核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

核酸のろ過分離法（FINA法）の全体的な目的は、遠心分離機などの実験器具を使用せずに、複雑な検体からPCR増幅用のゲノムDNAを迅速かつ簡便に単離することです。HIVプロウイルスDNAを対象としたこの迅速なペーパーベースのDNA抽出法は、定量PCR診断デバイスへの組み込みを目的として開発されました。この技術の主な利点は、サンプル調製モジュールとPCRチューブを事前に準備できるため、DNA抽出に2分未満しか時間がかからないことです。

私たちはまず、踵穿刺（かかとせんし）による採取血を用いた乳幼児のHIV-1早期診断テストに組み込むためにこの手法を開発しました。一般的に、この手法に慣れていない方は、セルキャプチャー膜をPCRチューブの側面に固定するための両面テープの剥離地を剥がす操作に習熟が必要であるため、苦労する可能性があります。本手順の実演は、私の研究室のシニアテクニシャンであるJen Reedが行います。

FINA試料調製モジュールの組み立てに必要な材料を準備して、本手順を開始します。厚さ2.6 mmの綿100%パッドを35 mm四方に切り出し、ブロッティングパッドを準備します。また、紙製バッキングテープ付きのプラスチック製パラフィンフィルムを準備します。

25 by 50 mmのパラフィンフィルムを切り出し、ハンマーを用いてテープの中央に直径7.14 mmの穴を開けます。ハンマーを用いて直径8.35 mmの円を打ち抜き、結合ガラス血液分離膜またはキャプチャーディスクを準備します。FINA試料調製モジュールを組み立てるには、ピンセットを使用してキャプチャーディスクをブロッティングパッドの中央に配置します。

パラフィンフィルムテープの剥離紙を取り除き、キャプチャディスクの中央部分が露出するように、ディスクの上に貼り付けます。パラフィンテープを軽く伸ばしてブロッティングパッドを覆い、ディスクの全周囲のエッジに沿ってテープを強く押し付けることで、ディスクとブロッティングパッドが最大限に密着するようにしてください。キャプチャ膜がリアルタイムPCR装置の蛍光検出を妨げないよう、膜をqPCRチューブの側面に固定するために5.1 mmのテープディスクが必要です。

ハンマーを用いて、ダブルコートポリエステル診断用テープのシートから円形に打ち抜き、このテープディスクを準備します。ピンセットを使用して、テープステッカーライナーの片面を剥がします。テープを200 µL PCRチューブに入れ、チューブの内側底面付近に貼り付けます。

2枚目のステッカーライナーを取り除きます。これで、チューブに準備したディスクを入れる準備が整いました。このビデオでは、8e5 LAV細胞をスパイクした全血からのプロウイルスDNAの検出を実演します。

以前に凍結した8e5個のLAV細胞ペレットを氷上で解凍します。凍結保存液を用いて、1〜400 cells/µLの濃度範囲で細胞の段階希釈液を調製します。各希釈液から10 µLの細胞をマイクロ遠心チューブにピペットで分注します。

標準曲線を作成するため、各チューブに新鮮なHIV-1陰性のeDTA処理全血試料を100 µLずつ加えます。チューブの底を5回軽く弾いて混合します。DNA抽出の手順を開始するために、triton X-100を最終濃度1%になるように加えて血液細胞を溶解させます。

チューブの底を5回軽く叩いて混ぜ合わせます。血液は半透明の赤色になります。血液検体すべてをキャプチャーディスクにピペットで分注します。

パラフィンテープとキャプチャーメンブレンの間を水密にシールすることで、血液が確実にメンブレンを通過するようにします。また、コンタクトメンブレンとブロッティングパッドアセンブリを十分に密着させることで、サンプルの迅速な吸い上げが可能になります。サンプルがフィルターに完全に浸透するまで待ちます。

血液溶解物がキャプチャディスクに浸透し、ディスクがマットな外観になります。10 mmol 水酸化ナトリウムを 600 ～ 1,000 µL、キャプチャディスク上に滴下します。フィルターが赤色から白色に変化し、ヘモグロビンの除去が示されます。

次に、ディスクをブロッティングパッドから切り離し、準備したPCRチューブ内のテープにディスクを貼り付けます。フィルターをPCRチューブに配置した後、すぐにサンプルの分析を行ってください。プロトコルの記述に従ってqPCRマスターミックスを調製し、フィルターがマスターミックスで完全に覆われ、反応中ずっとチューブの壁面に固定されていることを確認してください。

プロトコルの本文に記載されている通り、リアルタイムPCR装置を用いて増幅を行います。qPCRをすぐに実施できない場合は、代わりに硫酸カルシウム乾燥剤を入れたボックスの中でフィルターを一晩乾燥させてください。翌日、PCRチューブにキャップをし、シリカゲル乾燥剤と共にアルミ箔付きポーチに入れ、解析準備が整うまで室温で保存します。

この手法により、異なるコピー数の8e5 LAV細胞からHIV-1プロウイルスを効率的に増幅させることができます。実線は、内部コントロールを1反応あたり500コピー添加し、4,000、400、40、および10個の8e5 LAV細胞をスパイクしたHIV-1陰性全血の4反復測定から得られた増幅プロットです。点線は閾値を示しています。

次のグラフは、全血100 µLあたり8e5個のLAV細胞から算出された、増幅プロットに基づく定量サイクル値の標準曲線（対数コピー数に対してプロット）を示しています。算出されたPCR効率は103%でした。HIVプロウイルスDNAの標準曲線の再現実験においても、非常に再現性の高い増幅が確認されました。

さらに、内部コントロールとして500コピーのヒドロキシピルビン酸還元酵素が存在することで、HIV-1プロウイルスDNAのコピー数にかかわらず、この方法で血液を抽出することによるPCR阻害が起きていないことが示されています。実線は増幅プロットを、点線はしきい値を表しています。この手順に従うことで、さまざまな検体タイプからPCRターゲットを増幅し、目的の遺伝子を検出することが可能です。

例えば、薬理遺伝学的スクリーニング用の頬粘膜スワブや、動物モデルの迅速ジェノタイピング用の血液などが挙げられます。血液媒介性病原体を扱う操作は極めて危険である可能性があるため、本手順の実施中は常に標準予防策を講じることを忘れないでください。