角膜上皮創傷治癒中の熱ショックタンパク質27の機能のRNA干渉ベースの調査

この RNA トランスフェクションアッセイの全体的な目標は、HSP27 特異的な低分子干渉 RNA を使用して、角膜上皮創傷治癒における HSP27 の潜在的な役割を評価することです。この方法は、上皮性創傷治癒過程におけるヒートショックタンパク質27の機能に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、小さな干渉RNAが感受性RNAスクロースであり、メッセンジャーRNA転写産物を特異的に標的にして分解を誘導するために作成されることです。

これは、新しい害虫空間のさまざまな細胞プロセスを特定するために使用されてきました。この技術は、角膜上皮創傷の治癒に関する洞察を提供することができますが、皮膚や粘膜などの別のシステムにも適用できる可能性があります。その手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるSoon-Suk Kangさんです。

この手順を開始するには、37°Cの気管支上皮増殖培地と5%の二酸化炭素を使用して、95%が合流するまで、ヒト角膜上皮細胞を6ウェルプレートで培養します。次に、トランスフェクション用試薬2.5マイクロリットル、またはトランスフェクション試薬7.5マイクロリットルを100マイクロリットルの還元血清培地で希釈します。次に、HSP27特異的siRNAおよびスクランブル制御siRNAを100マイクロリットルまたは還元血清培地に溶解して、それぞれ10ナノモルのHSP27特異的siRNAおよび15ナノモルのスクランブル制御siRNAを作製します。

その後、100マイクロリットルのsiRNA溶液と100マイクロリットルの希釈トランスフェクション試薬を混合し、室温で15分間インキュベートします。続いて、siRNA脂質複合体を細胞に加えます。4時間のインキュベーション後、培地を完全気管支上皮増殖培地に交換し、細胞を摂氏37度で2日間インキュベートしてからウェスタンブロット分析を行います。

このステップでは、100 μリットルの氷冷溶解バッファーを使用して、生物学的安全キャビネット内でHSP27特異的およびスクランブルされたコントロールsiRNAトランスフェクションHCECを抽出します。次に、細胞を氷上で30分間インキュベートして、細胞溶解を誘導します。次に、ライセートをGの10,000倍で15分間遠心分離します。

その後、上清を新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏マイナス80度で保存します。その後、Bradfordタンパク質アッセイを使用して細胞リチン酸のタンパク質濃度を決定します。次に、同量の全細胞タンパク質をサンプルに10%または12%のアクリルアミドゲルにロードします。

ゲルをSDSページにかけ、分離したタンパク質バンドを200ミリアンペアの電流で1時間4°Cのニトロセルロースフィルターに電気泳動で移します。次に、TBST中の5%スキムミルクでニトロセルロースフィルターメンブレンを1時間ブロックします。次に、一次抗体を添加し、シェーカーでメンブレンを摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、TBSTでメンブレンを3回洗浄し、各洗浄に10分間の余裕を与えます。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体を5%BSAで使用して免疫反応性バンドを検出します。その後、メンブレンをウェスタンブロッティングルミノール試薬で室温で1分間インキュベー

試薬溶液からメンブレンを取り出します。その後、吸着タオルで余分な水分を落とし、プラスチックシートプロテクターに入れます。その後、被覆したメンブレンをタンパク質側を上にしてフィルムカセットに入れます。

メンブレンの上にX線フィルムを置き、1分間露光します。生物学的安全キャビネットで、HSP27特異的またはスクランブルされたコントロールsiRNAトランスフェクトHCECのコンフルエント培養物を無菌ピペットチップで引きずりながら創傷を造成します。創傷直後に細胞を1XPBSで2回洗浄し、摂氏37度と二酸化炭素5%の気管支上皮増殖培地で24時間維持します。

負傷から24時間後、正立顕微鏡でHCECsの画像を100倍に撮影し、画像解析ソフトウェアのfilterコマンドを使用してバックグラウンドの平坦化を行います。select measurementsコマンドを使用して、最初の巻線を端から端まで垂直に覆うことができる同じサイズの多角形形状で関心領域を定義します。次に、各サンプルの負傷領域で 3 つの異なる関心領域を決定します。

カウントサイズ測定メニューオプションを使用して、各フィールドのセル番号を自動的にカウントします。ここに示すウェスタンブロット解析により、リン酸化HSP27とリン酸化Aktの発現がともに有意に減少したことが明らかになりました。一方、HSP27特異的なsiRNAトランスフェクトHCECでは、バックの発現が有意に増加しました。

リン酸化HSP27の発現は、HSP27特異的siRNAトランスフェクト細胞の10ナノモルおよび15ナノモルで、対照siRNAトランスフェクト細胞と比較して、それぞれ30%および40%減少しました。さらに、非リン酸化HSP27の発現は、HSP27特異的siRNAトランスフェクト細胞の10ナノモルおよび15ナノモルでそれぞれ20%および30%減少しました。スクラッチ誘発指向性創傷アッセイは、創傷の24時間後に、HSP27特異的siRNAトランスフェクト細胞を10ナノモルおよび15ナノモルで放出した遊走が減少したことを示しました。

さらに、HSP27特異的なHCECトランスフェクトsiRNAは、フローサイトメトリーで示されたスクランブルされたコントロールsiRNAトランスフェクト細胞と比較して、より多くのアポトーシスおよび壊死細胞死を受けました。一度習得したRNAトランスフェクション技術は、適切に実行されれば24時間で行うことができます。これらの手順に続いて、角膜上皮創傷治癒におけるヒートショックタンパク質27の初期機能のような追加の質問に答えるために、口のロックのようなエピソードが生成される可能性があります。

このビデオを見れば、角膜上皮創傷治癒における熱ショックタンパク質27の潜在的な役割を評価するために、熱ショックタンパク質27特異的な低分子干渉RNAを使用する方法について十分に理解できるはずです。小さな干渉するRNAや試薬を扱う作業は危険であり、これらの手順を実行する際には、生物学的安全キャビネットや保護マスクなどの前駆体を常に使用する必要があることを忘れないでください。