Name: 核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学ぶFINA法による核酸の濾過単離技術。全血からHIVプロウイルスDNAを2分以内に抽出し、リアルタイムPCR検出を可能にする簡易迅速な紙ベースDNA抽出法です。遠心機不要で現場診断に応用可能。

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このプロトコル開発は、ビル&メリンダ・ゲイツ財団のグローバルヘルス助成金37774によって支援されました。リアルタイムPCR試薬とアドバイスは、Abbott Molecular Inc.(イリノイ州Des Plaines)から提供されました。 8E5-LAV細胞は、Rush PresbyterianのVirology Quality Assurance Laboratoryから提供されました。セントルークスメディカルセンター。HIV-1陰性の血液は、イリノイ州エバンストンのノースショア大学ヘルスシステムズのコアラボから提供されました。

倫理声明：本研究​​で使用した全血試料は、ヒトを対象とする調査であるとは考えられません。標本を満足し、臨床診断目的のために得られ、これらの試料の残りの部分は、FINA研究分析に供しました。標本は、研究者は容易に個人の身元を確認することができなかったようなコード化されました。 FINAのサンプル調製モジュールの作製<ol><li> 2.6ミリメートルの厚さの綿100％パッドの35×35ミリメートル2を切断することにより、ブロッティングパッドを準備します。試料ごとに一つのパッドをカットします。 </li><li> （50ミリメートル（ワット）で25ミリメートル（H））パラフィンフィルムの切断片によって裏紙テープでプラスチックパラフィンフィルムを作製した後、ハ​​ンマー駆動穴パンチを使用してテープの中央に7.14ミリメートルの直径の穴を打ち抜きます。検体につき1テープを準備します。 </li><li> 8.35ミリメートルの直径の円を打ち抜いて結合されたガラスの血液分離膜（捕捉膜）ディスクを用意ハンマー駆動穴パンチを使用して。試料ごとに1ディスクをパンチ。ディスクは、2.3ミク​​ロンの粒子保持能力を有します。 </li><li>ピンセットを用いてブロッティングパッドの中心に捕獲ディスクを配置することによってFINAサンプル調製モジュールを組み立てます。パラフィンテープの穴が露出キャプチャディスクの中心を残すように、捕獲ディスク上にパラフィンフィルムテープを配置します。 </li><li>ブロッティングパッドをカバーするために、わずかにパラフィンテープを延伸すると、ディスクのすべてのエッジの周りのブロッティングパッドにそれを固執するしっかりとパラフィンテープを押して、ディスクおよびブロッティングパッドとの間の最大接触を確認してください。 </li><li>将来の使用のための実験や備蓄のために必要な数のモジュールを作成します。 </li></ol>定量PCRチューブの作製<ol><li>両面polyeの円を打ち抜いて蛍光検出をブロックから膜を防止するために、定量PCRチューブの側に細胞捕捉膜を固定します5.1ミリメートルテープディスクを準備しますテープのシートからパンチを駆動ハンマーで診断テープをSTER。試料ごとに1つのテープディスクを準備します。 </li><li>テープのステッカーライナーの片側を削除してください。片面に、チューブの底に向かってそれを貼り、200μlのPCRチューブにテープを配置します。第二のステッカーライナーを取り外します。チューブは現在、準備されたディスクを受信する準備ができています。 </li><li>将来の使用のための実験や備蓄のために必要な数のチューブを生成します。 </li></ol> 3.工夫血液試料注意：本物の試験片を準備している場合は、手順4に進みます。 <ol><li>ウイルス学品質保証研究所から得られたHIV-1プロウイルスの単一コピーを保有解凍8E5-LAV細胞15（VQA;ラッシュプレスビテリアン/セントルークスメディカルセンター、シカゴ、IL。）。 注：これらは、/μL4,000細胞の濃度で凍結した細胞ペレットとして保存されています。以前9に記載のように細胞数を確認しました。 </li><li> SERを準備1から/μlの400細胞の範囲の濃度を培地（90％ウシ胎児血清、10％のジメチルスルホキシド）を凍結でIAL希釈。 </li><li>マイクロ遠心チューブに連続希釈液のそれぞれからピペット10μlの細胞。 8E5-LAVコピー数10-4,000の標準曲線を作成するために、各チューブに新鮮なHIV-1陰性EDTA処理した全血サンプルの100μLを加えます。優しくチューブの底を5回フリックすることにより混合します。 </li></ol> 4. FINA抽出を行います<ol><li> 110μlの全血およびステップ3.3からの細胞）の1％（11μlの10％のTriton-X100の最終濃度までのTriton-X100）を添加することによって溶解血液細胞。 </li><li>優しくチューブの底を5回フリックすることにより混合します。血液は半透明の赤を有効にしてください。 </li><li>ピペットキャプチャディスクへの血液検体のすべて。 注：パラフィンテープと捕捉膜との間に水密シールは、血液が膜を通って流れることを確実にし、キャプチャメートルとの間の良好な接触embraneとブロッティングパッドアセンブリは、迅速なサンプル上がりを確実にします。 </li><li>サンプルはフィルタを介してソークすることを可能にします。 注：毛細管現象によるブロッティングパッドへの血液溶解物の芯を、捕獲ディスクの表面上のゲノムDNAを捕捉します。それはマットを表示されたときに、溶解物をディスクに浸しました。 </li><li>キャプチャディスクに600-1,000μlの10 mMの水酸化ナトリウム滴下を追加します。 注意：洗浄緩衝液はまた、600μlに一括追加として追加することができます。バッファは、疎水性パラフィンテープ上の液滴を形成し、約20秒でディスクに穴を通って吸い上げます。フィルタは、ヘモグロビンのクリアランスを示す赤から白に変更されます。 </li><li>鉗子でブロッティングパッドからディスクを分離し、準備されたPCRチューブにテープにディスクを適用します。フィルター上に残って赤い色がある場合はチューブ内に配置する前にフィルタをクリアするには、洗浄緩衝液の50から100μlを添加します。 注：まれに、過剰な圧力は、調製時に適用されますブロッティングパッドから分離する際FINAモジュールの膜層の分割での結果。これらのディスクを破棄し、新しいサンプルを準備します。 </li><li>フィルタは、PCRチューブに入れた後、すぐにサンプルを分析します。また、硫酸カルシウム乾燥剤を含むボックス内の乾燥一夜は、その後の分析のための準備ができるまで、シリカ乾燥剤とストアとホイルポーチにキャップと場所。 </li></ol> 5.定量PCR反応<ol><li>以前9,11記載されているように、HIV特異的プライマーおよびプローブを用いて、反応あたり100μlの定量PCRマスターミックスを調製します。増幅阻害物質の存在を監視するために内部増幅コントロールを含めると負のサンプルが真の陰性であることを確認します。フィルタは完全にマスターミックスで、フィルターが反応全体のチューブの側面に固定されたままでいることを覆われていることを確認してください。 </li><li>以前9に記載のようにリアルタイムPCR装置を使用して増幅を行います。 </li></ol>

<ol><li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

迅速な治療へのアクセスに連結されたEIDは、HIV感染16による乳児死亡率を減少させることが実証されています。なぜなら乳児の血液中の母性抗体の持続性の、迅速なHIV抗体試験は、HIVに曝露された乳児の状態を決定する際に有用性が限られています。 WHOは、HIV-1陽性の母親から生まれたすべての乳児がウイルス学的検査17を使用して、4〜6週齢でテストされるべきであることをお勧めします。私たちは61南アフリカの乳幼児11の小さなフィールド評価で実証され、100％の感度と特異性を有する単一コピー検出が可能な全血検体中のHIV-1プロウイルスDNAの検出および定量のためのアッセイの開発を報告しています。全血の100マイクロリットル以上は指やかかとスティックを介して収集し、FINAモジュール18,19を介して処理することができます。これらの血液サンプルは、この方法IDEを行う増幅の前に少なくとも1ヶ月間保存することができますアルの研究室から離れている幼児をテストするため。 研究では、図3、...

いくつかの報告は、すべての利用可能な絶妙な感度および分子診断の特異性を作ることを目的に、ポイントオブケア（POC）機器1-5で使用するために紙-または膜ベースの抽出方法の開発について説明してきました。世界保健機関（WHO）性感染症の診断・イニシアティブは、POCの理想的な特性を記述するために（、、手ごろな価格に敏感な、具体的な、ユーザーフレンドリーな、迅速かつ堅牢な機器フリー、それを必要とする人々に配信）ASSURED用語を造語テスト6。これらのガイドラインの中で、設備のない特性は、分子診断のために達成することが特に困難です。しかし、フィールド内のすべての技術革新が最も必要としている人々に到達することを目標に進めていきます、と希望は、既存の技術7を適合させることにより、試験性能に短期的な改善のためにそこにあります。 ここでは、全血からDNAを抽出するための単純なプロトコルを記述するそれは、錯体化学や研究室の機器を必要としません。 FINA（核酸の濾過分離）試料調製方法は、当初のサンプルの回答ポイントオブケア（POC）定量的PCRの一部として、HIV-1プロウイルスを検出するために、全血からの白血球のDNAを抽出するために開発されました限られたリソースの設定8-11で使用するための（定量PCR）早期幼児診断（EID）プラットフォーム。 FINA抽出可逆カオトロピック剤12の存在下でDNAを結合するために、シリカ膜またはシリカ被覆常磁性粒子を用いる従来の精製方法とは異なります。その代わりに、FINAは、全血から直接細胞DNAを抽出するために、分離膜を介して垂直ろ過を使用しています。捕捉されたDNAを含む膜は、PCRチューブに直接配置し、いずれかのすぐ後で増幅9乾燥PCR反応または空気中で使用することができます。いいえカオトロピック剤、フェノール、またはアルコールをサンプル抽出に使用されていない、eliminaティン抽出プロセス13,14由来の強力な定量PCR阻害物質を除去するために必要な大規模な洗浄工程。 FINA膜は、試料が膜に追加される前に、細胞溶解11によって遊離細胞のいずれか9またはゲノムDNAを取り込むことができます。細胞捕獲のために、全血を膜に直接添加されます。細胞はその後10mMのNaOHを添加することにより、膜中に溶解されます。この方法の利点は、わずか3ステップ含むことである：1）サンプル添加を、定量PCRチューブ中2）細胞溶解/洗浄および3）フィルターディスクの配置。この方法の欠点は、膜が唯一の膜ディスクの直径に直接比例セルの定義された数を保持できることです。 EIDのために必要な検出限界に達するために、全血100μlを定量PCRチューブ内に配置するには大きすぎるフィルタを伴うサンプル入力のために必要とされます。コレクションに試料を添加する前に洗剤で血液細胞を溶解膜は、処理工程を追加し、同じサンプルサイズの小さいフィルタの使用を可能にします。我々は、高再現性、単一コピー検出し、この試験構成11を用いて血液100μlのからHIV-1プロウイルスDNAのわずか10コピーの定量化を実証することができました。 本稿では、もともと実験室での使用のために開発されたようFINAプロトコルを記述します。 FINAサンプル調製モジュールとして知られている膜/フィルターサンドイッチは、大きなバッチで調製し、後の使用のために備蓄することができます。試験片は、このプロセスを抽出する場合に2分間かかり、大きさのバッチを変えることで行うことができます。定量PCRは、すぐに実行することができ、または定量PCRを実行するために便利になるまで埋め込まれたDNAを含有するフィルターを格納することができます。この方法は、低および高リソースの設定の両方における試料のルーチン分析のために非常に便利です。

<table><tbody><tr><td>Fusion 5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>8151-9915</td><td></td></tr><tr><td>707 ブロッティングパッド</td><td>VWR International</td><td>28298-014</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM M</td><td>VWR International</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>3M ダブルコートポリエステル診断テープ&nbsp;</td><td>3Mメディカルスペシャリティ</td><td>9965</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;l qPCRストリップチューブ</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>光学ストリップキャップ</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005p qPCRシステム</td><td>Agilent</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>A.C.S.試薬</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>分子生物学の</td></tr><tr><td>ウシの胎児の血清のため、証明された、米国起源</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>ハンマーによって運転される小さい穴のパンチ3/16 "穴の直径(5.1 mm)</td><td>マクマスターカー3424A16</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハンマーによって駆動される小さい穴パンチ1/4 "穴の直径(7.14 mm)</td><td>マクマスター</td><td>カー3424A19</td><td></td></tr><tr><td>ハンマーによって駆動される小さい穴のパンチ5/16 "穴の直径(8.35mm)</td><td>マクマスター</td><td>カー3424A23</td><td></td></tr></tbody></table>

核酸の濾過単離：簡易迅速dna抽出方法

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA、核酸の濾過分離は、2分未満で、全血からの細胞DNAを抽出するために分離膜と吸収パッドを介して垂直濾過を利用する新規な抽出方法です。血液検体は、洗剤混合簡単で処理し、分離膜にピペットによって適用されます。溶解物は、分離膜の表面上にゲノムDNAを捕捉する、毛細管作用ブロッティングパッドに発散します。抽出したDNAは、PCR阻害剤が吸収性ブロッティングパッドに邪悪である、簡単な洗浄工程の間に膜上に保持されています。捕捉されたDNAを含む膜は、その後、さらに精製せずにPCR反応に添加されます。この単純な方法は、実験装置を必要とせず、簡単で安価な実験用消耗品を用いて実施することができます。ここでは、早期でのモデルとして100μlの全血からのHIV-1プロウイルスDNAの高感度検出および定量するためのプロトコルを記述します容易に他の遺伝子のターゲットに適合させることができるHIVのFANT診断。

8E5-LAV細胞でスパイクした全血からプロウイルスDNAを抽出するためのワークフローは、図1に示されている。 図2は、FINAサンプルモジュールを示し、定量PCRチューブを調製しました。不自然な標本の標準曲線（ 図3）に示すように、この方法は、異なるコピー数で8E5-LAV細胞からのHIV-1プロウイルスの効率的な増幅を可能にします。 PCRは、効率= -1 + 10（-1 /傾き）から計算されるように、103パーセントの効率を持っていました。直線の方程式は、R²= 0.996の相関と、= -3.25x + 27.95 yのでした。 HIVプロウイルスDNAの標準曲線を表1に明らかなように、再現性の高い増幅を持っている。また、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼは数にかかわらず、FINAと血液を抽出から生じる一切PCR阻害がないことを示すために存在する500コピーの内部統制を複製します現在のHIV-1プロウイルスのコ...

ここでは、定量的PCRにより検出された全血からのHIVプロウイルスDNAの簡単かつ迅速な紙ベースのDNA抽出方法を説明します。このプロトコルは、他の遺伝子マーカーを検出するか、代替的増幅方法を使用して使用するために拡張することができます。

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

核酸のろ過分離法（FINA法）の全体的な目的は、遠心分離機などの実験器具を使用せずに、複雑な検体からPCR増幅用のゲノムDNAを迅速かつ簡便に単離することです。HIVプロウイルスDNAを対象としたこの迅速なペーパーベースのDNA抽出法は、定量PCR診断デバイスへの組み込みを目的として開発されました。この技術の主な利点は、サンプル調製モジュールとPCRチューブを事前に準備できるため、DNA抽出に2分未満しか時間がかからないことです。私たちはまず、踵穿刺（かかとせんし）による採取血を用いた乳幼児のHIV-1早期診断テストに組み込むためにこの手法を開発しました。一般的に、この手法に慣れていない方は、セルキャプチャー膜をPCRチューブの側面に固定するための両面テープの剥離地を剥がす操作に習熟が必要であるため、苦労する可能性があります。本手順の実演は、私の研究室のシニアテクニシャンであるJen Reedが行います。FINA試料調製モジュールの組み立てに必要な材料を準備して、本手順を開始します。厚さ2.6 mmの綿100%パッドを35 mm四方に切り出し、ブロッティングパッドを準備します。また、紙製バッキングテープ付きのプラスチック製パラフィンフィルムを準備します。25 by 50 mmのパラフィンフィルムを切り出し、ハンマーを用いてテープの中央に直径7.14 mmの穴を開けます。ハンマーを用いて直径8.35 mmの円を打ち抜き、結合ガラス血液分離膜またはキャプチャーディスクを準備します。FINA試料調製モジュールを組み立てるには、ピンセットを使用してキャプチャーディスクをブロッティングパッドの中央に配置します。パラフィンフィルムテープの剥離紙を取り除き、キャプチャディスクの中央部分が露出するように、ディスクの上に貼り付けます。パラフィンテープを軽く伸ばしてブロッティングパッドを覆い、ディスクの全周囲のエッジに沿ってテープを強く押し付けることで、ディスクとブロッティングパッドが最大限に密着するようにしてください。キャプチャ膜がリアルタイムPCR装置の蛍光検出を妨げないよう、膜をqPCRチューブの側面に固定するために5.1 mmのテープディスクが必要です。ハンマーを用いて、ダブルコートポリエステル診断用テープのシートから円形に打ち抜き、このテープディスクを準備します。ピンセットを使用して、テープステッカーライナーの片面を剥がします。テープを200 µL PCRチューブに入れ、チューブの内側底面付近に貼り付けます。2枚目のステッカーライナーを取り除きます。これで、チューブに準備したディスクを入れる準備が整いました。このビデオでは、8e5 LAV細胞をスパイクした全血からのプロウイルスDNAの検出を実演します。以前に凍結した8e5個のLAV細胞ペレットを氷上で解凍します。凍結

filtration-isolation-nucleic-acids-simple-rapid-dna-extraction

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ツールと化学が順次電気を必要とせずにサンプルからのタンパク質に続いて核酸を分離するために記述されています。このツールは、分離化学を固相抽出の原則に基づいている間に転送ピペット内に保持されて吸着剤から構成されています。隔離された高分子は、免疫系とPCRベースのアッセイにより分析することができます。...

電気鉛フリー、シーケンシャル核酸およびタンパク質の分離

出典：Dembowski, J. A. 他。ウイルスに関連するウイルスおよび細胞タンパク質の同定のためのウイルスDNAの精製。J. Vis. Exp. (2017)。このビデオでは、クリック化学と磁気ビーズ精製を用いて、細胞核からタンパク質-ウイルスDNA複合体を単離する方法を実演します。プロトコルには、アルキン修飾ヌクレオチドによるウイルスゲノムの標識、クリック反応を介したビオチン化、およびストレプトアビジンコート磁気ビーズへの結合が含まれます。洗浄と加熱溶出の後、精製された複合体を回収し、急速冷凍して、下流解析のために保存します。 Dembowski, J. A., 他結合するウイルスおよび細胞タンパク質の同定のためのウイルスDNAの精製。 J. Vis. Exp.

ウイルスDNA-タンパク質複合体からのタンパク質の単離

私たちは、さらなる分析のために様々な成分を得るための全血の処理方法を概説します。私たちは、非臨床環境での全血サンプルの迅速でハイスループットな同時処理を可能にする合理化されたプロトコルを最適化しました。...

迅速な分別とコミュニティベースの設定から得られた試​​料中の全血液成分の単離

ここでは、ウイルス不活化全血から急速なウイルス核酸抽出のためのプロトコルを提案する.抽出は、採血管に直接行い機器や電気を必要としません。メソッドは実験施設に依存しないとすることができます (例えば、野戦病院で)...

迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

単核単離は、細胞膜の解離および洗剤ベースの透過性、最適化を必要とし、技術的なアーティファクトを導入する傾向があるステップに依存しています。我々は、単核RNA-seq(snRNA-Seq)またはATAC-seqに適した核を得て、組織全体から直接無傷核を迅速に単離するための洗浄剤および酵素フリープロトコルを実証する。...

洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

この研究では、下流の単一核RNAシーケンシングのために、凍結した哺乳類組織から高品質の核を単離するための、シンプルで迅速、かつ部分的に自動化されたプロトコルについて説明しています。...

単一核の配列のための凍結した哺乳類ティッシュからの単一核の隔離のための簡単で、速く、部分的に自動化されたプロトコル

このプロトコルは、プラスミドDNA抽出を加速するための費用対効果の高い方法を説明しています。標準的なスイングバケットプレートローターに対応したカスタム3Dプリントラックを使用することで、研究者は最大48本のキャップ付きスピンカラム、または最大116本のスピンカラムを同時に処理でき、手動のマイクロ遠心分離機法と比べて取り扱い時間を大幅に短縮できます。...

24ウェルラックを用いた中スループットカラムDNA抽出

従来の核酸の定量方法論への実践的かつ効率的な代替案として光度計微量システムの使用は、2つの微量核酸の定量プロトコルのデモンストレーションを通して説明されています。...

核酸の光度計微量定量

この通信は、dsDNAとタンパク質定量用BioSpec -ナノUV -...

マイクロボリュームバイオスペックナノ分光光度計を用いて核酸およびタンパク質の濃度測定

このビデオでは、ホルマリン固定パラフィン包埋材料からのDNA抽出のためのプロトコルを示しています。これは、組織切片をキシレンで脱パラフィンされている複数の日手続き、エタノールで再水和とその後の遺伝子特異的またはゲノムワイドな解析のためにDNAを精製し、分離するプロテイナーゼKで処理です。...

遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出

学ぶFINA法による核酸の濾過単離技術。全血からHIVプロウイルスDNAを2分以内に抽出し、リアルタイムPCR検出を可能にする簡易迅速な紙ベースDNA抽出法です。遠心機不要で現場診断に応用可能。

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

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