再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

この実験の全体的な目的は、ヒト多能性幹細胞を高効率かつ再現性高く心筋細胞へと分化させることです。このプロトコルは、バイオリアクターでスケールアップしたり、単一細胞培養に敏感な細胞株の分化に合わせて変更したりすることが可能です。本手法は、ヒト人工多能性幹細胞を用いた心疾患モデリングにおける重要な課題の解決に寄与します。

この手法の主な利点は、費用対効果が高く、効率性、再現性に優れていること、そしてヒト胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の両方に適用可能であることです。本日のデモンストレーターは、ロイアン研究所から来られた、現在はビクター・チャン心臓研究所の博士課程に在籍しているHananeh Fonoudi氏です。コーティングを行う前に、クリーニングブラシと蒸留水を使用して、ガラス製ペンデュラムを備えた100 milliliterスピナーフラスコから埃や培養残渣を完全に除去してください。

次に、フラスコに70% ethanolを満たします。30分後、フラスコを蒸留水ですすぎ、5 molar 水酸化ナトリウムを満たします。翌朝、フラスコを流水で5分間すすぎ、1 molar 塩酸を満たします。

15分後、フラスコを流水でさらに5分間すすぎ、続いて二回二回蒸留水で洗浄します。フラスコをバイオセーフティキャビネットに入れ、乾燥させます。その後、1.5 millilitersのシリコン化溶液をフラスコに加え、フラスコを水平方向に回転させて、すべての表面をシリコンでコーティングします。

コーティングしたフラスコをドライオーブンに入れ、100 °Cで1時間加熱します。フラスコが冷却されたら、脱イオン水で15分間、3回すすぎます。その後、容器を121 °Cで20分間オートクレーブ滅菌します。

単一細胞継代法を用いて未分化スフェロイドを少なくとも3回継代した後、5 mLピペットを使用してすべての未分化スフェロイドを15 mLコニカルチューブに移します。ウェルを1 mLのヒト胚性幹細胞培地で洗浄して残っているスフェロイドを回収し、洗浄液を回収したスフェロイドと合わせます。スフェロイドを5分間静置し、緩いペレット状に沈殿させます。

次に、スフェロイドを除去しないように注意しながら、上清を吸引します。続いて、スフェロイドを1 mLのPBSで5分間洗浄し、5 mLのTrypsin EDTAを用いて37 °Cでインキュベートします。4〜5分後、1 mLのヒト胚性幹細胞培地を加えて反応を停止させ、P1000ピペットを用いてスフェロイドを単一細胞懸濁液に解離させます。

トリパンブルー排除法によるカウント後、塩基性線維芽細胞成長因子およびROCK阻害剤を添加した条件培地を用いて、細胞を200,000 cells/mLの濃度で再懸濁し、細胞懸濁液100 millilitersをシリコン処理したバイオリアクターフラスコに移します。フラスコを攪拌機に設置し、35 RPMで攪拌します。24時間後、攪拌速度を40 RPMに上げます。

48時間後、再形成されたスフェロイドがすべてフラスコの底に沈殿するまで、5〜10分間攪拌を停止し、培地の半分を塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した条件化培地と交換します。その後、攪拌機を40 RPMで再始動してさらに24時間攪拌し、その後3日間は毎日同様の手順で培地の半分を交換します。5日目に、攪拌機を5〜10分間停止させます。

次に、すべてのスフェロイドを、50 mL以下の培地と共に50 mLチューブに移します。フラスコ内にスフェロイドが残っていないことを確認しながら、残りの培地を廃棄します。その後、沈殿したスフェロイドから上清を慎重に取り除き、カルシウムおよびマグネシウム含有PBS 25 mLで細胞凝集体を洗浄します。

5〜10分後、洗浄液を除去し、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3阻害剤、ROCK阻害剤、およびポリビニルアルコールを添加した40 millilitersのRPMI-B27培地でスフェロイドを再懸濁します。すべてのスフェロイドをバイオリアクターフラスコに戻します。次に、新鮮なRPMI-B27培地を加えて全量を100 millilitersにし、40 RPMで攪拌を再開します。

24時間後、同様の手順に従って培地をRPMI-B27培地に交換します。さらに24時間後、同様の手順に従い、培地をIWP2、purmorphamine、およびSB43を添加したRPMI-B27に交換します。そのまま48時間静置します。

通常、7日後に最初の拍動が観察されます。単一細胞培養に適応していないヒト多能性幹細胞株を迅速に分化させるには、マウス胚性線維芽細胞上で増殖させた、コンフルエンシーが70〜80%のヒト多能性幹細胞培養物に、解離液5 millilitersを加え、30〜60秒間処理します。解離液は、MEFが丸くなり、hPSCコロニーの端が明確になるまでのみ作用させてください。

細胞を放置しすぎると、適切に分化しなくなります。適切なタイミングで、解離溶液を速やかに 75 milliliters の collagenase type IV に交換し、37 degrees Celsius で 5 ～ 15 分間インキュベートします。その際、数分おきに顕微鏡で培養状態を確認してください。コロニー全体が剥離し始めたら、collagenase を 1.5 milliliters のヒト胚性幹細胞培地に交換し、P1000 ピペットを用いてプレート底面から細胞コロニーを慎重に剥離させます。

コロニーが小さな断片に砕けないよう、注意深く細胞を剥離させます。次に、5 mLピペットを使用して細胞を15 mLコニカルチューブに移し、ウェルを1 mLのヒト胚性幹細胞培地で洗浄し、残った細胞をすべて15 mLチューブに回収します。5分間静置して沈殿させた後、上清を慎重に取り除き、塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した2 mLの新鮮なヒト胚性幹細胞培地と交換します。

新しい5 mLピペットを使用して、細胞を超低接着プレートに移し、コロニーを6〜12時間インキュベートします。インキュベーション終了後、5 mLピペットを用いてコロニー凝集体を新しい15 mLチューブに注意深く移し、残った凝集体をRPMI-B27培地で洗浄して回収します。コロニーが沈殿したら、上清をグリコーゲン合成酵素キナーゼ-3阻害剤を添加した新鮮なRPMI-B27培地と交換し、コロニーをラミニンコートプレートに注意深く移して、37 °Cで接着させます。

24時間後、培地をRPMI-B27培地に変更します。さらに24時間後、培地をIWP2、purmorphamine、およびSB43を含むRPMI-B27に変更します。通常、7日後に最初の拍動が観察されます。

現在まで、この静置懸濁分化プロトコルは5種類のヒト胚性幹細胞株および4種類のヒト人工多能性幹細胞株で検証されており、各細胞株において90%以上の拍動スフェロイドが得られています。これにより、異なるヒト多能性幹細胞株間における本プロトコルの高い再現性が実証されました。分化中のスフェロイドは、撹拌懸濁バイオリアクター環境下においても静置システムと同様の挙動を示し、10日目にはほぼ100%のスフェロイドに拍動が観察されました。実際に、30日目に回収した拍動スフェロイドの切片では、それぞれ心筋トロポニンTの細胞質および核への発現、ならびに心筋転写因子NKX2.5の発現が認められています。

さらに、未分化スフェロイドを未分化細胞凝集塊に置き換えた場合、分化開始から7日後に拍動クラスターが出現します。テストした42株のヒト人工多能性幹細胞株では、15日目までに平均して60%以上のcardiac troponin T陽性細胞集団が生成されました。また、これらの拍動クラスターは、撹拌懸濁バイオリアクターで生成されたスフェロイドで観察されたものと同様に、心筋細胞質におけるcardiac troponin Tの発現および核におけるNKX2.5の発現を示しました。

この手順を実施する際は、バイオリアクターでの分化誘導前に、少なくとも3継代以上にわたって単一細胞培養に適応させたhPSCを使用することが重要です。この手順を心筋細胞濃縮のための他の手法と組み合わせることで、高純度な細胞集団を得ることが可能です。この技術は、hPSC由来心筋細胞の商業化への道を切り開きました。

本手法は、臨床、製薬、組織工学、および臓器やオルガノイドの開発への応用の可能性があります。このビデオを視聴することで、ヒト多能性幹細胞を心筋細胞へ効率的に分化させ、さらにバイオリアクターを用いて培養をスケールアップする方法について十分に理解できるはずです。