、グルタルアルデヒドを反応させます。指定の時間に2% (v/v) ヒドラジンを用いてグルタルアルデヒドの反応を停止させ、5 µL の 5X プロテインローディングバッファーを加えてタンパク質を変性させます。酵母ツーハイブリッド法を用いて、AD4Lおよび末端断片との相互作用を調べるため、リアノジン受容体ペプチド配列の全長をカバーするオーバーラップ構築物をスクリーニングした。コロニーリフトフィルターペーパーを用いたβ-galアッセイの結果、BT4L/AD4Lペアのみに鮮やかな青色のコロニーが認められ、AD4Lが自身と相互作用することが示された。BT8/AD4Lペアでは淡い青色のコロニーが検出され、C末端領域との二次的な弱い結合が示唆された。液体β-galアッセイによる定量的な結果から、BT4L/AD4Lの強力な相互作用が示され、その強度はP53タンパク質（pVA3）とSV40大T抗原（pTD1）との既知の結合と同等であった。一方、BT8/AD4Lの相互作用はかなり弱かった。酵母ツーハイブリッド法によるこれらの知見は、哺乳類細胞株においてHAタグ付きAD4LおよびcMycタグ付きBT4Lを一過性発現させた後に行った共免疫沈降実験によって補強された。抗体2 HAによるHAタグ付きAD4Lの直接的な免疫共沈が観察され、cMycタグ付きBT4Lは抗HA免疫共沈においてのみ回収された。cMyc BT4Lを発現する細胞ホモジネートに対して化学架橋を行い、続いてcMyc抗体を用いたSDS-PAGEおよびイムノブロッティングを実施した。100 kilodaltonのモノマーに加えて、約400 kilodaltonの高分子量タンパク質バンドが時間依存的に検出され、リアノジン受容体およびターミナスの四量体形成が示された。リン酸カルシウム沈殿法による哺乳類細胞へのトランスフェクションを行う際は、効率的にエアレーションさせるため、大きなチューブ内でリン酸緩衝液を絶えず激しくボルテックスしながら、プラスミドDNA溶液を非常にゆっくりと添加することが重要です。これらの手順の後、カルシウムイメージングにおける共焦点顕微鏡観察などの他の手法を実施できます。これらの技術は、生細胞におけるリアノジン受容体チャネルの局在やカルシウム放出特性など、さらなる疑問を明らかにするのに役立ちます。これらの技術の開発により、転写因子、酵素、イオンチャネル、および受容体の活性を調節する基本的な生物学的プロセスであるタンパク質のホモオリゴマー化を評価することが、細胞シグナル伝達という多様な分野の研究者にとって可能となりました。

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