Name: 角膜上皮創傷治癒中の熱ショックタンパク質27の機能のRNA干渉ベースの調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶ角膜上皮創傷治癒におけるHSP27の機能を、HSP27特異的siRNAを用いたRNAトランスフェクション法で評価する手法。この方法は上皮性創傷治癒のメカニズム解明に有用です。

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この研究は、医学、ソウル、韓国の蔚山大学の大学の学生の研究助成（13-14）と牙山生命科学研究所、ソウル、韓国からの助成金（2014から464）によってサポートされていました。

1.細胞株<ol><li> 6ウェルプレートで培養10 6テロメラーゼ不死化ヒト角膜上皮細胞（HCECs）：気管支上皮増殖培地（BEGM）を使用して、5％CO 2雰囲気で37℃のインキュベーター中（密度1039.9セル/ mm 2）となるまで彼らは、95％のコンフルエンスに達します。 </li></ol> 2.ウェスタンブロット分析上皮スクラッチ傷を作成した後<ol><li>コンフルエント培養HCECsのウェルの表面を横切るストリーク滅菌200μlのピペットチップを生物学的安全キャビネット内の皿当たり4回（クラスII、タイプA2）および5％CO 2雰囲気で37℃のインキュベーターで別々にHCECsをインキュベート1、5、10、30、60、及び120分。 </li><li>角膜上皮創傷後のインキュベーション時間に応じて6の異なるサンプルのための1つの6ウェルプレートを使用してください。 </li><li> 1×PBSで負傷したHCEC単層を3回洗浄した後、各ウェルに2.0ミリリットルBEGMを追加します。 </li><li> 2を使用してHCECsを切り離し5分間、15mlチューブ中で5分間、900×gで遠心分離し、吸引トリプシンEDTA 1mLのピペットを用いてウェル当たりmlの0.25％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）。 </li><li> PBS 1×1ミリリットルでHCECsを中断し、1.5 mlチューブに移します。 </li><li> 1ミリリットルピペットを用いて15秒、吸引1×PBS、10,000×gで遠心分離HCECs。 </li><li>再懸濁HCECs100μlの氷冷溶解緩衝液（10mMのトリス、10mMの塩化ナトリウム、2mMのEDTA、25mMのNaFを、2ミリモルのNa 3 VO 4、1 mMのフッ化物をフェニルメタン[PMSF]、プロテアーゼ阻害剤[Aペプスタチン、1μM、 1μMのロイペプチン、および0.1μMアプロチニン]および0.5％トリトンX-100 [pHが7]）とそれらをよく混ぜます。 </li><li>細胞溶解を誘導するために、氷上で30分間細胞をインキュベートします。 </li><li>その後、遠心分離機15分間万×gで4℃で溶解物、および新しい1.5 mlチューブ（90μlのアリコート）に上清を移し、-80℃で保管してください。 </li><li>ブラッドフォードPRを使用して細胞溶解物の総タンパク質濃度を決定しますアッセイotein。9 </li><li>次いでドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、および10％または12％アクリルアミドゲルに負荷30μgの全細胞タンパク質を電気泳動的転写を4℃で1時間、200ミリアンペアの電流でニトロセルロースフィルターへのタンパク質バンドを分離しましたウェスタンブロットアッセイで使用するC。 </li><li> 5％のブロックニトロセルロースフィルター膜は、非リン酸化HSP27に対する一次ウサギポリクローナル抗体を追加し、1時間のTween 20（TBST）を有するトリス緩衝生理食塩水でスキムミルク（1：1,000希釈）またはリン酸化HSP27に対する一次ウサギポリクローナル抗体（1 ：1,000 5％ウシ血清アルブミン（BSA）で希釈）、そしてシェーカー上で4℃で一晩、膜をインキュベートします。 </li><li> TBSTで10分間3回洗浄した後、5％BSA中の（1：10,000希釈）西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体を用いて免疫反応性バンドを検出します。 </li><li>ウェスタンブロッティングルミノール試薬で膜をインキュベート（6〜7メートル室温で1分間5cmの膜×10 cm）のあたりL。 </li><li> 、試薬溶液から膜を取り外し、吸収性タオルで余分な液体を除去し、プラスチックシートプロテクター内の場所。 </li><li>安全な光で暗い部屋での作業、タンパク質側を上に向けてフィルムカセットに覆われた膜を配置します。 </li><li>膜の上にX線フィルムを置き、1分間さらします。 </li></ol> 3. siRNAのトランスフェクションアッセイ10 <ol><li> BEGMを使用して、5％CO 2雰囲気で37℃のインキュベーター中で6ウェルプレート中のウェル5×10 5細胞/で培養HCECs彼らが95％コンフルエンスに達するまで。 </li><li>の10または50 nMのを作成するために、低血清培地をトランスフェクション（希釈倍率は41または14.3であった）のために、100μlの低血清培地でのトランスフェクション試薬（2.5または7.5μl）を希釈し、HSP27固有を溶解し、100μlのコントロールsiRNAをスクランブルHSP27特異的および対照siRNAをスクランブル。 </li><li> 100μミックス、100μlの希釈されたトランスフェクション試薬のL siRNA溶液（1：1の比）、室温で15分間混合物をインキュベートします。 </li><li>細胞へのsiRNA - 脂質複合体を追加します。その後4時間の変化媒体の後、37℃で2日間細胞をBEGMを完了し、インキュベートします。 </li><li> 4.7へのセクション4.1から説明したように、ウェスタンブロッティングによってトランスフェクトされた細胞を分析します。 </li></ol> siRNAでトランスフェクトされた細胞11 4.ウエスタンブロットアッセイ<ol><li> HSP27特異抽出し、100μlの氷冷溶解緩衝液（10mMのトリス、10mMの塩化ナトリウム、2mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、25mMのNaFを、2ミリモルのNa 3 VOを使用して生物学的安全キャビネット内でコントロールsiRNAトランスフェクトHCECsスクランブル4、1mMのフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）、プロテアーゼ阻害剤、及び0.5％のTriton X-100、pHが7）。 </li><li>細胞溶解を誘導するために、氷上で30分間細胞をインキュベートします。 </li><li> 15分10,000×gでペレットの溶解物およびそれから新鮮1.5ミリリットル浴槽に上清を移しますエス（90μlのアリコート）し、-80℃で保管してください。 </li><li> Bradfordタンパク質アッセイを用いて細胞溶解物のタンパク質濃度を決定します。9 </li><li> 10％または12％アクリルアミドゲル上で全細胞タンパク質の等量を有する負荷サンプルは、SDS-PAGEのゲルの対象、および電気泳動を4℃で1時間、200ミリアンペアの電流でニトロセルロースフィルターに分離したタンパク質バンドを転送しますウェスタンブロットアッセイに使用します。 </li><li> （：1,000希釈1）、リン酸化Akt 5％ブロックニトロセルロースフィルター膜は、リン酸化および非リン酸化HSP27に対する一次抗体を追加し、1時間のTween 20（TBST）でトリス緩衝食塩水にスキムミルク（1：1,000希釈）、 Aktの非リン酸化（1：1,000希釈、細胞生存のマーカーとして使用される）のBcl-2関連Xタンパク質（1：1,000希釈、プロアポトーシスタンパク質として使用される）、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH; 1 200 5％ローディング対照として用い希釈）ウシ血清アルブミン（BSA）、およびシェーカー上で4℃で一晩膜をインキュベートします。 </li><li> TBSTで3回洗浄した後、5％BSAで、10分各洗浄：西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（10,000希釈1）を用いて免疫反応性バンドを検出します。 </li><li>ウェスタンブロッティングルミノール試薬で膜をインキュベート室温で1分間（6〜7ミリリットルあたり10センチメートル×5センチメートル膜）。 </li><li> 、試薬溶液から膜を取り外し、吸収性タオルで余分な液体を除去し、プラスチックシートプロテクター内の場所。 </li><li>安全な光で暗い部屋での作業、タンパク質側を上に向けてフィルムカセットに覆われた膜を配置します。 </li><li>膜の上にX線フィルムを置き、1分間さらします。 </li></ol> 5.スクラッチによって誘発される細胞遊走12の指向の傷つけアッセイ評価<ol><li>生物学的安全キャビネットでは、のコンフルエント培養のウェルの表面全体に、滅菌ピペットチップをドラッグして傷を作りますHSP27特異的siRNAトランスフェクトまたはスクランブル対照siRNAトランスフェクトHCECs。 </li><li>直ちに創傷後、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回細胞を洗浄し、創傷後24時間、5％CO 2雰囲気中で37℃のインキュベーター中BEGM培養でそれらを維持します。 </li><li>創傷後100X倍率24時間で直立顕微鏡を用いて写真HCEC画像とフィルタを使用して平坦化の背景を行います 画像解析ソフトでコマンド。 </li><li>選択測定コマンドを使用して、初期傷の端から端まで垂直にカバーすることができ、同じ大きさの多角形状とインタレスト（AOI）のエリアを定義し、各サンプルの創傷領域に三つの異なるAOIを決定します。 </li><li>自動的にカウント/サイズMeasureメニューオプションを使用して、各フィールドのセルの数を数えます。 </li></ol>アポトーシスの6.フローサイトメトリー分析<ol><li>文化HSP27特異的siRNAトランスフェクトし、コントロールの6ウェルプレート中のウェル5×10 5細胞/の濃度でそれぞれ10 nMのsiRNAを含有するiRNAトランスフェクトHCECs細胞はBEGM中で、5％CO 2雰囲気下で37℃のインキュベーター中で95％コンフルエンスに達するまで。 </li><li> 1ミリリットルピペットを用いて5分間、15mlチューブ中で5分間、900×gで遠心分離し、吸引トリプシンEDTAのためにウェル当たり2ミリリットル0.25％トリプシン-EDTAを使用してHCECsを外します。 </li><li>冷PBSで細胞を2回洗浄した後、10 6細胞/ mlの濃度で緩衝液（0.1 M HEPES / NaOHを[pHは7.4]、1.4 MのNaCl、および25mMのCaCl 2）に結合1Xで細胞を再懸濁します。 </li><li> 5ミリリットル培養チューブに100μlの細胞懸濁液（1×10 5細胞）を転送。 </li><li>ヨウ化プロピジウムμlの5μlのフルオレセインイソチオシアネート結合アネキシンVと5を追加します。 </li><li>細胞を穏やかにボルテックスし、暗所で室温で15分間、それらをインキュベートします。 </li><li>各チューブに1×結合緩衝液200μlを加え、フローcで細胞を分析1時間以内にytometer。 </li></ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
<li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li>
<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

著者らは、この研究で言及した任意の材料または方法には金融や独自の利害関係はありません。

この本研究では、 in vitro アプローチを使用して、角膜上皮創傷における HSP27 の潜在的な役割を評価しました。重要なステップには、ストレスを受けた細胞におけるHSP27の機能を観察するためのHSP27ノックダウンのためのsiRNAトランスフェクションが含まれていました。特に、角膜上皮創傷治癒中の上皮細胞遊走とアポトーシスにおけるHSP27の役割は、これらの実験によって明らかになりました。ラットHSP27特異的siRNAを使用して血管平滑筋細胞をトランスフェクションした以前の研究10 とは異なり、siRNAトランスフェクション技術を使用してヒトCECの遺伝子発現を改変し、HSP27特異的遺伝子発現を効果的にノックダウンし、HSP27機能を研究しました。使用したターゲット配列、細胞密度、最終siRNA濃度、インキュベーション時間に違いはありましたが、メーカーが推奨するプロトコルに明示的に従いました。代替方法に関しては、HSP27ノックアウトマウスを使用して、HSP27リン酸化が上皮遊走および細胞アポトーシスに関与するかどうかを示すことができます。しかし、HSP27のリン酸化は上皮創傷治癒中...

それらは同時に縁と角膜上皮の基底層の細胞に置き換えられている間に角膜上皮細胞（のCEC）を連続的に、涙液膜に流されている。1様々な外因性ストレスが、のCECのアポトーシスおよび落屑を誘発することができる。2熱ショックタンパク質（HSP）高度に保存され、分子サイズに係る二のファミリーに分類することができる。3最大HSPファミリーは、HSP90、HSP70およびHSP60を含み、より小さいファミリーはHSP27を含む4 HSP27のリン酸化が細胞の生存に重要な役割を果たすことが知られていますそして、理由アクチンリモデリングにおけるこのタンパク質の役割の細胞移動のために必要とされる。5-7。したがって、我々は、上皮創傷治癒のin vitroモデルでCECの移行とアポトーシスにおけるHSP27のリン酸化の潜在的な役割をテストしようとしました。 RNA干渉（RNAi）小さいまたは短い干渉RNAのいずれかを使用して（siRNA）がGEを持っていますそれが潜在的に可能にするように両方の基礎および応用生物学のnerated関心は、目的の任意の遺伝子の発現をノックダウンする。8ここで、我々はCEC創傷治癒およびアポトーシスに対するHSP27の寄与を評価するために、HSP27特異的siRNAを使用しました。細胞における遺伝子ノックダウンのための従来のRNAi法は、siRNAを作成するために組み立てることができる2つの未修正の21-merのオリゴヌクレオチドを含む合成RNA二重鎖を、使用しています。我々は、この本研究で使用したRNAi siRNAは、細胞をトランスフェクトするための単純かつ非常に効率的な方法であり、この試薬は、種々の不死化細胞株と連動します。この本研究では、我々は、傷誘導性の方向性創傷アッセイ、ウェスタンブロッティング、siRNAトランスフェクションアッセイ、免疫蛍光アッセイを含む、この分析のために使用される方法を、デモンストレーション、およびフローサイトメトリー。

<table><tbody><tr><td>バイオロジカルセーフティキャビネット</td><td>CHC LAB Co.Ltd,&nbsp;大田(韓国)&nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>クラスII A2型&nbsp;</td></tr><tr><td>Stealth RNAi&trade; siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA</td></tr><tr><td>BEGMTM</td><td>Lonza, Inc., Walkersville, MD</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>Bronchial epithelium growth medium&nbsp;</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich、Inc.、セントルイス、ミズーリ</td><td>州P8340、P7626</td><td>1 &#956;M ペプスタチン A, 1 &#956;Mロイペプチン、0.1 &#956;M アプロチニン</td></tr><tr><td>・ブラッドフォードタンパク質アッセイ&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ、ヘラクレス、CA</td><td>#500-0001</td><td>Bradford protein assay&nbsp;</td></tr><tr><td>ニトロセルロースフィルター&nbsp;</td><td>アマシャム、リトルチャルフォント、英国</td><td>RPN3032D</td><td>ウェスタンブロッティングメンブレン</td></tr><tr><td>非リン酸化HSP27&nbsp;</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab12351</td><td>1:1,000 希釈 (Total HSP27)</td></tr><tr><td>Phosphorylated HSP27 (Ser85)</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab5594 1</td><td>:1,000 希釈 HSP27 を Ser85</td></tr><tr><td>Lipofectamine&reg; RNAiMAX reagent&nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>13-778-075</td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>Phosphorylated Akt (Ser473)</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>No. 4060</td><td>1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker)</td></tr><tr><td>Non-phosphorylated Akt&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>No. 4061</td><td>1:1,000 希釈 (Total Akt)</td></tr><tr><td>Bcl-2-associated X protein&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>No. 4062</td><td>1:1,000 (抗アポトーシスタンパク質マーカー)</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>No. 4063</td><td>1:1,000 ローディングコントロールマーカー(ハウスキーピング遺伝子)</td></tr><tr><td>セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>NCI1460KR</td><td>1:10,000 dilution</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen,カールスバッド、CA</td><td>31985</td>トランス<td>フェクション用還元血清培地</td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>Olympus, Inc., Tokyo, Japan</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Skimed粉乳&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG、カールストルーエ、ドイツ</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Amresco LCC、Inc. ソロン、オハイオ州</td><td>No-0497</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル培養プレート</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>140675</td><td>直径35.00mm/井戸</td></tr><tr><td>24ウェル培養皿</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>142475 Orbital</td><td></td></tr><tr><td>shaker</td><td>N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Santa Cruz Biotechnology, サンタクルス, CA</td><td>sc-2323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCantoTM II</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td></td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>X-Ray Film</td><td>Kodak, Rochester, NY</td><td></td><td>Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen&nbsp;</td></tr><tr><td>ウェスタンブロッティングルミノール試薬</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V アポトーシス検出キット I</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

角膜上皮創傷治癒中の熱ショックタンパク質27の機能のrna干渉ベースの調査

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small Interfering RNA(siRNA)は、タンパク質をコードする遺伝子の短期的なサイレンシングに最も広く使用されているRNA干渉法の一つです。siRNAは、mRNA転写産物を特異的に標的としてその分解を誘導するために作成された合成RNA二本鎖であり、さまざまな細胞プロセスにおける新しい経路を特定するために使用されてきました。角膜上皮創傷治癒におけるリン酸化熱ショックタンパク質27(HSP27)の役割に関する報告はほとんどありません。本明細書では、培養されたヒト角膜上皮細胞を、スクランブルされたコントロール-siRNAトランスフェクト群とHSP27特異的siRNA-トランスフェクトグループに分けた。その後、スクラッチ誘発性指向性創傷アッセイ、ウェスタンブロッティング、およびフローサイトメトリーを実施した。HSP27は、上皮細胞のアポトーシスと遊走に関与する可能性のある角膜上皮創傷治癒に関与していると結論付けています。ここでは、サンプル調製と研究プロトコルの段階的な説明を提供します。

リン酸化HSP27の発現が有意に無傷HCECs 13と比較して創傷スクラッチした後、5から10に増加し、30分。ウェスタンブロット分析は、Baxの発現が有意にHSP27特異的siRNAでトランスフェクトHCECs（ 図1A-E）で増加したのに対し、リン酸化HSP27及びリン酸化Aktの発現は両方の有意に減少したことが明らかになりました。 （ 図1A-Bリン酸化HSP27の発現は、対照siRNAをトランスフェクトした細胞と比較して、それぞれ、30％および10 nMの中で40％とHSP27特異的siRNAでトランスフェクトした細胞の50 nMの減少したが、リン酸化HSP27の発現が減少しませんでした）。また、非リン酸化HSP27の発現は、10 nMの20％及び30％減少したsiRNAをトランスフェクトされた細胞、それぞれが、非リン酸化HSP27の発現は減少しなかった（ 図1A HSP27特異的およびCの50 nMの<st...

ここでは、角膜上皮創傷治癒中のHSP27の機能を評価するために、熱ショックタンパク質27(HSP27)特異的な低分子干渉RNAを使用するプロトコルを提示します。RNA干渉は、さまざまな細胞タイプのタンパク質機能を調べるために、遺伝子発現を効果的にノックダウンするための最良の方法です。

角膜上皮創傷治癒中の熱ショックタンパク質27の機能のRNA干渉ベースの調査

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

このRNAトランスフェクションアッセイの全体的な目的は、HSP27特異的な小干渉RNAを用いて、角膜上皮の創傷治癒におけるHSP27の潜在的な役割を評価することです。この手法により、上皮創傷治癒過程におけるHeat Shock Protein 27の機能に関する重要な疑問を明らかにすることができます。本手法の主な利点は、小干渉RNAが、特定のメッセンジャーRNA転写物を標的としてその分解を誘導するために作られた、感度の高いRNA sucroseであることです。この手法は、さまざまな細胞プロセスに関与する新規の標的を同定するために用いられてきました。この技術は角膜上皮の創傷治癒に関する知見を提供できるだけでなく、皮膚や粘膜などの他の系にも適用可能です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるSoon-Suk Kangが行います。本手順を開始するには、ヒト角膜上皮細胞を、気管支上皮増殖培地を用いて6ウェルプレートで37 °C、5 % CO2条件下にて、コンフルエンシーが95 %になるまで培養します。次に、トランスフェクション用に、2.5 µLまたは7.5 µLのトランスフェクション試薬を100 µLの低血清培地で希釈します。その後、HSP27特異的siRNAおよびスクランブルコントロールsiRNAを100 µLの低血清培地に溶解し、それぞれ10 nMのHSP27特異的siRNAおよび15 nMのスクランブルコントロールsiRNAを調製します。その後、100 µLのsiRNA溶液に100 µLの希釈済みトランスフェクション試薬を混ぜ、室温で15分間インキュベートします。続いて、siRNAリポソーム複合体を細胞に添加します。4時間のインキュベーション後、培地を完全気管支上皮増殖培地に交換し、ウェスタンブロット解析を行うまで、細胞を37 °Cで2日間インキュベートします。このステップでは、生物学的安全キャビネット内で、HSP27特異的siRNAおよびスクランブルコントロールsiRNAをトランスフェクションしたHCECsを、氷冷したライシスバッファー100 µLを用いて抽出します。次に、細胞を氷上で30分間インキュベートし、細胞溶解を誘導します。その後、溶解物を10,000 ×gで15分間遠心分離します。続いて、上清を新しい1.5 mLチューブに移し、-80 °Cで保存します。その後、Bradfordタンパク質定量法を用いて細胞溶解物のタンパク質濃度を測定します。次に、総細胞タンパク質量を等量にしたサンプルを、10%または12%のアクリルアミドゲルにロードします。ゲルをSDS-PAGEに供し、分離したタンパク質バンドを、電流200 mA、温度4 °Cの条件で1時間、ニトロセルロースフィルターに電気泳動転写します。次に、5%脱脂粉乳を含むTBSTを用いて、ニトロセルロースフィルター膜を1時間ブロッキングします。その後、一次抗体を加え、シェーカーを用いて4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、メンブレンをTBSTで1回10分間、計3回洗浄します。次に、5% BSA溶液を用いて、西洋わさびペルオキシダーゼ標識山羊抗ウサギ抗体により免疫反応バンドを検出します。続いて、メンブレンをウェスタンブロッティング用ルミノール試薬中で室温にて1分間インキュベートします。メンブレンを試薬溶液から取り出します。次に、吸水性のタオルで余分な液体を取り除き、プラスチック製のシートプロテクターに入れます。その後、プロテイン側を上に向けて、カバーしたメンブレンをフィルムカセットにセットします。メンブレンの上にX線フィルムを置き、1分間露光します。バイオセーフティキャビネット内で、HSP27特異的またはスクランブルコントロールsiRNAを導入したコンフルエントなHCECの培養層に、滅菌したピペットチップを引いて傷をつけます。創傷作成直後に、細胞を1XPBSで2回洗浄し、気管支上皮増殖培地を用いて37 °C、5% CO2条件下で24時間維持します。創傷処置から24時間後、正立顕微鏡を用いて100倍でHCECの画像を撮影し、画像解析ソフトのフィルターコマンドを使用してバックグラウンド補正を行います。「測定範囲の選択」コマンドを使用し、初期創傷を端から端まで垂直にカバーできる同一サイズの多角形で関心領域を定義します。その後、各サンプルの創傷領域内に3つの異なる関心領域を設定します。「カウントサイズ計測」メニューオプションを使用して、各視野内の細胞数を自動的にカウントします。ここに示すウェスタンブロット分析では、リン酸化HSP27およびリン酸化Aktの発現がいずれも有意に減少していることが明らかになりました。一方で、HSP27特異的siRNAを導入したHCECsでは、Baxの発現が有意に増加していました。コントロールsiRNAを導入した細胞と比較して、10 nanomolarおよび15 nanomolarのHSP27特異的siRNAを導入した細胞では、リン酸化HSP27の発現がそれぞれ30%および40%減少しました。さらに、非リン酸化HSP27の発現は、10 nanomolarおよび15 nanomolarのHSP27特異的siRNAを導入した細胞において、それぞれ20%および30%減少しました。スクラッチ誘導方向性創傷アッセイの結果、創傷後24時間において、10および15 nanomolarのHSP27特異的siRNAを導入した細胞では遊走能の低下が認められました。さらに、フローサイトメトリーによる解析の結果、HSP27特異的siRNAを導入したHCECは、スクランブルコントロールsiRNAを導入した細胞と比較して、アポトーシスおよびネクローシスによる細胞死が多く認められました。RNA導入技術を習得すれば、適切に実施することで24時間以内に完了させることが可能です。これらの手順に従うことで、角膜上皮の創傷治癒におけるHeat Shock Protein 27の初期機能といった追加の疑問を解消するための、口が開かなくなる（lock mouth）ようなエピソードを再現することができます。このビデオを視聴することで、Heat Shock Protein 27特異的な小干渉RNAを用いて、角膜上皮の創傷治癒におけるHeat Shock Protein 27の潜在的な役割を評価する方法について十分に理解できるはずです。小干渉RNAや試薬の取り扱いは危険を伴う場合があるため、これらの手順を行う際は、生物学的安全キャビネットや保護マスクなどの前置設備を常に使用することを忘れないでください。

rna-interference-based-investigation-function-heat-shock-protein-27

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ヒトの糖尿病臓器培養角膜におけるアデノウイルス遺伝子治療の例が、これらの角膜における創傷治癒の遅延と上皮幹細胞マーカー発現の顕著な減少の正常化に向けて提示されています。また、幹細胞が豊富な辺縁系上皮培養におけるこのプロセスの最適化についても説明します。...

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と​​輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

高スループットと小さな抑制 RNA スクリーニングはより急速に化学角膜上皮傷害の分子機構を解明するために助けることができる重要なツールです。ここで、開発と露出モデルとフッ化水素とクロルピクリンによる角膜上皮障害の高スループット...

クロルピクリンとフッ化水素誘起角膜上皮細胞傷害のための高スループット SiRNA スクリーニング

このプロトコルでは、マウスの眼球の表面に耐摩耗性を与えるし、創傷の治癒過程をその後に従うメソッドについて説明します。ハイパーカプニア...

角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

元のプロトコル vivo 角膜器官培養モデル創傷治癒の研究を説明に役立ちます。このモデル系は、再生治癒を促進するエージェントまたは整頓されていた 3 D...

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

ここでは、トレフィンと鈍いゴルフクラブスパッドとを用いてマウスの中央角膜上皮擦過傷創傷を作成するためのプロトコルが記載されている。この角膜創傷治癒モデルは非常に再現性が高く、現在、疾患の文脈における妥協した角膜創傷治癒を評価するために使用されている。...

角膜創傷治癒を研究するための上皮擦過傷モデル

ここでは、角膜上皮の機械的および化学的損傷のためにマウスとウサギに基づく動物モデルを開発し、新しい治療法とそのメカニズムをスクリーニングします。...

角膜上皮の機械的および化学的損傷のためのEx Vivoおよびin vivo動物モデル

本プロトコールは、胚性ひよこの角膜を...

胚性創傷チック角膜における瘢痕のない組織再生の調査

このプロトコルは、細胞レベルでのその後の創傷閉鎖を評価するために、擦過傷によってゼブラフィッシュの眼表面を損傷することに焦点を当てている。このアプローチは、眼のバリを利用して角膜上皮を部分的に除去し、走査型電子顕微鏡を使用して創傷閉鎖中の細胞形態の変化を追跡する。...

ゼブラフィッシュ角膜創傷治癒:擦過傷から創傷閉鎖画像分析まで

本研究では、3Dプリントホルダーを利用して、除核球体の高解像度ライブセルイメージングを可能にする新しい実験プロトコルについて説明します。このプロトコルを通じて、 ex vivo グローブからの創傷角膜上皮における細胞カルシウムシグナル伝達活性をリアルタイムで観察することができる。...

新しい3Dプリントホルダーを使用した無傷の ex vivo グローブの生細胞イメージング

私たちは、角膜上皮の掻爬術と角膜縫合糸の組み合わせにより、重度の角膜炎症のラットモデルを開発しました。この研究では、炎症条件下での角膜の炎症パターン、上皮の増殖、および辺縁系幹細胞の変化を評価しました。...

角膜上皮掻爬術と角膜縫合糸の併用に基づくラットにおける重篤な角膜炎症モデルの確立

臓器培養ブタ角膜および上皮創傷治癒を用いた治療毒性および化学的毒性の評価

学ぶ角膜上皮創傷治癒におけるHSP27の機能を、HSP27特異的siRNAを用いたRNAトランスフェクション法で評価する手法。この方法は上皮性創傷治癒のメカニズム解明に有用です。

角膜上皮創傷治癒中の熱ショックタンパク質27の機能のRNA干渉ベースの調査

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