新規不溶性発色基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング

この発色アッセイの全体的な目標は、選択したさまざまな発色基質に対して、さまざまな酵素をハイスループットフォーマットでスクリーニングすることです。この方法は、バイオマスの分解のための新しい酵素活性を見つけるなど、酵素探索分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、発色性基板が4つの異なる色で利用できるため、この技術がハイスループットで、非常に信頼性が高く、費用対効果が高いことです。

まず、各ウェルに200マイクロリットルの活性化溶液を加えて、96ウェルフィルターアッセイキットプレートを活性化します。撹拌せずに室温で10分間インキュベートします。回収には、遠心分離機と標準的な96ウェルプレートを使用してください。

現存する活性化溶液をスピンダウンするには、発色性ポリマーハイドロゲルまたはCPH基質に100マイクロリットルの滅菌水を加え、真空またはスピンを適用して安定剤を除去します。洗濯をさらに2回繰り返します。酵素反応を調製するには、150マイクロリットルの100 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4.5、および5マイクロリットルのエンドセルラーゼ溶液を3つの異なる濃度でアッセイキットプレートの各ウェルに加えます。

製品プレートをアッセイキットプレートの下に置き、振とう中に反応プレートから漏れる可能性のあるものを収集します。次に、アッセイキットプレートを室温で水平シェーカー(100 rpm)で30分間インキュベートします。信頼性の高いデータを得るためには、インキュベーション中に反応混合物を攪拌する必要があります。

アッセイキットプレートとその下に製品プレートを遠心分離機に置き、2,700×gで10分間スピンダウンします。反応生成物を製品プレートのウェルに移します。スピン後、製品プレートを目視検査して、各ウェル内の液体の量がほぼ同じかどうかを確認します。

プレートリーダーを使用して、さまざまな緑色CPH基板の630nmでの収集プレートの吸光度を読み取ります。テキストプロトコルに従ってデータを分析およびプロットします。赤色の不溶性発色バイオマスまたはICB-小麦わらを用いて発色アッセイを実施するには、アッセイプレートの各ウェルに200マイクロリットルの活性化溶液を添加することから始める。

その後、プレートを室温で10分間攪拌せずにインキュベートします。100マイクロリットルの滅菌水を使用してウェルを3回洗浄し、安定剤を取り外します。次に、pH 4.5の100 mM酢酸ナトリウム緩衝液150マイクロリットルと、異なるエンドキシラナーゼ溶液の1ミリリットルあたり10ユニットの5マイクロリットルを追加します。

製品プレートを基板プレートの下に配置して、振とう中に基板プレートから漏れる可能性のあるものを収集します。反応を室温、100rpmで2時間インキュベートします。インキュベーション後、アッセイキットプレートとその下に製品プレートを遠心分離機に置き、2,700×gで10分間スピンダウンして、製品プレートのウェル内で反応生成物を移します。

各ウェル内の液体の量がほぼ同じであることを確認してください。次に、プレートリーダーを使用して、赤色ICB-麦わらの517nmでの収集プレートの吸光度を読み取ります。テキストプロトコルに従ってデータ分析を実行します。

ここに示されているのは、酵素の異なる濃度でのキシラナーゼに対するCPH-アラビノキシランの用量応答の例であり、酵素濃度の低下を視覚的に観察することができます。より詳細な分光光度定量化を使用して、酵素濃度に対する吸光度をプロットします。信号強度は酵素活性に対応します。

酵素スクリーニングに使用したこのアッセイの例では、エンドセルラーゼを異なるCPH基質に対して3つの濃度で試験しました。ここに見られるように、CPH-グルカン、CPH-キシラン、CPH-キシログルカンではセルラーゼに加えた活性が見られ、CPH-ガラクトマンナンに対しては低い活性が見られました。同じCPH基質を、同じ条件下でポジティブコントロールとして使用した市販の酵素で消化しました。

この結果は、すべての基質が酵素濃度の増加に伴って増加するレベルで分解されたことを示しています。この実験では、5つのICB基質と19のCPH基質を含め、3つの異なるpH条件下でPhanerochaete chrysosporiumの分泌酵素を分析しました。P.chrysosporium酵素は、さまざまなグルカン、デンプン、キシランを分解しました。

ヘミセルロースアラビナンとペクチンガラクタン、およびRGIでは、より低いシグナルが検出される可能性があります。産生された酵素は、中性またはわずかに塩基性の条件よりも酸性条件でより活性が高かった。このテクニックをマスターすると、適切に実行すれば、1時間未満で完了できます。

この手順を試みる際には、インキュベーション中に反応を混合することを忘れないようにすることが重要です。開発後、この技術は、ハイスループットスクリーニングの分野の研究者がバイオテクノロジーのための新しい酵素活性を探求する道を開きます。このビデオを見れば、スクリーニングキットの使い方をよく理解できるはずです。