ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム
2016年9月27日
ハイスループット、自動化され、タバコプロトプラストの生産と変換方法について説明します。ロボットシステムは、非モデル作物に翻訳可能であるべきであるBY-2システムモデルにおける大規模並列遺伝子発現と発見を可能にします。
このプロトコルの全体的な目標は、植物のプロトプラストの迅速で自動化されたハイスループットスクリーニングの方法を開発することであり、特に、多数のゲノム編集および遺伝子サイレンシングターゲットの早期スクリーニングにおける現在のボトルネックに対処することです。この方法は、植物バイオテクノロジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子発現におけるプロモーター機能の迅速な並列スクリーニングのためのハイスループットな自動プロトプラスト産生および形質転換を可能にすることです。
この手順は、広く使用されているタバコの明るい黄色の2つ、またはBY-2懸濁液培養を使用して示されます。まず、プロトコールのテキストに記載されているように、三角フラスコでBY-2培養物を培養します。プロトプラスト単離の日には、細胞が急速に沈静するように培養物を完全に混合し、培養物の6ミリリットルを15ミリリットルの円錐底遠心チューブに移します。
細胞を少なくとも10分間落ち着かせます。適切な量の上清を除去して、パックされたセル容量を総容量の50%に調整します。チューブを反転させて振とうし、ワイドボアピペットを使用して、消化のために500マイクロリットルの細胞懸濁液を6ウェルプレートの各ウェルにピペットで移します。
この手順の最初のステップは、マイクロプレートムーバー、リキッドハンドラー、マルチモードプレートリーダー、マルチモードディスペンサー、プレートヒーターまたはチラー、およびコンピューターであるロボットシステムのすべてのコンポーネントの電源を入れることです。次に、マイクロプレートムーバーを他の機器と統合して、各機器間でプレートを移動できるようにするプレートムーバータスクスケジューリングソフトウェアを開きます。プレートムーバーソフトウェアで、プロトコールで使用するラボウェアの技術仕様を定義します。
メインツールバーの「設定」をクリックし、「コンテナタイプの管理」コマンドを選択します。既存のコンテナタイプのリストから適切なコンテナタイプを選択します。プレートムーバーが遭遇するすべての実験器具の技術仕様を定義します。
次の手順では、各コンテナの開始位置と終了位置を定義します。特定のプロトコルの [Start/End] タブをクリックします。各コンテナの 開始位置 を選択し、開始位置と終了位置の両方で Lidded、Unlidded のチェックボックスをオンにします。
各ラボウェアの開始位置と終了位置を定義したら、ワークフロー全体の開始位置にすべてのプレートを手動でロードします。96ウェル蛍光スクリーニングプレートをホテル2に、BY-2細胞を含む6ウェルプレートをホテル3に、プレートヒーターまたはチラーのネスト2への形質転換に使用される96ディープウェルプレート、および酵素溶液を含む50ミリリットルのコニカルチューブをマルチモードディスペンサーにロードします。プロトコールで形質転換を行うには、96ディープウェルプレートの各ウェルに、オレンジ色の蛍光タンパク質レポーターコンストラクトを含む10マイクロリットルの血漿DNAをプリロードし、プレートヒーターまたはチラーで摂氏4度でインキュベー
トします。指定された場所にある自動リキッドハンドリングプラットフォームにすべての消耗品とプレートをロードします。1列目のウェルあたり200マイクロリットルの40%ポリエチレングリコール溶液をプリロードした96ウェルプレートをロードします。ピペットチップの箱をネスト8にロードします。
自動リキッドハンドリングプラットフォームソフトウェアで各アイテムの位置を定義するには、メニューから「ツール」を選択し、「Labware Editor」をクリックします。プルダウンメニューから実験器具の種類を選択します。「Main Protocol」タブを選択し、「Configure Labware」をクリックして、各ラボウェアの位置を定義します。
[実行] をクリックして、プロトコルで使用されるすべてのデバイスを初期化します。最後に、「Work Explorer」ウィンドウで「Add Work Unit」をクリックし、システム内のすべてのラボウェアを確認し、自動プロトコルを開始します。この手順の最も敏感な部分は、プロトプラスト形質転換です。
変換はロボットシステムによって実行されるため、自動化されたプロトコルが正しく設定されていることが重要です。このビデオでは、自動プロトコルの選択されたステップのみが表示されます。形質転換プロトコルでは、自動リキッドハンドリングプラットフォームが6ウェルプレートから70マイクロリットルのプロトプラスト溶液を吸引し、ネスト6の96ディープウェルプレートに分注します。
次に、新しいピペットチップを使用して、プリロードされたディープウェルプレートから70マイクロリットルの高粘度ポリエチレングリコール溶液をゆっくりと吸引し、溶液をディープウェルプレートの該当するウェルに完全に分注します。次に、自動化されたリキッドハンドリングプラットフォームがディープウェルプレートを次の6つからネスト9に移動し、プレートムーバーがプレートをピックアップしてプレートシェーカーステーションに移動し、1500RPMで30秒間振とうします。プロトプラストの平衡化を可能にするために振とうせずに20分間インキュベートした後、プレートムーバーは96ディープウェルプレートをマルチモードディスペンサーに移動し、洗浄プロトコルをトリガーします。
自動化されたプロトプラストの単離および形質転換プロトコルが完了したら、形質転換されたプロトプラストの入ったプレートをロボティクスシステムのホテル1から取り外します。倒立顕微鏡、カメラ、蛍光灯をオンにします。10X対物レンズを選択して、プロトプラストに最初に焦点を合わせます。
ハロゲンランプを点灯し、蛍光灯のシャッターを閉めます。プレートを顕微鏡システムにロードし、明視野を使用してプロトプラストに焦点を合わせます。次に、ハロゲン電球を消し、蛍光灯のシャッターを開けます。
トランスジェニックプロトプラストによって発現されるオレンジ色の蛍光タンパク質を可視化するためのCy3/TRITCフィルターセットを選択します。各ウェルをスキャンして、蛍光マーカーを発現するプロトプラストの数を決定します。このプロトコルで指定された条件でのプロトプラストの酵素消化により、6ウェルプレートあたり2,820,000個のプロトプラストが得られました。
プロトコールの各移管ステップ後のプロトプラスト濃度の損失を評価しました。消化プロトコルの後、11, 500個のプロトプラストを96ディープウェルプレートの各ウェルに移しました。形質転換プロトコルが完了すると、1, 230個のプロトプラストを96ウェル蛍光スクリーニングプレートに移しました。
複数のピペッティングステージがプロトプラストに損傷を与えないように、ヨウ化プロピジウム染色によりプロトプラストの生存率をアッセイしました。その結果、消化後、96ウェル蛍光スクリーニングプレートに移した後、および形質転換プロトコル後の生存率に有意差は示されませんでした。形質転換プロトコルは、オレンジ色の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック細胞を作製することに成功しましたが、形質転換効率はわずか約2%でしたこれは、大きなバイナリープラスムが使用され、プロトコルがBY-2プロトプラストに特異的に最適化されていなかったためです。
プロトコルの時間経過について得られた指標は、消化段階で大きな時間の投資が費やされることを示しました。プロトプラストの単離と形質転換の全時間は3時間50分53秒で、オペレーターからの外部入力は必要ありませんでした。適切に設定すれば、この手法はロボットで4時間以内に実行できます。
この技術は、その開発後、植物バイオテクノロジーの分野の研究者がゲノム編集やプロモータースクリーニングなどのハイスループットな作物ゲノム手順を実行するための道を開きつつあります。
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概要
この記事では、タバコのプロトプラスト製造と形質転換のための高スループット自動化された方法論について説明します。このロボットシステムは、BY-2モデルシステムにおいて、大規模並列遺伝子発現と発見を可能にし、非モデル作物への応用可能性を示しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 植物バイオテクノロジー
- ゲノミクス
- 遺伝子発現
背景
- ゲノム編集と遺伝子サイレンシングの標的スクリーニングにおける現在のボトルネック。
- 植物研究におけるプロトプラストの重要性。
- バイオテクノロジーにおける迅速なスクリーニング方法の必要性。
- 広く使用されているモデルシステムとしてのBY-2懸濁培養。
研究の目的
- 植物プロトプラストの高スループットスクリーニングのための迅速な自動化された方法を開発すること。
- 遺伝子発現研究の効率を向上させること。
- 遺伝子標的の初期スクリーニングにおける課題に対処すること。
使用された方法
- エルレンマイヤーフラスコでのBY-2培養の成長。
- プロトプラスト分離前の培養の完全な混合。
- プロトプラスト分離のための遠心分離管への培養の移送。
- 高スループット分析のための自動化された形質転換プロセス。
主要な結果
- 高スループットプロトプラスト生産方法の成功的な開発。
- 迅速な並列スクリーニング能力のデモンストレーション。
- 非モデル作物への応用の可能性。
- 遺伝子発現におけるプロモーター機能の理解の進展。
結論
- この自動化された方法論は、プロトプラスト生産効率を大幅に向上させます。
- このアプローチは、大規模な遺伝子発現研究を促進できます。
- 植物バイオテクノロジーへの幅広い応用に期待が持てます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput protoplast isolation and transformation addresses a critical bottleneck in early-stage plant biotechnology screening, enabling rapid parallel evaluation of genome editing and gene silencing targets. The robotic platform reduces operator dependence and accelerates discovery timelines for promoter function analysis and trait validation. This capability supports predictive confidence in target selection and portfolio prioritization for crop improvement programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulatory networks and promoter function in a high-throughput format.
- Operational Value: Automates protoplast isolation and transformation, reducing manual variability and increasing reproducibility.
- Predictive Value: Supports rapid screening of genetic constructs to de-risk target hypotheses before downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts via OFP reporter expression for promoter activity assessment.
- Operational Value: Standardizes protoplast production and transformation across 96-well formats for scalable screening.
- Assay Readiness: Enables preparation of validated protoplast systems for compound or genetic library evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase promoter screening with preclinical trait validation in crop systems.
- Disease-Relevant System: Applicable to any plant suspension culture, supporting broad crop genomics relevance.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions based on reproducible transformation efficiency and reporter expression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from target hypothesis testing through lead identification, enabling rapid protoplast-based screening prior to stable line generation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of promoter function and gene expression dynamics in a controlled, high-throughput system.
- Screening: Delivers assay-ready protoplasts with standardized isolation and transformation for library-scale evaluation.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence measurements and viability metrics via propidium iodide staining for data-driven comparisons.
- Translational Research: Enables continuity from BY-2 model screening to non-model crop applications through translatable protocols.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable robotic platform for repeated protoplast-based assays across projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through reproducible, high-resolution promoter activity readouts.
- Operational Value: Achieves full automation from isolation to transformation in under 4 hours, minimizing hands-on time and batch effects.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of numerous targets with minimal reagent waste via low-cost food-grade enzymes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets based on scalable, quantitative expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in robotic platform programming, liquid handling, and fluorescence microscopy.
- Dependent on integrated instrumentation including microplate movers, dispensers, plate readers, and environmental controllers.
- Necessitates cross-team standardization of labware definitions, start/end positions, and protocol scheduling.
- Adaptation across model systems may require optimization of enzyme concentrations and transformation conditions.
- Transformation efficiency is influenced by plasmid size and protoplast susceptibility, necessitating empirical tuning for new systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Establishment of Suspension Cell Cultures
1:40
Set up of Automated Protocols for Protoplast Isolation and Transformation
5:16
Automated Protocols
6:37
Microscopic Analysis of Transformation
7:42
Results: Rapid, Automated, High-throughput Screening of Plant Protoplasts
9:40
Conclusion
