直接脳血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影

この直接血栓イメージング技術の全体的な目標は、金ナノ粒子、コンピューター断層撮影、および近赤外蛍光イメージングを使用して、蛍光標識された脳血栓塞栓をin vivoおよびex vivoで定量的に視覚化することです。この方法は、組織プラスミノーゲン活性化因子または調査中の新しい血栓溶解剤に対する脳血栓塞塞の時間または用量依存的および深刻な整形外科的反応など、止血および血栓症の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、金ナノ粒子の静脈内注射後、高解像度マイクロCTにより、脳血栓塞栓塞塞の位置と負荷をin vivoで定量的に視覚化し、近赤外蛍光血栓イメージングによってex vivoで裏付けることにより、脳血栓塞塞塞のダイナミックな進化を捉えることができることです。

手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクであるJeong-Yeon Kimが行います。心臓穿刺によって動脈血の300から1, 000マイクロリットルを集めた後、適切な活性化凝固因子、13媒介フィブリン架橋活動敏感な蛍光プローブの30マイクロリットルにサンプルの70マイクロリットルを追加し、得られた混合物で23ゲージの針を装備した3ミリリットルのシリンジをロードします。次に、標識した血液を長さ20センチメートルのポリエチレンチューブに注入し、室温で血液を凝固させます。

2時間後、チューブを摂氏4度に22時間移し、チューブを1.5cmにカットします。PBSを充填した3ミリリットルのシリンジを使用して、各チューブから血栓をPBSを含む6ウェルプレートの個々のウェルに排出します。血栓をPBSで3回洗浄し、30ゲージの針を装備した生理食塩水充填1ミリリットルの注射器を15センチメートルのPE10チューブの一端に挿入し、洗浄した単一の血栓をチューブの反対側の端に慎重に引き込みます。

次に、血栓を充填したPE10チューブを、直径200ミクロンのテーパーエンドを持つ長さ3cmのPE50チューブに接続します。つま先をつまんでも反応がないことで麻酔を確認した後、手術部位をベタジンと70%アルコールで消毒し、メスを使って左耳と目の間に1センチの縦切開を行います。レーザードップラー流量計の光ファイバーの遠位端を、ブレグマの左1mmと4mm下の露出した左側頭骨表面に接着し、ドップラーモニタリングを開始します。

次に、血管周囲軟部組織に3センチメートルの垂直正中線切開を行い、左頸動脈球領域を露出させます。滅菌済みの 6-0 ブラック シルク縫合糸を使用して、左近位総頸動脈を結紮し、続いて左内頸動脈と左翼口蓋動脈を滅菌済みの 7-0 ブラック シルク縫合糸で結紮します。単極性電気焼灼を使用して、左上甲状腺動脈を焼灼し、次に滅菌済みの7-0黒絹縫合糸を使用して、左近位外頸動脈を緩く結紮し、血管の遠位端をしっかりと結紮します。

マイクロハサミを使用して、外頸動脈の結紮部位間に0.2〜0.25ミクロンの穴を開け、近位の外部頸動脈結紮を緩めながら、カテーテルを含む血栓を穴に挿入します。カテーテルを総頸動脈に進めてカテーテルを所定の位置に締め付け、近位の外部頸動脈結紮を再び締めます。外頸動脈の遠位端を焼灼で切断し、外頸動脈の自由な近位端を時計回りに回転させて、カテーテルを抜いたときに血管を内頸動脈に合わせます。

次に、内頸動脈結紮糸を緩め、すぐにカテーテルを中大脳前大脳動脈分岐部に約9ミリメートル進めます。次に、カテーテルの周りの内頸動脈縫合糸を締め直し、シリンジを静かに押し下げて、血栓を分岐部に注入します。ドップラーでベースラインより30%以上の血流が観察された場合は、カテーテルを取り外し、すぐに外頸動脈の近位端を結紮します。.

適切な実験時点でマイクロコンピュータ断層撮影法により血栓を画像化するために、フィブリンを標的とする金ナノ粒子を10ミリグラム/ミリリットルの10ミリグラム/ミリリットルのPBS濃度に希釈し、血栓造影剤を30分間超音波処理してナノ粒子の均一な懸濁液を確保する。次に、実験動物の陰茎静脈に300マイクロリットルのフィブリン標的粒子を注入します。動物をマイクロCTイメージャーのベッドに移し、ピンに取り付けられたひもを使用して上部の前歯をそっと引っ張り、首をまっすぐにします。

金ナノ粒子が注入されてから5分後にイメージングが開始されます。ex vivo近赤外イメージングで血栓を可視化するには、切除した脳組織を基部を上に向けてイメージャーに配置します。ウィリスの円の動脈にある蛍光標識された血栓塞栓の画像を取得します。

次に、頂点を上に向けて組織を配置し、皮質血栓塞栓を画像化します。数滴の生理食塩水で組織を水和させ、製造元の指示に従ってブレインマトリックスデバイスを使用して、厚さ2ミリメートルの冠状脳スライスを6つすばやく取得します。スライスを生理食塩水で水和させたまま、切片の前面と背面の両方の近赤外線画像を追加で取得します。

マイクロCTイメージング後の血栓領域を定量化するには、画像シーケンスファイルを開き、画像、タイプ、8ビットの順に選択して、画像を8ビットグレースケールに変換します。CT 画像ファイルの 1 ピクセルが 0.053 ミリメートルに対応する場合は、[解析セット縮尺] を使用して 1 を入力し、[距離 (ピクセル単位)]、[既知の距離]、および [長さの単位] にそれぞれ 0.053 ミリメートルを入力します。次に、[編集] で [選択] を選択し、続いて [指定] を選択して、血栓または骨関連の高密度領域がない脳実質の領域に関心領域を配置します。

指定した対象領域はスタックのすべてのスライスに適用されるため、その領域がどのスライスの超高密度領域とも重なっていないことを確認します。次に、[プラグイン] で [関心領域] と [関心領域] から [背景減算] を選択し、平均からの標準偏差の数に 2 を入力します。血栓塞栓症に関連する高密度病変を見つけ、病変領域にズームインします。

次に、[画像]、[調整]、[しきい値]の順に選択し、[下限しきい値レベル]に「22」、[上限しきい値レベル]に「255」を入力します。「オーバー/アンダー」を選択すると、下限しきい値を下回るピクセルは青で、しきい値の上限を超えるピクセルは緑で表示されます。次に、フリーハンド選択ツールを使用して、骨領域のない血栓塞栓関連高密度病変の周囲の関心領域を描画します。

[解析] の [計測値の設定] を使用して、[面積]、[平均グレー値]、および [積分密度面積の時間平均] を選択します。[Limit to threshold] と [Display label] のチェックボックスをオンにします。Analyze Measure を使用して定量化されたデータを取得し、結果を保存します。

これらのベースラインマイクロCT画像は、マウスの塞栓性脳卒中から1時間後にフィブリン標的金ナノ粒子を注入してから5分後にin vivoで取得されました。大脳血栓は、遠位内頸動脈の中大脳前大脳動脈分岐部領域ではっきりと視覚化できます。フォローアップのマイクロCT画像は、生理食塩水処理動物のウィリス血栓の輪に変化がないことを示していますが、組織プラスミノーゲン活性化剤で処理された動物は、青い矢印で示されているように、時間の経過とともにウィリス血栓の輪が徐々に溶解します。

in vivo CT 密度と 24 時間後の残存血栓塞栓症の ex vivo 近赤外イメージングとの間には強い相関関係があります。例えば、これらの画像では、金粒子を標的とするフィブリンによって可視化された超高密度マイクロCT領域は、凝固因子13Aを介した、予め形成された血栓成熟プロセス中に血栓に結合するフィブリン架橋活性感受性蛍光プローブによって同定された近赤外シグナル領域に直接対応しています。さらに、これらの画像で視覚化されているように、TTC染色は、組織プラスミノーゲン活性化因子で処理された動物と比較して、対照生理食塩水における虚血性脳損傷における血栓溶解の影響を評価するために使用できます。

この技術を習得すると、in vivoマイクロCTイメージングとex vivo近赤外蛍光血栓イメージングは、適切に実施され、イメージングプローブが利用可能な場合に約1時間で行うことができます。この手順を試みる際には、マイクロCTベースの直接脳血栓イメージングに非凝集およびフィブリン標的金ナノ粒子を使用することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、電子顕微鏡法や誘導結合プラズマ質量分析法であるICPMSなどの他の方法を実行して、金ナノ粒子の組織分布や血中動態などの追加の質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、脳卒中または心臓血管研究の分野の研究者が、冠状動脈血栓症または塞栓性脳梗塞の内部にある動物モデルで血栓塞栓症を調査する道を開きました。このビデオを見た後、マウスで血栓塞栓性脳卒中の蛍光標識血栓を作成する方法、および脳血栓塞栓の連続イメージングと定量化をin vivoで実行し、その後ex vivoで行い、それによって血栓の進化を監視する方法について十分に理解できるはずです。