Name: 新規不溶性発色基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学ぶ 新規不溶性発色基質アッセイキットを用いた炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング法。96ウェルフィルタープレートで酵素活性を可視化し、バイオマス分解や新規酵素発見の研究に活用できます。

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私たちは、優れた技術支援のための撮影のために彼の研究室へのアクセスを提供教授J.ポール・ノックス（リーズ大学、英国）、およびスーザンE.マーカスに感謝したいと思います。 21世紀のための263916）とプロジェクトバイオマス（イノベーションの基盤デンマーク、ケース番号：103408）SKKはSET4Futureプロジェクト（デンマーク戦略研究協議会）感謝され、：JSはWallTraCプロジェクト（欧州委員会第七フレームワークプログラム（助成契約なしを認めています。戦略研究、技術革新（グラントケース番号：0603-00522B）デンマーク評議会のためにデンマークの評議会によって設立されたバイオバリュー戦略、および複合多糖系（グラントケースの酵素分解を理解するための生物学主導のアプローチなし。：。。107279）資金調達のためには、本論文では、唯一の著者の見解を反映した欧州連合（EU）は、本明細書に含まれる情報を用いてもよい任意の使用のための責任を負いません。

96ウェルプレートフォーマットでCPH基質1.発色アッセイ<ol><li> アッセイキットプレートの活性化 <ol><li>撹拌せずに室温で10分間インキュベートし、各ウェルに（キットを用いて得られた）200μlの活性化溶液を加えることによって（青CPH-キシランを含む）を96ウェルフィルターアッセイキットプレート（材料のリスト）を活性化します。 </li><li>現存活性化溶液を除去するために、（内側スペーサブロックとコレクションプレートなどの任意の標準的な、透明な96ウェルプレートで）真空マニホールドを用いて真空を適用します。その代わりに、真空マニホールドのこのステップのために10分間、2,700×gで遠心分離を使用することも可能です。 </li><li> 100μlの滅菌水を添加することにより、CPH基板を洗浄し、真空（または遠心力）を適用する安定化剤を除去します。このステップをさらに2回繰り返し、プレートが使用可能になります。 </li></ol></li><li> 酵素反応 注：常にバッファが含まれます単独の陰性対照として、および陽性対照としての可能性以前に特徴付けられた酵素の場合。複製の統計学的に適切な数を使用してください。 CPH基板は、pHが3.0〜10.0に安定しており、各ウェル内のバッファ終了酵素液の総容量は180μLを超えてはなりません。植物抽出物または培養液はまた、代わりに、精製酵素液を使用することができます。 <ol><li> 150μlの100 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4.5およびアッセイキットプレートの各ウェル（1 U / mlの最終濃度まで）5μlのエンド -cellulase溶液を加えます。 </li><li>揺れの間に反応プレートからの潜在的な漏洩を収集するためのアッセイキットのプレートの下に製品のプレート（マイクロタイタープレートリーダーと互換性のあるクリアなウェルプレート）を置きます。 </li><li> 150rpmで水平シェーカーで30分間、25℃でアッセイキットプレートをインキュベートします。 注：インキュベーション中のアッセイキットプレートで反応を混合すると、一貫性と再現を実現するために重要ですducible結果。 CPH基板は90℃まで安定です。 CPH基質と未知の酵素濃度を含む培養液をテストするとき、インキュベーション時間は24時間まで増加させるべきです。適切なインキュベーション時間は、酵素の活性に依存するが、24時間以内に検出可能な活性が存在しない場合、一般的に、酵素は、試験した基質を分解しないという可能性があることに留意されたいです。活性酵素は、着色された上清として表示されている水溶性の発色性オリゴ糖、にCPH基板の不溶性発色性多糖類を分解しています。 </li><li>内側スペーサブロックと真空マニホールドの内部クリーンな製品プレートを置きます。 </li><li>上部のアッセイキットプレートを置き、真空（-60 kPaでの最大負圧）を適用します。それを10分間2,700×gで遠心分離を使用することも可能です。 注：反応生成物として着色されたオリゴ糖を含む濾液は、さらなる分析の8の製品版になりました</s&gt;アップ。 </li></ol></li><li> 検出および定量 <ol><li>製品プレートの各ウェル中の液体の体積は約目視で同じであることを確認してください。 </li><li>青CPH-キシランプレートリーダーを使用するための595nmで回収プレートの吸光度を読みます。 </li><li>データ分析を行う場合、酵素を添加したウェルからの値からバッファのみの負の制御値を減算します。複製のウェル8からの平均値と平均の標準誤差（SEM）を計算します。 </li></ol></li></ol> 96ウェルフォーマットでICB基板2.発色アッセイ<ol><li> 酵素反応 <ol><li> 150μlの100 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4.5及び5を加えμlの31 U / mlのエンド -xylanase（ウェル中の最終酵素濃度1 U / ml）の赤ICB-麦わらを含むアッセイキットプレートの各ウェルに溶液。 注：アッセイキットプレート（96ウェルフィルターPL文献に記載されているようICB基板を含むのATE）は（材料のリストを参照してください）​​製造されています。 ICB基板は、10.0のpH 3.0の間のpH範囲の緩衝液中で安定です。常に、ネガティブコントロールとして緩衝液単独陽性対照として市販酵素とレプリカの統計学的に適切な番号を使用含まれています。 <ol><li> CPH基板プレートのようなICBの基質を活性化するが、真空ろ過や遠心分離し、100μlの水で3回洗浄することにより、安定剤を削除しないでください。 </li></ol></li><li>揺れ時の基板プレートからの潜在的な漏れを収集するために、基板プレートの下に製品板を置きます。 </li><li> 2時間150rpmで振とうしながら25℃で反応をインキュベートします。 注：活性酵素は、着色された上清として表示されている水溶性のオリゴ糖、にICB基板に不溶発色性多糖類を分解しています。 ICB基板は90℃まで安定です。インキュベーショントンこのような培養液などの非精製酵素を使用する場合、IMEは、24時間まで増加されるべきです。 </li><li>内側スペーサブロックと真空マニホールドの内部に製品板を置きます。 </li><li>上部のアッセイキットプレートを置き、真空（-60 kPaでの最大負圧）を適用するか、または製品プレートのウェルにアッセイキットプレートから製品をろ液に遠心分離器を使用しています。 注：反応生成物として着色されたオリゴ糖を含む濾液は、さらなる分析の8のためのコレクションプレートになりました。 </li></ol></li><li> 検出および定量 <ol><li>コレクションプレートの各ウェル中の液体の体積は約目視で同じであることを確認してください。 </li><li>プレートリーダーを用いて赤ICB-麦わらのための517 nmで収集プレートの吸光度を読みます。 </li><li>データ分析を行うとき - バッファを引く - 酵素のウェルからの値からのみ負の制御値を追加されました。複製のウェル8からの平均値と平均の標準誤差（SEM）を計算します。 注：未知の酵素をスクリーニングする場合には、我々は、酵素活性のダイナミックレンジについてのより詳細なデータを得るために、希釈系列を作製示唆する。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carbohydrate-active+enzymes+database+%28CAZy%29+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).</li>
<li>Cantarel, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Carbohydrate-Active+EnZymes+database+%28CAZy%29%3A+an+expert+resource+for+Glycogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics.</a> Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).</li>
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<li>Biely, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+xylan+deacetylating+enzymes+on+monoacetyl+derivatives+of+4-nitrophenyl+glycosides+of+beta-D-xylopyranose+and+alpha-L-arabinofuranose%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose.</a> J. Biotechnol. 151 (1), 137-142 (2011).</li>
<li>Mackenzie, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polysaccharide+utilization+locus+from+an+uncultured+bacteroidetes+phylotype+suggests+ecological+adaptation+and+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).</li>
</ol>

96ウェルプレートCPH基板アッセイ96ウェルICB基質アッセイ（WO2015036000デンマークPA 2015 70311）を含む提出し2の特許出願があります。

私たちは、カスタム設計された市販のアッセイキットに配置されたクロロトリアジン染料に基づいているマルチカラーのCPHとICB基板の新世代（ 表1の基質の完全なリスト）を使用しています。基質の酵素消化は、アッセイ溶液中で検出可能である小さい、可溶性、染色物が得られ、プレートリーダー9を用いて定量することができます。このアッセイは、 エンド -acting酵素の評価と分析の感度のために設計されていることは、他の方法は、 エキソ -acting酵素11,12のために用意されていながら、アズリン架橋された（AZCL）を使用して、1は、10基質類似しています。このアッセイキットの制限は、CPHとしてだけでなく、ICB基板が原因で色素と架橋剤分子8に起因する立体障害の可能性が最も高いエキソ -enzymesによって分解されない、 エンド -enzyme活性の検出にあります。 アッセイは、96 WELで行われますリットル形式と個々の反応は、ウェル中で行われます。反応は、再現データを受信するために、プレート内で混合されなければなりません。得られた上清を、各ウェルの吸光度を吸光度分光法を用いて定量することができる製品プレートに濾過します。基本原理およびアッセイのレイアウトは、アッセイは、基質とアッセイプレート（96ウェルフィルタープレート）から構成されている。 図1に示されている、酵素とのインキュベーション後、上清を透明なウェルプレートに通して濾過しますそして、吸光度は、酵素の特異性および活性の半定量的測定を提供する読み込まれます。 CPH基板を用い、このスクリーニングアッセイはまた、可溶性の反応生成物は、一晩のインキュベーション後に着色ハローを作る寒天プレート形式で使用することができることには、示されている。8 に示されているようにアッセイキットは、精製された酵素およびそれらの潜在的なサイド活性をスクリーニングするために使用され得ます図2サイドの活動は、単一の酵素およびその無差別特異性からも分析される試料は、異なる酵素の混合物であり、それらの相乗効果を研究する必要があるという事実から生じ得ます。それは以前の研究で示されているように加え、真菌8ならびに内因性植物酵素および細菌（未発表データ）からの酵素カクテル、腸内微生物叢13と培養ブロスを酵素源として使用することができます。 ICB基板は、多くの場合、バイオマス分解の工業プロセスで遭遇する細胞壁成分の複雑な混合物に対処します。これらの基板は、多糖の可用性を評価し、効果的に、より効率的な分解出力のための劣化カクテルを最適化する方法についての情報を提供するように設計されています。 図3に示すようにCPHとICB基板が側によって酵素のスクリーニング側で使用することができます-酵素特異性のANに関する豊富な情報を明らかに好ましい基質（CPH）とより密接な性質（ICB）で見つかった巨大分子集合体を模倣好ましい基材に加えて他の成分を含む、より自然な複合体の文脈の両方でD活性。複数の色の使用は、アッセイの高スループットと多重度を増加させるいくつかの基板に対して異なる酵素活性の同時検出を可能にします。異なる色素のスペクトルは、単純な線形回帰によって解決することができ、ほとんどの場合、多基質活性は、単独で、目視で観察することができます。このような実験とその結果のシミュレーション例を図4に示されています。 このアッセイツールボックスとその応用の汎用性は、未知の活性を有する酵素及び培養ブロスの最初のレベルのスクリーニングのために非常に適しています。このアッセイの最も重要な側面は、その高スループットの性質、カスタマイズ、使いやすく柔軟性に優れています。このことを念頭に置いて、ワットeはツールのこの小説セットが大幅に改善し、産業用酵素のスクリーニングのプロセスだけでなく、学術的なアプリケーションを高速化することを考えています。

>jove_content<近年、ゲノムとメタゲノムをマイニングする技術は急速に発展しており、組換え酵素のクローニングと発現のための中・ハイスループット戦略も急速に発展しています。さらに、バイオインフォマティクスリソースと(CAZy)1,2などの関連保管機関は大幅に拡大しています。しかし、微生物の酵素の多様性を産業目的で利用することには、かなりの課題が内在しており、酵素活性の経験的決定は今や深刻なボトルネックとなっています。例えば、現在の方法を使用しても、CAZyデータベース内のタンパク質の活性を安全に予測できるのは4%以下であると推定されています。酵素活性のモニタリングには数多くの方法がありますが、それらすべてにいくつかの制限があります。クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせた確立された技術は、グリコシル加水分解酵素(GH)活性のオリゴマーフラグメントを評価するために利用可能です3,4。ただし、これらのアプローチは労働集約的であり、一般的に低スループットです。ジニトロサリチル酸5やNelson-Somogyi6アッセイなどの還元糖の測定に基づく方法は、GH活性の評価に広く使用されています。しかし、これらのアッセイはスループットが限られており、副反応を起こしやすい可能性があります。酵素活性の測定には、アズリン架橋(AZCL)などの個々の発色多糖基質が広く使用されていますが、すべての基質を個別に購入し、アッセイプレート内で基質粉末を手動で分配することは面倒で費用がかかる可能性があります7。
私たちは、クロロトリアジン染料をベースにした新世代の発色性ポリマーハイドロゲル(CPH)基質を開発しました。この基質は、96ウェルフィルタープレートと組み合わせて使用すると、ハイスループットなアッセイシステムを形成します。リグノセルロース系バイオマスに存在するような複雑なポリマー混合物内の基質の利用可能性に関する情報を提供する追加の不溶性発色バイオマス(ICB)基質が開発されました。各基材は4色のいずれかで作製でき、異なる色の基材を1つのウェルに組み合わせることができます。このプロトコルでは、この方法論が多種多様な多糖類およびタンパク質に適用でき、GH、溶解性多糖類モノオキシゲナーゼ(LPMO)およびプロテアーゼをスクリーニングする可能性が示されています。96ウェルプレートの使用には特定のプロトコルが提供されており、代表的な結果は、酵素スクリーニングのツールとしてのCPHおよびICB基質キットの高効率を示しています。
記載されているアッセイキットの大きな利点の一つは、基質に関係なく、活性化ステップの後、15分以内にキットが使用できる状態になることです。これにより、他のいくつかの方法の場合のように、生の基質材料からアッセイを組み立てる時間のかかる必要性がなくなる7。CPHおよびICB基板は、優れた保存性(室温で少なくとも1年間)、pHおよび温度安定性8を備えており、特別な機器やトレーニングは必要ありません。CPHまたはICBアッセイは、酵素との反応が行われる96ウェルフィルタープレートに基づいています。酵素が所与の基質で活性である場合、可溶性染色オリゴマーが生成され、着色された上清が生成され、その後、真空マニホールドまたは遠心分離機8を使用して通常のクリアウェル96ウェルプレートにろ過することができる。
基質は可視スペクトル（VIS）の範囲で吸収するクロロトリアジン染料で染色されており、個々の色（赤、青、黄、緑）は、異なる色の異なるCPH基質が一つのウェルで混合され、酵素が複数の基質に作用する場合、線形回帰を用いて分解することができます。得られた上清を含むプレートは、VIS範囲の吸光度を測定できる標準的なマイクロタイタープレートリーダーを使用して測定できます。1つのウェルで異なる色の異なる基質を混合すると、アッセイシステムのスループットが向上し、96ウェルプレートで合計384回の実験が可能になります(ウェルごとに異なる色の4つの異なる基質)。
CPH基質は、酵素の特定の活性を評価するための貴重なツールを提供し、ICB基質は、酵素がバイオマス内で通常遭遇する複雑な基質混合物の文脈内で、酵素が成分を消化する能力を評価するために使用されます。 ICB基質は個々の酵素特異性に関する情報を提供しませんが、それでも酵素、カクテル、またはブロスの商業的性能を評価するための有用なツールです。

<table><tbody><tr><td>アッセイキットプレート</td><td>グリコスポット</td><td></td><td>カスタマイズアッセイキットプレート</td></tr><tr><td>活性化ソリューション</td><td>CPH基板を活性化するための</td><td>グリコスポット</td><td></td></tr><tr><td>真空マニホールド用350mlレシーバープレートスペーサーブロック</td><td>ポールコーポレーション</td><td>5015</td><td>スペーサーブロック</td></tr><tr><td>96ウェルマルチスクリーンHVフィルタープレート、0.45 & マイクロ;m、透明、非滅菌</td><td>ミリポア</td><td>MSHVN4510</td><td>アッセイプレート</td></tr><tr><td>96ウェルマイクロプレート、ポリプロピレン</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td>基板洗浄後のコレクションプレート</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96ウェルマイクロプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>269620</td><td>製品プレート</td></tr><tr><td>ダイヤフラムポンプ MZ 2 NT</td><td>Vacuubrand</td><td>732000</td><td>真空ポンプ 真空マニホールド</td></tr><tr>と併用<td>インフォサーHT エコトロン</td><td>インフォサーHT</td><td>4950132(ブーフ&Holm)</td><td>水平シェーカー</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td>10067-750 (VWR)</td><td>96-well plate absorbance reader</td></tr><tr><td>真空マニホールド</td><td>ポールコーポレーション</td><td>5017</td><td>真空マニホールド</td></tr><tr><td>endo-セルラーゼ (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td>セルラーゼ [cel]</td></tr><tr><td>endo-&β;-1,4-マンナナーゼ (Cellvibrio japonicus)&nbsp;</td><td>メガザイム</td><td>E-BMACJ</td><td>マンナナーゼ [マン]</td></tr><tr><td>endo-&β;-1,3-グルカナーゼ (トリコデルマ属)</td><td>メガザイム</td><td>E-LAMSE</td><td>&β;-グルカナーゼ [glu]</td></tr><tr><td>endo-&β;-1,4-D-ガラクタナーゼ (Aspergillus niger)&nbsp;</td><td>メガザイム</td><td>E-EGALN</td><td>ガラクタナーゼ [gal]</td></tr><tr><td>endo-&β;-1,4-キシラナーゼ M4 (Aspergillus niger)&nbsp;</td><td>メガザイム</td><td>E-XYAN4</td><td>キシラナーゼ [キシル]</td></tr><tr><td>endo-キシログルカナーゼ (GH5) (Paenibacillus sp.)&nbsp;</td><td>メガザイム</td><td>E-XEGP</td><td>キシログルカナーゼ [xg]</td></tr><tr><td>&α;-アミラーゼ (Bacillus licheniformis)&nbsp;</td><td>メガザイム</td><td>E-BLAAM</td><td>アミラーゼ [amy]</td></tr></tbody></table>

新規不溶性発色基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) は、生体内で複数の役割を果たし、バイオ燃料、繊維、洗剤、製紙、食品産業での工業加工に広く使用されています。CAZymesをより深く理解することは、基礎生物学と産業学の両方の観点から重要です。自然界(特に微生物)には膨大な数のCAZymeが存在し、数十万がカタログ化され、carbohydrate active enzyme database(CAZy)に記載されています。しかし、推定される酵素の発見率は、その活性を生化学的に特徴付ける私たちの能力を上回っています。この理由の1つは、ゲノムおよびトランスクリプトームシーケンシングの進歩と関連するバイオインフォマティクスツールにより、候補CAZymeの迅速な同定が可能になりましたが、酵素の生化学的特性を決定する技術の進歩が遅いことです。この技術のギャップに対処するために、ここでは不溶性発色基質に基づく新しいハイスループットアッセイキットについて説明します。Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) 基質 (精製多糖類とタンパク質から作製) と I不溶性 Chromogenic Biomass (ICB) 基質 (複雑なバイオマス材料から作製) の 2 つの異なる基質タイプが作製されました。CPHおよびICB基質は、96ウェルのハイスループットアッセイシステムで提供されます。CPH基質は4つの異なる色で作ることができるため、それらを混合することができ、アッセイのスループットが向上します。このプロトコルは、96ウェルプレートアッセイについて説明し、このアッセイを酵素、酵素カクテル、およびブロスの活性のスクリーニングにどのように使用できるかを示しています。

高スループットと、このアッセイの多重化能力は、96ウェルフィルタープレートに配置された不溶性の発色性ポリマー（またはタンパク質）ヒドロゲル（CPH）基板に基づいています。酵素ならびにネガティブコントロールは、アッセイキットプレート（ 図1A）に添加し、酵素、着色上清（ 図1B）の製造に対応する基質を分解する。反応が完了した後、上清を透明なウェル製品プレートに移し、吸光度を96ウェルプレート（ 図1C）のために適切な分光光度計を用いて直接測定することができます。 酵素の異なる濃度でのキシラナーゼのCPH-アラビノキシランの用量反応の例（0.00 - 0.75 U / ml）を減少させる酵素濃度を視覚的に観察することができ、図1Dに示されています。より詳細な分光光度定量ificationは酵素濃度（ 図1E）に対する吸光度をプロットするために使用することができます。信号強度は、酵素活性に相当します。アッセイの再現性は、エラーバー（3つの複製の平均値の標準誤差、SEM）によって示されています。このアッセイの再現性に関するより詳細な実験は、他の場所8公開されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig1.jpg" /> 。A）CPH基板とアッセイキットプレートのスキーム（ 例えば 、CPH-アラビノキシランが）ただ、酵素1及び2と緩衝液の添加前に、96ウェルフィルタープレートのウェルにロードCPH-アラビノキシランの 図1. キシラナーゼ処理真空補助filtrat時C）;のみのコントロール（酵素1は、 エンド -xylanase活性を有していた）; B）酵素1によりCPH-アラビノキシランの劣化が着色上清を生産製品版へにおける上清のイオン、吸光度を分光光度法で測定される; 100 mMの中でエンド -β-1,4-キシラナーゼの異なる濃度の4つの異なる色でCPH-アラビノキシランの治療後の反応生成物を含むD）製品板酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4.5、室温で60分間; E）分光光度計を用いて、Dからの反応生成物の定量<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 酵素のスクリーニングこのアッセイを使用するための別の選択肢があります。 1つのオプションは、未知の活性を有するエンド -enzymes、例えば 、（精製）の少数をスクリーニングするための別の多糖類を含む96ウェルプレートを使用することです。この場合、結果はdegradである多糖類が表示されます標的酵素によってできます。この原理を表示するには、 遠藤 -cellulaseは、25℃で異なるCPH基質に対して試験しました。三つの異なる酵素濃度（0.5 U / mlを、1.0 U / ml及び5U / ml）を30分間インキュベートしました。結果は、製品のプレート（ 図2A）ではっきりと見えます。サプライヤーが提供する-cellulaseこのエンドの製品シートは、キシログルカン（タマリンド）のためのサイドアクティビティ、大麦βグルカン、グルコマンナン、カバノキキシランおよびガラクトマンナンのための低サイドアクティビティを指定します。これと一致し、セルラーゼへの追加の活動はCPH-βグルカン（大麦）に対して、CPH-キシログルカン（タマリンド）、CPH-キシラン（ブナ）と低活性CPH-ガラクトマンナン（ 図2B）に対して発見されました。グルコマンナンは試験しませんでした。同じCPH基板は市販の酵素（三つの異なる酵素濃度：0.1 U / mlで、0.5 U / mlおよび1.0 U / ml）で消化した前と同じ条件下で、陽性対照として使用し実験。全ての基質は、陽性対照の酵素によって分解された信号強度は、より高い酵素濃度（ 図2C）に対応する増加しました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig2.jpg" /> 図2の 8つの異なるCPH基板を異なる濃度で、30分。A） エンド -cellulaseで消化異なるCPH基質の生成物プレートを25℃で攪拌しながらインキュベートした 。B）活性との様々な副活性の定量化エンド -cellulase。 。E-LAMSEとCPH-パキマン、CPH-カードラン、CPH-;エラーバーは、3つのレプリカC）に対応するCPH基板（エンド-セルラーゼおよび2-HE-セルロースとは異なる市販酵素の活性の平均値の標準誤差を表しますβグルカン（大麦）; E-XYAN4とCPH-キシラン、E-XEGPとCPH-キシログルカン、E-BLAAMとCPH-アミロース、E-BMACJとCPH-ガラクトマンナン;メガザイムからすべての酵素）。エラーバーは、2つのレプリカの平均値の標準誤差を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 彼らは部分的にはバイオマスの主要成分である植物の細胞壁多糖類の自然な配置を維持するので、不溶性発色性バイオマス（ICB）基板は、発色基質のレパートリーに有用で加えています。 CPHとICB基板が液体培地で培養したときファネロカエテ・クリソスポリウムの分泌された酵素を分析するためにこの例で使用されています。アッセイキットプレートのプレート設定は19 CPH基板5 ICB基板（各基板、 図3Bは4ウェル）で、 図3Aに示されている。P.クリソスポリウムは cultivatました三日編、その後、培養上清を分析しました。したがって、125μlの200mMの緩衝液を各ウェルに移し、25μlの培養上清を添加しました。三つの異なるpH条件は、酢酸ナトリウム緩衝液pH 4.0、リン酸ナトリウム緩衝液pH 6.0またはpH 8.0（ 図3C）を用いて試験されてきました。プレートを2時間25℃で（150 rpm）を振とう培養しました。 反応生成物は、製品のプレート（ 図3D）に移し、そして分析した。P.クリソスポリウムは 、様々なグルカン、デンプンおよびキシラン（ 図3E）の分解酵素を生産します。下側の信号は、ヘミセルロースのアラビナン（甜菜）およびペクチンガラクタンのためだけでなく、RGI（大豆）のために検出することができました。産生される酵素は、中性またはわずかに塩基性条件下（pHは8.0）よりも酸性条件（pH値4.0）でより活性でした。 ICB基質に対する低い活性（ 図3F）多糖類はより自然な文脈である場合には、酵素の効率は純粋な多糖類と同じではないことを示している、それは生または事前に適用された場合ICB基板は、酵素の効率上のより現実的な見解を示さ理由です処理された植物材料。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig3.jpg" /> 19 CPHと5 ICB基板を含む複数の基板プレートを使用して、 ファネロカエテ・クリソスポリウム の3日齢の液体培養からの培養上清の 図3. スクリーニング 。A）各個別の基板のための4つのウェルを有するプレートのセットアップのスキーム（灰色の背景= CPH基板、オレンジ色の背景= ICB基板）。B）基質を含むアッセイプレートの写真。C）Schemeはその実験に用いた緩衝液条件を示します（200 mM酢酸ナトリウムpH4.0のリン酸ナトリウムpH6.0のリン酸ナトリウムのpHは8.0）。D）25℃Eで2時間後に、製品版の画像）吸光度を517 nmで検出し、各個々のCPH基板及びFに対してプロットしました。それぞれの酵素のための）ICB基板結果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 発色基質は、単一の酵素を用いて、またはカクテル酵素1ウェルに異なる色CPH基質の混合物を用いて処置した後の反応上清を分析することによって相乗効果を研究するために使用することができます。 図4に示す次の例では、赤色CPHセルロース及び黄色CPHキシラン基質は約EQUで混合し96ウェルフィルタープレートのウェル中のAl比は、 図4（a）は、酵素なし（コントロール）、セルロースCEL（2 U / ml）を、キシラナーゼXYL（1 U / mL）で室温で1時間処理後の着色した反応生成物を示します両方の酵素の混合物を100 mM酢酸ナトリウム緩衝液pH 4.5（3、各アプローチのために複製します）。分析のために、反応生成物は700nmで（ 図4B）に350nmでの吸光度スペクトルを走査することにより分光光度法で定量しました。多くの場合、単独で目視検査は、異なる色素から生じる吸収スペクトルは、各劣化の程度のより正確な指標を与えるために、単純な線形回帰8を使用して解決することができるが記録された酵素は、1つまたは複数の基板上に作用しているかどうかの指示を与えることができます混合物から基板。 混合物としてCPH基板を使用すると、実質的にSCRを可能にするアッセイのスループットを増大させます一つの実験（1ウェル）で、最大4つの異なる基板に対してeening。青CPH-βグルカン（大麦）、黄色CPH-キシラン（ブナ材）、緑CPHアミロースと赤CPH-ペクチンガラクタン（ルピナス）：示された例で使用される4つの異なる基質です。基板プレートのレイアウトは、 図4Cおよび図4Dにおけるアッセイプレートの画像に示されています。反応物を25℃、150rpmで30分間、100 mM酢酸ナトリウム緩衝液pH 4.5で行いました。製品版で期待どおりに増加し、酵素濃度との最初の単一の酵素が対応するCPH基板（ 図4E）と着色上清を用いて試験したが受信された（ 図4F、行1A - 12D）。行Eが含まれているCPH-キシランと青CPH-βグルカン、 エンド -xylanaseおよびエンド -グルカナーゼ対応する酵素の異なる比で分解された2つの異なるCPH基板黄色。反応後、結果はvisibですル製品板で：より多くのエンドのグルカナーゼが存在した時に反応生成物の色は、暗い緑、青だった（ 図4F、4E-6E）およびエンド -xylanase濃度が増加したとき、軽い黄緑色に変わりました（ 図4F、10-12E）。同じことが、二枚の基板の赤CPH-ペクチンガラクタンと黄色のCPH-キシランは、 エンド -galactanaseおよびエンド -xylanaseで分解した行F、に見られます。すべての4つの異なる色のCPH基板が存在した（ 図4F、1G-12F）と単一酵素が適切なCPH基質を分解し、付加的な添加によって着色された反応生成物の組み合わせは受信された酵素。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig4.jpg" /> 図4. 異なる酵素で処理された二つの異なるCPH基板の組み合わせ、赤CPH-セルロースと黄色のCPH-キシラン、。 A）反応上清を反応上清のエンド -cellulase（ セル ）またはエンド -xylanase（XYL）または両方の酵素。B）吸光スペクトルを有する二枚の基板を処理した後。異なる酵素で処理された四つの異なるCPH基質の組み合わせC）CPH基板を含む基板プレートのスキーム：青CPH-βグルカン（大麦）、黄色CPH-キシラン（ブナ材）、緑CPHアミロースと赤CPH-ペクチンガラクタン（ルピナス）D）異なるCPH基質を含有するアッセイプレートの写真E）を添加酵素（名目濃度（NC）の比率を示す製品板のスキーム：GLU = 1 U / mlのエンド -グルカナーゼ、 25℃で30分間のインキュベーション後に製品版の= 1 U / mlのエンド -xylanase、 花子 = 5 U / mlのエンドアミラーゼとギャル = 0.5 U / mlのエンド -galactanase）。F）の画像をXYL。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 基板 </td><td> ソース </td></tr><tr><td> CPH -2-ヒドロキシ</td><td rowspan="2"> N / A </td></tr><tr><td> （CPH-2-HEセルロース） </td></tr><tr><td> CPH-アミロペクチン</td><td>ポテト</td></tr><tr><td> CPH-アミロース</td><td>ポテト</td></tr><tr><td> CPH-アラビナン</td><td>テンサイ</td></tr><tr><td> CPH-アラビノキシラン</td><td>小麦</td></tr><tr><td> CPH-カゼイン</td><td>牛乳</td></tr><tr><td> CPH-キトサン</td><td>動物起源</td></tr><tr><td> CPH-カードラン</td><td> アルカリゲネス・フェカリス </td></tr><tr><td> CPH-デキストラン</td><td> ロイコノストック属。 </eメートル&gt; </td></tr><tr><td> CPH-ガラクトマンナン</td><td>イナゴマメ</td></tr><tr><td> CPH-ラミナリン</td><td> ラミナリアdigitata </td></tr><tr><td> CPH-リケナン</td><td>アイスランドの苔</td></tr><tr><td> CPH-メチルセルロース</td><td> N / A </td></tr><tr><td> CPH-パキマン</td><td> ポリアココス </td></tr><tr><td> CPH-ペクチンガラクタン</td><td>ポテト</td></tr><tr><td> CPH-プルラン</td><td> アウレオバシジウムプルランス </td></tr><tr><td> CPH-ラムノガラクツロナンI（RG I） </td><td>ポテト</td></tr><tr><td> CPH-ラムノガラクツロナンI（-Gal）* </td><td>ポテト</td></tr><tr><td> CPH-ラムノガラクツロナン</td><td>大豆</td></tr><tr><td> CPH-キシラン</td><td>ブナ材</td></tr><tr><td> CPH-キシログルカン</td><td>タマリンド</td></tr><tr><td>大麦からCPH-βグルカン</td><td>大麦</td></tr><tr><td>オート麦からのCPH-βグルカン</td><td>エンバク</td&gt; </tr><tr><td>酵母からのCPH-βグルカン</td><td>酵母</td></tr><tr><td> ICB-シロイヌナズナ</td><td>ロゼットは、 シロイヌナズナ COL-0（成人の植物）の葉から</td></tr><tr><td> ICB-シロイヌナズナの種子</td><td> シロイヌナズナ </td></tr><tr><td> ICB-バガス</td><td> サトウキビのofficinarum（乾燥した大人の植物、茎と葉） </td></tr><tr><td> ICB結晶セルロース（濾紙） </td><td>商用たWhatman 3MM Chr関数クロマトグラフィー紙</td></tr><tr><td> ICB-フェヌグリーク種子</td><td> Trigonella属の種</td></tr><tr><td> ICB-麻</td><td> 大麻属 （乾燥した大人の植物、茎と葉） </td></tr><tr><td> ICB-ルピナス種子</td><td> ルピナスのangustifolius種子 </td></tr><tr><td> ICB-花粉P. pratense </td><td> チモシー花粉 </td></tr><tr><td> ICB-トウヒ</td><td> トウヒ属 （マイル満たさ木の幹） </td></tr><tr><td> ICB-タバコ</td><td> ベンサミアナタバコの葉から（若い植物） </td></tr><tr><td> ICB-麦わら</td><td> コムギ属 （乾燥した大人の植物、茎と葉） </td></tr><tr><td> ICB-ヤナギ</td><td> ヤナギ属 （乾燥した大人の植物、粉砕された木の幹） </td></tr><tr><td> ICB-ソルガム</td><td> ソルガム属 （大人植物から葉） </td></tr><tr><td colspan="2"> *（ エンド -β-1,4-D-ガラクタで除去β-1,4-D-ガラクタン側鎖） </td></tr></tbody></table> 表1. 利用可能な発色性高分子ハイドロゲル（CPH）と不溶性発色バイオマス（ICB）基板の一覧。

酵素スクリーニングのためのハイスループットアッセイについて説明しています。このマルチプレックスのすぐに使用できるアッセイキットは、事前に選択されたC高原性PオリマーHイドロゲル(CPH)基質と複合体I不溶性C糖素性Bアイオマス(ICB)基質で構成されています。標的酵素は、多糖類分解エンド酵素とプロテアーゼです。

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

この発色アッセイの総合的な目的は、さまざまな酵素を、選択した異なる発色基質に対してハイスループット形式でスクリーニングすることです。この手法は、バイオマスの分解に向けた新しい酵素活性の探索など、酵素発見分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、発色基質が4色の異なる色で利用可能であるため、ハイスループットで極めて信頼性が高く、費用対効果に優れていることです。まず、96ウェルフィルターアッセイキットプレートの各ウェルに活性化溶液を200 µLずつ加えて活性化させます。室温で10分間、静置してインキュベートします。回収には、遠心分離機と標準的な96ウェルプレートを使用してください。既存の活性化溶液をスピンダウンさせるため、発色性ポリマーハイドロゲル（CPH）基質に100 µLの滅菌水を加え、真空吸引または遠心分離を行って安定剤を除去します。この洗浄工程をさらに2回繰り返します。酵素反応を準備するため、アッセイキットプレートの各ウェルに、100 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）150 µLと、3種類の異なる濃度のエンドセルラーゼ溶液 5 µLを加えます。シェーキング中に反応プレートから液漏れが発生した場合に備え、アッセイキットプレートの下にプロダクトプレートを配置します。次に、アッセイキットプレートを水平シェーカーに入れ、室温で100 rpmにて30分間インキュベートします。信頼性の高いデータを得るためには、インキュベーション中に反応混合物を撹拌する必要があります。アッセイキットプレートの下にプロダクトプレートを重ねて遠心機にセットし、2,700 x gで10分間遠心分離（スピンダウン）します。これにより、反応産物がプロダクトプレートのウェルへと移行します。遠心後、プロダクトプレートを目視で確認し、各ウェルの液量がほぼ一定であるかを確認してください。プレートリーダーを用いて、さまざまな緑色CPH基質に対するコレクションプレートの吸光度を630 nmで測定します。テキストプロトコルに従ってデータを解析し、プロットしてください。赤色の不溶性発色バイオマスまたはICB-小麦わらを用いて発色アッセイを行う場合は、まずアッセイプレートの各ウェルに200 µLの活性化溶液を加えることから始めてください。次に、プレートを室温で10分間、静置してインキュベートします。滅菌水100 µLを用いてウェルを3回洗浄し、スタビライザーを除去します。その後、100 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）150 µLと、10 units/mLの異なるエンドキシラナーゼ溶液5 µLを添加します。シェーキング中の基質プレートからの漏出を回収するため、基質プレートの下に生成物プレートを配置します。室温、100 rpmで2時間、反応をインキュベートします。インキュベーション後、生成物プレートを下に重ねた状態でアッセイキットプレートを遠心機にセットし、2, 700 x gで10分間遠心分離して、反応生成物を生成物プレートのウェルに回収します。各ウェルの液量がほぼ同一であることを確認します。次に、プレートリーダーを用いて、赤色ICB-小麦わらの回収プレートの吸光度を517 nmで測定します。テキストプロトコルに従ってデータ解析を行ってください。ここでは、異なる濃度のキシラナーゼに対するCPH-arabinoxylanの用量反応の例を示しており、酵素濃度の低下を視覚的に確認することができます。より詳細な分光光度定量を用いて、吸光度を酵素濃度に対してプロットします。この信号強度が酵素活性に対応します。酵素スクリーニングに使用されるこのアッセイ例では、3つの濃度のエンドセルラーゼを用いて、異なるCPH基質に対する活性を試験しました。ここに見られるように、CPH-glucan、CPH-xylan、CPH-xyloglucanに対してはセルラーゼ以外の活性が示され、CPH-galactomannanに対しては低い活性が認められました。同一の条件で、ポジティブコントロールとして使用した市販の酵素を用いて、同じCPH基質の消化を行いました。ここでの結果は、すべての基質が、酵素濃度の増加に伴い分解レベルが上昇したことを示しています。本実験では、3つの異なるpH条件下で Phanerochaete chrysosporium の分泌酵素を分析するため、19種類のCPH基質とともに5種類のICB基質を用いました。P. chrysosporium の酵素は、さまざまなグルカン、デンプン、およびキシランを分解しました。ヘミセルロースであるアラビナンやペクチン質ガラクタン、およびRGIについては、より低いシグナルが検出されました。産生された酵素は、中性または弱塩基性の条件よりも酸性条件下でより高い活性を示しました。この手法を習得し、適切に実施すれば、1時間以内で完了させることができます。この手順を行う際は、インキュベーション中に反応液を混合することが重要です。この手法の開発により、ハイスループットスクリーニング分野の研究者がバイオテクノロジーに向けた新規の酵素活性を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、スクリーニングキットの使用方法について十分に理解できるはずです。

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