細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

本手順の目的は、分枝形態形成における機械的ストレスの影響を決定するなど、多くの実験的状況で利用するために、コラーゲンゲルに埋め込まれた同一の三次元組織を構築することである。この手法は、集団的な細胞挙動の基礎となるメカニズムの解明など、組織形態形成における重要な疑問への回答に寄与する。本技術の主な利点は、構築された組織の形状が制御可能で再現性があるため、物理的および生化学的因子の精密な操作および測定が可能である点にある。

これにより、高い統計的信頼性を持って結論を導き出せる十分なサンプルサイズが確保されます。まず、標準的なフォトリソグラフィー技術を用いて、目的のアレイをフォトパターン化したシリコンマスターを準備します。このビデオで使用しているパターンは、200 µmの間隔で配置された矩形構造で構成されています。

次に、使い捨て容器内でプレポリマーと硬化剤を10:1の比率で混合し、50gのPDMSを調製します。その後、混合過程で混入した気泡を除去するため、混合物を15〜30分間真空状態で脱気します。シリコンマスターのテクスチャ面を上にしてプラスチック製量り皿に配置し、脱気したPDMS溶液をモールドの上に注ぎます。

次に、ディッシュをオーブンに入れ、60 °Cで12時間、PDMSを硬化させます。硬化後、プラスチック容器からPDMSとマスターを取り出します。シリコンウェハーからPDMSを慎重に剥離してください。

次に、清潔なカミソリの刃を使用して、型押しされたパターンの周囲から余分なPDMSを取り除きます。続いて、カミソリの刃でパターン形成されたPDMSを個別の長方形のスタンプ状に切り分けます。これらのスタンプを、パターン面を上に向けた状態で、清潔な100 millimeter径のペトリ皿に保存します。

次に、プレポリマーと硬化剤を同じ10:1の比率で用い、脱気したPDMS溶液を新たに調製します。この溶液を2～3 g、直径100 mmのペトリ皿にスピンコートし、60 °Cで12時間 curing（硬化）させます。その後、カッターナイフを用いて、薄いPDMS層をスタンプの支持体として使用するための長方形に切り出します。

各スタンプにつき2つの支持体が必要です。すべての支持体の切断が完了したら、PDMSスタンプと支持体を70%ethanolに浸し、バイオセーフティキャビネット内でアスピレーターを用いて乾燥させることで滅菌します。バイオセーフティキャビネット内で、各スタンプの上部に1%BSA in PBSを50 microliters添加します。

BSAがスタンプ表面に吸着するように、ドロップレットで覆われたスタンプを4 °Cで最低4時間静置します。その後、スタンプをバイオセーフティキャビネットに戻し、PDMSスタンプからBSA溶液を吸引して取り除きます。次に、スタンプ表面を50 µLの細胞培養液で2回洗浄します。

洗浄ごとに培地を吸引します。PDMSスタンプ1つにつき、直径35mmの組織培養皿を1枚ずつ準備します。各皿に、PDMSスタンプの長さよりわずかに短い間隔をあけて、2つのPDMSサポートを配置します。

次に、ピンセットを用いて直径15 millimeterのガラスカバーガラスをピックアップし、70% ethanolで滅菌します。ピンセットでカバーガラスを保持したまま、余分な液体を吸引し、別のペトリ皿に保管します。続いて、PDMSスタンプの表面を均一にコーティングするため、4 mg/mLのコラーゲン混合液50 µLを各スタンプに直接分注します。

ピンセットを用いて、コラーゲンコートしたPDMSスタンプをそれぞれ拾い上げ、ゆっくりと反転させます。反転させたスタンプのコラーゲン面を下にして、組織培養皿内のPDMSサポートの上に載せます。その後、培養皿を37 °Cで30分間インキュベートします。

次に、残りのコラーゲン混合液を円形のカバーガラス1枚につき 50 µL ずつ分注し、37 °C で 30 分間インキュベートします。この時点で、目的の細胞を回収します。ここでは、100万〜1000万 cells/mL の濃度で懸濁した EpH4 マウス乳腺上皮細胞を使用しています。

次に、ゲル化したコラーゲンサンプルをインキュベーターから取り出します。ピンセットを使用して、PDMSスタンプをゆっくりと垂直に持ち上げて成形されたコラーゲンから剥離させ、廃棄してください。コラーゲンゲルの構造を歪ませないよう、スタンプを真っ直ぐ上に持ち上げることが重要です。

所望の形状の空洞が形成された各コラーゲンゲルの表面に、濃縮細胞懸濁液を30 µLずつ分注します。ディッシュを左右にゆっくりと揺らしながら、明視野顕微鏡下で細胞が空洞内に沈降する様子を観察します。5分以内に空洞が満たされるはずです。

空洞周囲の過剰な細胞を除去するため、各組織培養皿を傾け、コラーゲンゲルの表面に細胞培養液を400 µLずつ静かに添加します。ゲルの表面にある過剰な細胞を除去しつつ、空洞内の細胞が流出しないように、皿を傾けながら培養液をゆっくりと滴下して、穏やかに洗浄することが重要です。液体を吸引し、この洗浄操作をさらに2回繰り返します。

各洗浄の間に、顕微鏡下でコラーゲンゲルを確認し、過剰な細胞が洗い流されたか観察します。細胞が充填された空洞の周囲から過剰な細胞が除去されたら、組織培養ディッシュを37°Cのインキュベーターに15分間置きます。次に、ピンセットを用いて、コラーゲンコートされたガラスカバースリップを慎重に反転させ、細胞充填コラーゲンモールドの上に配置し、カバースリップのコラーゲンが細胞充填空洞を覆うキャップのような形状になるようにします。

サンプルを37°Cで15分間インキュベートします。コラーゲンキャップが細胞充填済みのコラーゲンモールドに接着したら、ゲルの上のガラスカバースリップに2〜2.5 mLの細胞培養培地をゆっくりと分注し、サンプルを37°Cで1〜3日間培養します。これらの画像は、細胞播種前にタイプIコラーゲンゲルに成形されたアレイの低倍率および高倍率での視野です。

ウェルの形状は、シリコンマスター上の構造の形状によって決定されます。ここでは、長方形のウェルに乳腺上皮細胞を充填しています。この例では、200 × 50 µmの各長方形ウェルに、約80〜100個の細胞が含まれています。

細胞播種から24時間後、細胞がウェル内で互いに凝集し、組織を形成している様子が観察されました。培養液に成長因子HGFを添加してから24時間後、組織に分枝形態形成が起こっていることがわかります。細胞遊走に関与するタンパク質の一つに焦点接着斑キナーゼ（focal adhesion kinase）がありますが、この合成画像からわかるように、通常分枝が起こるウェルの端でその発現が増加しています。

この手法を習得すれば、適切に実施することで2時間以内に完了させることができます。本手順の後に、牽引力顕微鏡法、リアルタイムRT-PCR、ウェスタンブロッティングなどの他の手法を行うことで、細胞が遊走する際に及ぼす力や、目的遺伝子の転写産物およびタンパク質レベルの変化を決定できます。このビデオを視聴することで、定義された初期形状を持つ組織をコラーゲンゲル内に埋入させる、この3D細胞培養モデルの構築方法について十分に理解できるはずです。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。