Name: 使用モデルタンパク質への非標準アミノ酸の残基特異的取り込みエシェリヒア・コリ無細胞転写翻訳システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 学ぶ非標準アミノ酸の残基特異的取り込み法。エシェリヒア・コリ無細胞転写翻訳システムを用いてモデルタンパク質を修飾し、構造生物学や創薬研究での応用を可能にする革新的なタンパク質工学技術です。

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E.G. Worst と A. Ott は、共同研究センター SFB 1027 内の Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) とザールラント大学による財政支援を認めています。E.G. Worst、A. Ott および V. Noireaux は、さらに Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO) による財政援助を認めています。著者は、Tobias Baumann と Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) の批判的な読み物に感謝します。

著者らは開示するものは何もない。

- 簡単に-する残基特異的タンパク質にncAAsを組み込むための実行可能な戦略として、無細胞発現系を使用して、提示されています。この目的のために、粗抽出物は、目的のタンパク質、エネルギーバッファ及び対応するアミノ酸のためのベクターDNAコードが補充されます。粗抽出物のアリコート量が粗抽出タンパク質濃度34に依存することに注意してください。無細胞発現効率は、ベクターDNA構築濃度に応じて最適化されます。エネルギーバッファ成分の体積は、無細胞発現モデルタンパク質の高い収量を可能にするために最適化されたMG-及びKグルタミン酸濃度の関数として変化します。 取り込み実験の予備的な評価は、未精製、無細胞反応媒体のSDS-PAGEを行うことにより得ることができます。より詳細な分析のために、HPLC-ESI質量分析は、完全な、残基特異的incorをチェックするための手段として提案されていますNCAAのポレーション。後者のための準備として、スピンカラムシステムは、Hisタグ精製を可能にし、私たちは、このプロトコルで使用する小容量との交流をバッファするために使用されています。 HPLC-ESI質量分析を含む、全体のプロトコルは、2日以内に行うことができます。これは、任意の特に重要なステップが含まれていません。しかし、MG-とK-グルタミン酸のと同様に、ベクターDNAの濃度の最適化は、モデルタンパク質の高収量を表現するために重要です。高効率発現ベクターpBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-gene_of_model_protein-T500の使用を強くお勧めします。 Hisタグ付きタンパク質の溶出が原因で高濃度のイミダゾール（&gt; 150 mMの）および質量分光分析49における高いバックグラウンドノイズを発生する例えばNaH 2 PO 4（&gt; 300 mM）のまたはのNaCl（&gt; 50 mM）のような他の塩に通常であります。適切なタンパク質貯蔵緩衝液でこのような溶出緩衝液の交換は、モデルproteを安定化および大幅には、質量分光分析の間にバックグラウンドノイズを低減します。 その結果、モデルタンパク質内のすべての6つの位置でのArgを置き換えることができます。発現系では、何のArg残基は検出できません。これはさらに枯渇戦略29,30を必要とする他の発現系と比較してのArg類似体の残基特異的組み込みを簡素化します。提示された無細胞アプローチは、缶の毒性によるものであるin vivoでのアプローチの固有の制限、または単一のタンパク質の生産戦略24,31内のmRNA配列に強い依存性を回避します。 インビトロ系で採用に反して、缶のインビボでの切断はホモセリンするとヒドロキシグアニジンは、31を発生しません。 しかし、無細胞系は、HYLなどの類似体と競合するのLysの十分な量を保持しています。 HPLC-ESI質量分光分析は、C、モデルタンパク質の両方が含まれていることを示していますanonicalならびに異なる割合で非標準のアナログ。 Lysの残基特異的組込みは、一般的には可能ですが、ncAAsの認識のために最適化された完全な置換、さらに枯渇戦略、または特別に設計さのaaRSとtRNAのために開発される必要があります。 私たちは、正規のものと同じ濃度でNCAAを追加することにより、無細胞発現し、修正されたモデルタンパク質の優れた収率を達成しました。取り込み効率が組み込まれるNCAAの性質に依存します。さらに高い収率はまだNCAAの濃度を最適化することにより実現可能であるかもしれません。 提示された結果であれば、それらは標準的な内因性翻訳システムによって受け入れられるようncAAsの残基特異的組み込みのための採用システムの適用可能性を実証します。類似CAA disturの残基場合に、特定ncAAsの残基特異的取り込み、一つのさらなるニーズをチェックします発現系B。 無細胞転写翻訳系は、異なる要求54に応答するために、異なる生物から操作することができます。すべてのE.ここで紹介する無細胞系の大腸菌転写-翻訳機械は、バクテリオファージの使用を有効にしてE.大腸菌プロモーターは、それらは並行してまたは連続してカスケード55に作用することができます。一般的な適用性と使いやすさは、メソッドのアミノ酸の毒性および治療用途でのさらなる研究のための強力なツールとなっています。

遺伝コードは、生物圏に普遍的です。その時々セレノシステイン1またはピロリジン2によって拡張される20正規アミノ酸のセットをコードします。それは、タンパク質に折り畳まれるアミノ酸のチェーンへのtRNAの助けを借りて、遺伝コードを変換するリボソームです。標準的なアミノ酸の官能基は、翻訳後修飾と組み合わせて、タンパク質機能3,4の非常に広い範囲に寄与する。原理的には、標準的なによるアミノ酸の限定されたセットに機能的な制限は、さらに新たな化学および新しい機能3,4を可能にする非標準アミノ酸（ncAAs）を組み込むことによって克服することができます。 部位特異的または残基特異的組み込み：ncAAsの取り込みのための2つの相補的なアプローチがあります。前者の方法は、アミノアシルtRNAシンセのカノニカル集合ので、かなりの技術的な困難を伴いますetases酵素（aaRS）とtRNAが内在性翻訳機構と相互作用してはならない直交のaaRS-tRNAのペアによって拡張されなければなりません。慎重な工学に基づいた、このアプローチは、所望のタンパク質部位での単一点突然変異としてncAAsを内蔵しています。 ncAAsの部位特異的組み込みを遺伝子操作して、標準的なアミノ酸（CAA）、5-9コドン通常停止に割り当てられていないコドンによってコードされています。このメソッドは、指定されたサイトではなく、全体タンパク質10-13全体の機能の変化を伴います。 これとは対照的に、残基特異的組み込みは、標準的な翻訳機構によって非標準アミノ酸の誤認識に依存しています。混入が原因のaaRSの基質特異性の欠如が原因で発生します。コーエンと同僚14のワーク上に構築されたncAAsの残基特異的組込みは、それらの中で重要なアプリケーション3,10、タンパク質のバイオ直交ラベリング15-17につながっていますX線結晶18中のタンパク質のまたは構造解明。 天然のaaRSは、一般的に同形NCAA上で、それらの同族アミノ酸を好むように、 生体内残留物特異的組み込みで効率的には、通常、NCAAの標準的なアナログを合成することができない栄養要求性発現宿主を必要とします。宿主細胞は、類似CAAのみ低濃度を実現し、増殖培地中で培養されます。 NCAAでの連続補充と組み合わせて、その枯渇は、複数の正準規定の部位でのモデルタンパク質にNCAAを組み込むために発現宿主を強制します。部位特異的なアプローチとは対照的に、これは、一般にかなりタンパク質19,20の物理的および化学的性質を改変するためにつながる、タンパク質全体の構造に深い影響を与えます。それらは、他の多くのPROTに組み込まれているしかし、ncAAsのほとんどは、発現宿主3の成長阻害剤であります組換え遺伝子発現の間の関心のもの以外にもアインス。これは明らかに、in vivoでのアプローチを制限します。毒性であるか、またはタンパク質の構造に強い影響を有するアミノ酸のin vivo組込みは、特に困難なままです。しかし、これらの分子は、異常な機能を有するタンパク質を設計するために最も有望なの一つです。 一つの例は、毒性、非標準、天然に存在するL-カナバニン（CAN）、L-アルギニン（アルギニン）のアナログです。これは、影響し、ブロックのArg関連する規制や触媒反応経路を、そして生きた細胞中のその存在は即死3,21-23につながることができます。アルギニンの位置で、タンパク質への取り込みは、タンパク質の安定性21-23を低減することができます。得られた毒性、 大腸菌 （E. coli）および他の一般的な発現宿主中のタンパク質を含むカナバニンの発現が課題です。これらの理由から、完全なin vivoでの私すべてのArg位置で缶のncorporation適宜詳述単一タンパク質産生系を使用して、一度だけ24が確認されました。しかし、缶は、抗癌剤25-27として提案し、ヒト28における自己免疫疾患のための刺激としてれています。さらに、それは、その抗代謝、抗菌、抗真菌および抗ウイルス特性に関する種々の研究25の対象です。これらの特性は、効率的かつ簡単に行う表現する方法は、薬用医療・機能研究のためのタンパク質を含むことができますの需要を高めます。 インビボでの生産に接続されている多くの問題は、無細胞発現系を用いて回避することができるが、 インビトロでの残基特異的なアプローチは、不十分に検討されています。 L-トリプトファンアナログ29と複数のncAAs 30の無細胞残基特異的組み込みが報告されています。これらのメソッドは非常にefficに基づいていますT7 RNAポリメラーゼをient。 T7 RNAポリメラーゼは、それによって内因性の転写と比較して遺伝子の機能を低下させる、バクテリオファージのような転写を伴います。 すべてのArg位置でのモデルタンパク質への缶の完全な残基特異的組み込みは、最近、無細胞発現系32を使用して、31を報告しました。同じシステムのわずかな変更は、終止コドン抑制33を介してモデルタンパク質に異なるピロリジン類似体の部位特異的組み込みを可能にしました。採用無細胞系31から33 は、すべての E.に基づいています大腸菌転写-翻訳システム。オリジナルの転写-翻訳モジュールの多くを保持しながら、 - （組換えタンパク質の1mg / mlの0.5）32にもかかわらず、それは、効率的に、現在のバクテリオファージシステムのようなタンパク質の発現を可能にします。 この作業では、詳細なプロトコルがどのように残油に設けられています。ncAAsのUE固有の取り込みは、このすべてのEを使用して、実現することができます大腸菌無細胞系32。さらに、HPLC-ESI質量分析を介した適正な評価のために発現されたタンパク質を調製するためのさらなるステップが提案されています。この無細胞系の特性を展開するには、この作業は缶31の公開取り込みを参照してくださいだけでなく、非標準L-リジンアナログL-ヒドロキシリジンに関連する新たなデータを提供しません。 ncAAsの残基特異的組み込みのための以下のプロトコルは、最近Joveの34で発表されたプロトコルの適応です。後者のプロトコルは、標準アミノ酸で高効率な無細胞発現を実行する方法について説明します。また、粗無細胞抽出物、アミノ酸溶液、エネルギー原液と、このアプローチで使用されるエネルギーバッファの準備を示します。以下のプロトコルは、前のPと比較して変更されたステップに焦点を当てncAAsの残基特異的取り込みを可能にするためにrotocol。較正されたピペット、低結合ピペットチップおよびマイクロ遠心管を調製するために推奨されています。以下では、アミノ酸のIUPACの略語が使用されます。

<table><tbody><tr><td>保護メガネ</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z758841</td><td></td></tr><tr><td>ニトリル手袋 (サイズ S)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z768960</td><td>カタログ番号 その他のサイズ: M は Z768979、L は Z768987、XL</td></tr><tr><td>は Z768995 Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>Microbalance Discovery DV114CM</td><td>Ohaus, Greifensee,スイス</td><td>80104140</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ(L 6 5/8インチ、ステンレス鋼、ロッド径0.09インチ)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z243213</td><td></td></tr><tr><td>L-Canavanine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C9758</td><td>急性毒性:眼鏡、防塵マスク、保護手袋を着用してください</td></tr><tr><td>ヒドロキシリジン(ラセミ混合物)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H0377</td><td></td></tr><tr><td>クライオ手袋(サイズS、耐水性)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z183490</td><td>カタログ番号その他のサイズ:MのZ183512、LのZ183520、XL</td></tr><tr><td>RTSアミノ酸サンプラー</td><td>のZ183539 Biotechrabbit、Hennigsdorf、ドイツ</td><td>BR1401801</td><td>アミノ酸ストック溶液の自家製調製については、このプロトコル35に従い、固体アミノ酸キットLAA21-1KT、L-プロリン(81709-25G)、L-システイン(30089-25G)、L-ヒスチジン(53319-25G)およびL-リジン(L5501-5G)&nbsp;(すべて米国セントルイスのSigma-Aldrichから)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>23160</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (from E. coli, パックサイズ 100mg)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>10109541001</td><td>パックサイズ500 mgのカタログ番号は10109550001</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>NAD (from yeast )</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A9501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Mg-グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>K-グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td><td>Addgene, Cambridge, USA</td><td>Plasmid #40019</td><td></td></tr><tr><td>4-20% プレキャスト Tris-Glycine ゲル (10 cm x 10 cm x 1 mm、10 コース)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-ビーベラウ / ロダウ,</td><td>ドイツ TG 81610</td><td></td></tr><tr><td>SDS ランニングバッファー (10 x 濃縮液、5,000 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-ビーベラウ / ロダウ, ドイツ</td><td>TG 50001</td><td></td></tr><tr><td>SDS ローディングバッファー (2 x 濃縮液, 50 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-ビーベラウ / ロダウ, ドイツ</td><td>TG 05002</td><td></td></tr><tr><td>未染色タンパク質マーカー、広範囲 (2-212 kDa)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>P7702S</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1060091011</td><td>吸入、皮膚との接触、飲み込んだ場合の毒性: 保護手袋を着用し、ヒュームフードの下で作業</td></tr><tr><td>酢酸 (99.8%)</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>20104.447</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>902120</td><td></td></tr><tr><td>His-Spin Protein Miniprep kit</td><td>Zymo Research Europe, Freiburg, Germany</td><td>P2002</td><td>Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol, 99%</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>24397.296DB</td><td></td></tr><tr><td>CentriPure Z25 mini spin columns</td><td>Genaxxon bioscience, Ulm, Germany</td><td>CP-0205-Z100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium</td><td>chloride Sigma-Aldrich, St. Louis,USA</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator 5301</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5301 000.210</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals, Santa Ana, USA</td><td>113012032</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>ビーズ鼓動チューブ (ポリプロピレンマイクロバイアル)</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>522S</td><td></td></tr><tr><td>ビーズ, 0.1&nbsp;mm径</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA protein assay Kit</td><td>Bio-Rad, M&uuml;nchen、ドイツ</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、米国</td><td>C1919</td><td></td></tr>キュ<tr><td>ベット、1.5&nbsp;ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td><td>Bio-Rad, M&uuml;nchen, Germany</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384-well optical bottom plates</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>Nunc sealing tape</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>232701</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega, Madison, USA</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic solution</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性溶液</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp;L遠心分離機ボトル</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>A98813</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp;L Erlenmeyer フラスコ</td><td>Kimble Chase, Vineland (NJ), USA</td><td>26500-4000</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26XP centrifuge</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>393127</td><td>または、1Lボトルを遠心分離できる同等の遠心分離機。</td></tr><tr><td>Forma 480 オービタルシェーカー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、USA</td><td>480</td><td>または、胸のサイズ6 x 4 Lを振ることができる同等のシェーカー。</td></tr><tr><td>JLA-8.1000ローター</td><td>ベックマン・コールター、ブレア、米国</td><td>363688</td><td>または同等の5,000 x gローター 上記の遠心分離機用で、1Lボトルを遠心分離できます。</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>368831</td><td>または、2mlの反応チューブを遠心分離できる同等の遠心分離機です。</td></tr><tr><td>ヒーティングブロック HLC HBT 130</td><td>Labexchange, Burladingen, Germany</td><td>24465</td><td>または、反応チューブ内のサンプルを最大100°Cまで加熱できる同等のヒーティングブロックです。</td></tr><tr><td>エッペンドルフ MiniSpin 遠心分離機</td><td>エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ</td><td>5452000018</td><td>または同等の遠心分離機で、2mlの反応チューブを遠心分離することができます。</td></tr><tr><td>IKA Vortex 3 (4 mm オービタルシェーカー径, 0 - 2,500 rpm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z654760</td><td>または同等のボルテックス。</td></tr><tr><td>スコッツマンAF103アイスフレーカーマシン</td><td>K&auml;lte-ベルリン、ベルリン、ドイツ</td><td>AF103</td><td>または同等のアイスフレーカーマシン。</td></tr><tr><td>MyTemp ミニデジタルインキュベーター</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z763314</td><td>または、29°Cでサンプルを加熱できる同等のインキュベーター。</td></tr><tr><td>EcoCell電気泳動セル/チャンバー</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Germany</td><td>AN12005</td><td>または同等の電気泳動チャンバーは、上記のプレキャストゲルまたは他のゲルを使用して垂直ゲル電気泳動を行うことができる。</td></tr><tr><td>電気泳動セル/チャンバー用Power-phor電源</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Germany</td><td>AN12001</td><td>または、上記の使用済み電気泳動セル/チャンバーに電力を供給できる同等の電源</td></tr><tr><td>VWRシグネチャー 人間工学に基づいた高性能シングルチャンネル可変容量Pipettorsスターターキット1</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>613-5278</td><td>または、同じ精度で同様の容量をピペットできる同等のマイクロピペット</td></tr><tr><td>VWRシグネチャー 人間工学に基づいた高性能シングルチャンネル可変容量ピペット スターターキット2</td><td>VWRインターナショナル、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>613-5279</td><td>または、同じ精度で同様の容量をピペットできる同等のマイクロピペット</td></tr><tr><td>Pipetmanチップ ダイヤモンドD10ST (0.1-10 &micro;l)</td><td>ギルソン、ミドルトン、米国</td><td>F171101</td><td>または同等の低結合ピペットチップ 同じ精度で同様のボリュームをピペット</td></tr><tr><td>できる ピペットマンチップ ダイヤモンドD200ST (2 - 200 &micro;l)</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171301</td><td>または同等の低結合性ピペットチップで、同じ精度で同量のピペット</td></tr>マンチップをピペット<tr><td>できる ダイヤモンド D1000ST (100 - 1,000&nbsp;&マイクロ;l)</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171501</td><td>または同等の低結合ピペットチップで、同じ精度で同量のピペットを使える</td></tr><tr><td>50 ml 遠心分離チューブ スクリューキャップ付き (滅菌)</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>50-0156</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 遠心分離チューブ スクリューキャップ付き (滅菌)</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>14 ml ポリプロピレンチューブ (丸底、2 ポジションベントストッパー、滅菌)</td><td>Greiner Bio-One、フリッケンハウゼン、ドイツ</td><td>187262</td><td></td></tr><tr><td>Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC カラム (3 &micro;m 粒径 L x I.D. 10 cm x 2.1 mm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>567227-U</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1260 HPLC machine</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G1312B</td><td></td></tr><tr><td>6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G6530BA</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>270717</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega マイクロプレートリーダー</td><td>BMG Labtech, Ortenberg, Germany</td><td>415-101</td><td>または、発現したモデルタンパク質の蛍光を測定できる同等のマイクロプレートリーダー</td></tr><tr><td>Hanna Checker pH meter</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z351091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS 用ギ酸溶離液添加剤</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>56302</td><td></td></tr></tbody></table>

使用モデルタンパク質への非標準アミノ酸の残基特異的取り込み<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;無細胞転写翻訳システム

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

アミノ酸の標準セットは、タンパク質機能の非常に広い範囲につながります。それにもかかわらず、残基のセットは、まだ潜在的なタンパク質の用途に制限を課しています。非標準アミノ酸の組み込みは、この範囲を拡大することができます。非標準アミノ酸の組込みのための2つの相補的アプローチがあります。部位特異的組み込みのために、内因性の標準的な翻訳機械に加えて、直交アミノアシルtRNAシンテターゼ-tRNAのペアは正規のものと相互作用しないように提供されなければなりません。したがって、標準的なアミノ酸、通常は終止コドンに割り当てられていないコドンは、また、必要とされます。この遺伝コードの拡張は、タンパク質内の単一の、所与の部位での非標準アミノ酸の取り込みを可能にします。ここで紹介する作品は、遺伝コードは、内因性翻訳システム内で再割り当てされ残基特異的取り込みを説明します。翻訳機械Aすなわち正準規定の場所でそれを組み込むための代理として非標準アミノ酸をccepts、タンパク質中の標準的なアミノ酸のすべてのオカレンスは、非標準1で置き換えられます。非標準アミノ酸の組み込みは、かなり変更された物理的および化学的特性を引き起こし、タンパク質の構造を変更することができます。それらは内因性タンパク質を修飾するため、非標準アミノ酸類似体は、多くの場合、 生体内のタンパク質産生を制限する、発現宿主のための細胞増殖抑制剤として作用する。タンパク質への毒性非標準アミノ酸のin vivo組込みは特に困難なままです。ここでは、非標準アミノ酸L-カナバニンによるL-アルギニンの完全な交換のための無細胞アプローチが提示されています。これは、in vivo発現の固有の困難を回避します。また、マススペクトル分析のための標的タンパク質を調製するためのプロトコルが含まれています。 L-リジン、L-ヒドロキシリジンで置き換えることができることが示されています低い効率ではあるが。原則的に、任意の非標準アミノ酸類似体であれば、内因性のインビトロ翻訳システムがそれを認識するように提示された方法を用いて組み込むことができます。

このプロトコルは、モデルタンパク質へncAAsの無細胞残基特異的取り込みを介して案内します。これは、取り込み実験及び適切なHPLC-ESI質量分光分析のためのモデルタンパク質を調製するためのさらなる工程の予備的評価のためにSDS-PAGEを提案しています。 ここでは、代表のArgアナログの無細胞残基特異的取り込みの結果することができ、同様のLysアナログL-ヒドロキシリジン（HYL）が提示されています。異なるアミノ酸溶液、エネルギーバッファは、モデルタンパク質との無細胞反応のためのベクターDNAコードは、上述のように調製されます。基準無細胞反応は、20 CAASからなるアミノ酸溶液が設けられています。各実験では、陰性対照の無細胞反応は、問題のNCAAの標準的なアナログを欠くアミノ酸溶液が供給されます。各APPRのためoachは、一つのセルの無反応がCAAは、非標準アナログにより置換されたアミノ酸溶液、の存在下でのモデルタンパク質を発現します。 Hisタグ精製、緩衝液交換およびHPLC-ESI質量分析は、上記のプロトコルに従って実行されます。 モデルタンパク質は、C末端Hisタグ付きdeGFP 32、EGFP 53の短縮版です。その一文字アミノ酸配列は、（補足資料2）に見出すことができます。このモデルタンパク質は、6 ArgおよびLysの18位が含まれ、 それぞれの発現ベクターは、pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500です。 NCAAの完全な取り込みの場合、1は20 CAASの1が欠落しているので、ネガティブコントロール反応は、deGFPを発現しないと仮定することができます。反対に、deGFPは、他の2つの反応において検出可能でなければなりません：REFEでネイティブ1無細胞反応とNCAAが設けられている無細胞反応で修飾されたタンパク質をrence。 図1Aは、CAN取り込み実験の予備的なSDS-PAGEの評価を示します。基準無細胞反応は、最高deGFP発現レベルを有します。缶を備えている無細胞反応において、deGFPは、わずかに低い濃度で発現されます。いいえdeGFP発現は陰性対照中で検出することができません。このSDS-PAGEの結果は、標的タンパク質deGFPに缶の成功取り込みのための良好な指標です。 、deGFPに図1Bに視覚化精製されたモデルタンパク質の両方を缶の仮定の完全な組み込みを証明するために、HPLC-ESI質量分析により分析される。 図1Cは、精製deGFP分子のデコンボリューションした質量スペクトルを示します。 DEGFのデコンボリューションした質量<html>基準無細胞反応で発現されるPは26,192.8ダあります。 deGFPについて26202.5ダの質量が表示され、無細胞反応を含む缶で表現。完全に缶に置き換えられネイティブdeGFP6ArgおよびArgを有する改変deGFP6Canの予想質量はそれぞれ、26193ダおよび26204ダです。 deGFP6Can 1.5ダの質量差は、スペクトルのデコンボリューションの誤差の範囲内です。したがって、すべての6のArg位置でdeGFPに缶の完全な取り込みが確認されました。 減少強度の2つのピークは、ネイティブdeGFP6Argとその成熟した蛍光団を達成しませんでした修正deGFP6Canに対応しています。フルオロフォアは、自己触媒的酸化に続いて、H 2 O分子の脱離により生成されます。これは、このプロセスを続行しない場合は20ダ増加質量をもたらします。 PG &quot;/&gt; 無細胞発現させ、精製deGFP分子の取り込みができます実験およびHPLC-ESI質量分析の 図1. SDS-PAGE評価。（A）SDS-PAGEを使用して組み込むことができ、実験の予備的評価。左から右へ：タンパク質標準、基準の無細胞反応、陰性対照との無細胞反応缶の代わりにアルギニンの提供。 （B）Hisタグ精製後のSDS-PAGEおよび発現deGFP分子の緩衝液交換。左から右へ：タンパク質標準、基準反応から精製deGFP、反応を含む缶から精製deGFP。 （C）HPLC-ESI質量分光法による缶の完全な取り込みの確認。完全に缶に置き換えネイティブdeGFPおよびArgを有する改変deGFPの予想される質量は、それぞれ、26193ダおよび26204ダです。各スペクトルは、最も高い強度（カウント）に正規化されます。ピーク位置は、示されていますダインチ可視化のために、ゲルのレーンはゲル画像から抽出され、一緒に結合し、グレースケールフォーマットに変換され、サイズが最適化され、コントラスト並びに輝度が向上します。オリジナルゲルのレーンは、補足資料3に示されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図2Aは、HYLの取り込み実験の予備的なSDS-PAGEの評価を示します。 HYLが設けられている無細胞反応において、deGFPが表現されます。最初の実験とは対照的に、弱いdeGFPバンドは陰性対照反応で観察することができます。これは、無細胞反応でのLys残基が原因である可能性があります。これは、LysもHYLどちらが追加されている負の対照反応、中にかすかなdeGFP表現を可能にします。 Hの場合<html> PLC-ESI質量分析、HYLを備えた無細胞反応のdeGFP分子が精製され、バッファが（ 図2B）で交換されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> HYL取り込み実験の 図2 のSDS-PAGEの評価 （A）左から右へ：HYLおよびタンパク質標準を含有する陰性対照の無細胞反応、無細胞反応。 （B）Hisタグ精製後のSDS-PAGEおよび発現deGFP分子の緩衝液交換。 HYL含む反応およびタンパク質標準から精製deGFP：左から右へ。可視化のために、ゲルのレーンはゲル画像から抽出され、一緒に結合し、グレースケールフォーマットに変換され、サイズが最適化され、コントラスト並びに輝度が向上します。オリジナルゲルのレーンは、補足資料3に示されています。F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図3は、精製deGFP分子のデコンボリューションした質量スペクトルを示す。 図3Aは、無細胞反応中に既に存在するLys残基の仮説を確認します。スペクトルの優勢なピークがネイティブdeGFP（：26193ダ予想質量）に対応しています。再び、それらのフルオロフォアを発症しなかった20ダより高い質量のdeGFP分子を検出することができます。リジン残基が優先的にネイティブdeGFP18Lysの高発現レベルにつながるリジルtRNAをシンテターゼによりtRNAのLysの上にロードされています。 HYL及びLys間の質量差は16ダです。原因（すべての可能なdeGFP種が生成されるのLys残基に競争の中でdeGFP18HylあるHYLの存在に、deGFP17Hly + 1Lys、...、deGFP16Hyl + 2Lys）（ 図3B）。確かに、deGFP1Hyl + 17Lysのピークは、そのフルオロフォア（ 図3A）と、いくつかのピークの質量が予想される質量から2つ以上のダを異なる点を生じなかったネイティブdeGFPのピークと重なっています。これらの質量差は、deGFP種の少量に高いノイズに起因することができます。しかし、HYLは一般的に無細胞系として援用されます。更なる改善は、無細胞反応でのLys残基を廃止するために行われなければなりません。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> （成熟フルオロフォア26213ダことなく、フルオロフォア26193ダと予想される質量を）HYLを含有する無細胞反応の精製deGFP分子の 図3 HPLC-ESI質量分析 （A）ネイティブdeGFP18Lysは、主に検出されます。 （B）倍率は、すべての可能なdeGFP種（deGFP18Hyl、deGFP17Hly + 1Lys、deGFP16Hyl + 2Lys、...、deGFP1Hyl + 17Lys）の存在を明らかにしています。それらの予想される質量26193ダ+ Nは、16 DA（N = 1、...、18）×ています。スペクトルは、その最高強度（カウント）に正規化されます。ピークの位置はダに示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> 補足資料1.計算テンプレート。セクション2では、エネルギーバッファマスターミックスの調製は、30μlの最適MG-それぞれ3 mMのと30mmのK-グルタミン酸濃度の粗抽出物のアリコートを用いて例示されています。この例では、3つのエネルギーバッファのアリコートをもたらすマスターミックス量をもたらします。秒でション3、無細胞反応の調製は、無細胞反応で10nmの最適なベクターDNA濃度につながる90 nmのDNAストック溶液を用いて例示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 粗抽出量：28μlを、最適のMg-グルタミン酸：2 mMの、最適なK-グルタミン酸：40 mMの、多数の適切なトレーサビリティのために、計算テンプレートの使用は、上記の例とは異なるこれらの典型的な値を挿入することによって例示されます100、無細胞反応における最適ベクトル濃度：8 nMで、DNAベクター原液：150 nMの必要なバッファーのアリコートの。 まず最初のテンプレート部分のオレンジ色のフィールドに粗抽出量として28μLを入力します。そして、第2のテンプレートセクションに2 mMの入力最適なMG-とオレンジフィールドにK-グルタミン酸濃度をd 40 mMの。考慮すると、最適なMG-とK-濃度、15μlのエネルギー緩衝液の組成、ならびに対応する、スケールアップ16μlのアリコートが計算されます。以下は、それに応じてエネルギーバッファアリコート（16μl）を、所望の数として100を入力します。 100 mMのMgをグルタミン酸ストック溶液の204μlの、3 M K-グルタミン酸ストック溶液の136μlを、14倍のエネルギーソリューションの728.73μlを、510μlの：テンプレートには、次のように1700μlのマスターミックスのための異なる緩衝液成分のボリュームを適応させます40％のPEG-8000および121.27μlの滅菌のddH 2 O最後に、第3テンプレートセクションで、無細胞反応は、それぞれ、ベクターDNAストック溶液濃度の最適ベクトル濃度として8 nmおよび150 nMのを入力してください。テンプレートには、90μlに調製を完成させるために粗抽出物の28μlに添加しなければならないさまざまなコンポーネントのボリュームを適応させます無細胞反応を次のようにエネルギーバッファ15μlの、3異なる合成アミノ酸溶液の1の15μlを、ベクターDNA溶液（150 nM）をの4.80μlの、および無菌のddH 2 Oの27.20μLを<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> モデルタンパク質deGFPの補足資料2つの文字のアミノ酸配列。このモデルタンパク質は、6 Argおよび18 Lysの位置が含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> 補足資料3.全長、各個人の中で提示されたゲルの写真を提示し、図1及び2に対応する修正されていないゲルのレーンのゲルのレーン<html> ubfigureは同じSDSポリアクリルアミドゲルから抽出されます。 図1及び図2において、これらのレーンは、プレゼンテーションのために一緒に結合されました。タンパク質標準のバンドの分子量は、図の横に示されています。 （A.1） 図1Aのuncroppedのゲルのレーン。左から右へ：タンパク質標準、基準の無細胞反応、陰性対照との無細胞反応缶の代わりにアルギニンの提供。 （A.2） 図1Bのuncroppedのゲルのレーン。左から右へ：タンパク質標準、基準反応から精製deGFP、反応を含む缶から精製deGFP。 （B.1） 図2Aのuncroppedのゲルのレーン。陰性対照の無細胞反応、HYLおよびタンパク質標準を含有する無細胞反応：左から右へ。 （B.2） 図2Bのuncroppedのゲルのレーン。 HYL含む反応およびタンパク質標準から精製deGFP：左から右へ。D / 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

非標準的なアミノ酸類似体のタンパク質への残留特異的な取り込みのための使いやすい無細胞発現プロトコルが、医学、薬学、構造、機能研究のために紹介されています。

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

この手順の全体的な目的は、無細胞発現システムを用いてモデルタンパク質に非天然アミノ酸アナログを残基特異的に導入し、その下流解析を行うことです。この手法は、タンパク質構造における非天然アミノ酸の役割など、医薬および構造生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、生存している宿主が存在しないため、毒性のあるアミノ酸をモデルタンパク質に導入できることです。実験を開始するには、20種類の天然アミノ酸（CAA）のフルストック溶液と、あらかじめ調製した非天然アミノ酸（ncAA）ストック溶液を室温に戻します。溶液が融解したら、頻繁にボルテックスして沈殿したアミノ酸を再溶解させ、アミノ酸を氷上に置きます。次に、1.4 mLの滅菌二回蒸留水を15 mL centrifuge tubeに移し、氷上に置きます。各アミノ酸ストック溶液を175 µLずつ順番に添加し、添加ごとにチューブを十分にボルテックスして、溶液を再び氷上に置きます。すべてのアミノ酸を添加したら、チューブを十分にボルテックスします。溶液が可能な限り透明になるまでインキュベートします。アミノ酸マスターミックス溶液を1.35 mLずつ3等分して1.5 ml反応チューブに入れ、氷上に保持します。最初の分注量に、ncAAのアナログであるCAAの168 mMストック溶液を50 µL添加し、20種類すべてのCAAを含むアミノ酸溶液を作成します。溶液を十分にボルテックスした後、チューブを再び氷上に置きます。溶液を反応チューブに分注し、「plus CAA」とラベルを貼ります。分注液を液体窒素で急冷凍結し、-80 °Cで保存します。次に、アミノ酸マスターミックスの2番目の分注量に滅菌二回蒸留水を50 µL添加して、19種類のCAAを含むアミノ酸混合液を調製し、溶液を十分にボルテックスした後、氷上に置きます。溶液を分注し、チューブに「minus CAA」とラベルを貼ります。最後に、最後の1.35 mLにncAAの168 mMストック溶液を50 µL添加し、19種類のCAAとncAAを含むアミノ酸混合液を調製します。混合物を十分にボルテックスし、再び氷上に置きます。チューブを分注し、ラベルを貼り、凍結保存します。氷上で、30 µLの粗抽出液（plus CAA分注液、minus CAA分注液、ncAA分注液の各1本）、3本のエネルギーバッファー分注液、およびベクターDNA溶液を融解します。滅菌二回蒸留水を氷上に置きます。次に、エネルギーバッファーを15 µL添加してピペッティングし、溶液を穏やかにボルテックスして混合します。30 µLの粗抽出液に、plus CAAアミノ酸溶液分注液 15 µL、90 nMベクターDNA溶液 10 µL、および滅菌二回蒸留水 20 µLを添加します。陰性対照は、30 µLの粗抽出液にエネルギーバッファー 15 µL、minus CAA 15 µL、90 nMベクターDNA溶液 10 µL、および滅菌二回蒸留水 20 µLを添加して設定します。ncAA反応は、30 µLの粗抽出液にエネルギーバッファー 15 µL、plus ncAA 15 µL、90 nMベクターDNA溶液 10 µL、および滅菌二回蒸留水 20 µLを組み合わせて進めます。その後、すべてのチューブをインキュベートします。SDS-PAGEを行う10分前に、粘性のある各無細胞反応液 1 µLを、反応チューブ内で滅菌二回蒸留水 4 µLで希釈します。十分にボルテックスし、ミニ遠心機で短時間スピンダウンします。希釈した無細胞反応液 5 µLに、2Xローディングバッファー 5 µLを添加します。十分にボルテックスし、ミニ遠心機で液をスピンダウンします。反応チューブをヒーティングブロックに入れ、蓋が適切に閉まっていることを確認します。その間に、ランニングバッファーをゲル電気泳動槽に移します。加熱後、ミニ遠心機で液をスピンダウンします。スピン後、チューブを短時間ボルテックスし、再度スピンダウンします。タンパク質スタンダード 15 µLと各サンプル 10 µLをウェルに移し、電気泳動を開始します。カセットから慎重にゲルを取り出し、30分間固定します。その後、ゲルを染色液に移し、60分間染色します。染色後、ゲルを脱染色液に移し、60〜120分間処理します。His結合バッファーと無細胞反応液を等量混合し、混合液をピペッティングします。その後、チューブを穏やかにボルテックスします。次に、カラムシステムを組み立てます。ゲル樹脂が完全に溶解するまで、Hisアフィニティゲルのストック溶液を十分にボルテックスします。1 mLピペットチップを使用して、250 µLのゲル樹脂をカラムに移します。13,000〜15,000 ×gで5〜10秒間、カラムを遠心分離します。ゲル樹脂が完全に排出されたことを確認し、150〜300 µLの無細胞反応His結合バッファー混合液をカラムに移します。カラムを遠心分離します。通り抜け液を捨て、カラムを回収チューブに戻します。His洗浄バッファー 250 µLを添加し、タッピングおよび穏やかなボルテックスでゲル樹脂を再懸濁させます。カラムチューブを遠心分離します。回収チューブを捨て、カラムを新しい1.5 mL標準反応チューブに入れます。溶出バッファー 150 µLを添加し、タッピングと穏やかなボルテックスでゲル樹脂を再懸濁させます。その後、カラムを遠心分離して、精製タンパク質を溶出バッファーで希釈します。まず、ゲルろ過スピンカラムの底キャップを取り外し、次にトップキャップを取り外します。カラムを2 mL洗浄チューブに入れ、遠心分離してゲル保存バッファーを除去します。通り抜け液を捨て、最大400 µLのタンパク質保存バッファーを添加し、カラムを遠心分離します。タンパク質保存バッファーがすべてゲルにロードされるよう、このステップをもう一度繰り返します。カラムを新しい回収チューブに入れ、精製モデルタンパク質溶液 最大100 µLをゲルベッドの中心に慎重に直接添加します。カラムを遠心分離します。バッファー交換後、100 µLすべてのモデルタンパク質溶液をオープンチューブに入れ、回転真空濃縮機に入れます。濃縮機の蓋を閉め、30 °Cで回転を開始します。このSDS-PAGEは、標的タンパク質deGFPへのL-canavanine（Can）の導入成功を示しており、対照となる無細胞反応でdeGFPの発現レベルが最も高くなっています。無細胞Can反応ではdeGFP濃度がわずかに低くなり、陰性対照ではdeGFPの発現は検出されません。発現したdeGFP分子のHisタグ精製およびバッファー交換後に、SDS-PAGEを実施しました。HPLC

residue-specific-incorporation-noncanonical-amino-acids-into-model

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生物学

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