ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

本プロトコルの目的は、植物プロトプラストの迅速かつ自動化されたハイスループットスクリーニング手法を開発することであり、特に、多数のゲノム編集および遺伝子サイレンシング標的の初期スクリーニングにおける現在のボトルネックを解消することにあります。この手法は、植物バイオテクノロジー分野における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、プロトプラストの調製と導入を自動化し、ハイスループットに実施できるため、遺伝子発現におけるプロモーター機能の迅速な並行スクリーニングが可能になることです。

この手順では、広く利用されているタバコBY-2（bright yellow two）懸濁培養細胞を用いて実演します。まず、プロトコルの本文に記載されている通り、エルレンマイヤーフラスコでBY-2培養細胞を育成させます。プロトプラスト分離を行う日に、細胞が急速に沈降するため培養液を十分に混ぜ合わせ、その培養液6 mLを15 mLのコニカルチューブに移します。

細胞を少なくとも10分間静置させます。適切な量の上清を除去し、細胞充填体積を全容量の50%に調整します。チューブを反転させて振盪した後、ワイドボアピペットを使用して、消化用に細胞懸濁液500 µLを6ウェルプレートの各ウェルに分注します。

この手順の最初のステップは、マイクロプレートムーバー、液体ハンドラー、マルチモードプレートリーダー、マルチモードディスペンサー、プレートヒーターまたはチラー、およびコンピューターなどのロボティクスシステムのすべてのコンポーネントの電源を入れることです。次に、マイクロプレートムーバーと他の装置を統合し、各装置間でのプレート移送を可能にするプレートムーバータスクスケジューリングソフトウェアを開きます。プレートムーバーソフトウェアにおいて、プロトコルで使用するラボウェアの技術仕様を定義します。

メインツールバーから「Setup」をクリックし、「Manage Container Types」コマンドを選択します。既存のコンテナタイプのリストから、適切なコンテナタイプを選択してください。プレートムーバーが使用するすべてのラボウェアの技術仕様を定義します。

次のステップは、各コンテナの開始位置と終了位置を定義することです。特定のプロトコルの「Start/End」タブをクリックします。各コンテナの開始位置を選択し、開始位置と終了位置の両方で「Lidded（蓋あり）」または「Unlidded（蓋なし）」のチェックボックスを選択してください。

各ラボウェアの開始位置と終了位置を定義した後、ワークフロー全体で使用するすべてのプレートを手動で開始位置にロードします。96ウェル蛍光スクリーニングプレートをホテル2に、BY-2細胞を含む6ウェルプレートをホテル3に、形質転換に使用する96深ウェルプレートをプレートヒーターまたはチラーのネスト2に、そして酵素溶液を含む50 milliliter コニカルチューブをマルチモードディスペンサーにロードします。プロトコルに従って形質転換を行うには、96深ウェルプレートの各ウェルに、オレンジ蛍光タンパク質レポーター構築物を含むplasma DNAを10 microlitersずつ予め分注し、プレートヒーターまたはチラーを用いて4 °Cでインキュベートします。

すべての備品とプレートを指定の場所に自動液体ハンドリングプラットフォームにセットします。1列目の各ウェルに40%ポリエチレングリコール溶液を200 µLずつあらかじめ分注した96ウェルプレートをセットします。ネスト8にピペットチップのボックスをセットします。

自動液体分注プラットフォームのソフトウェアで各アイテムの位置を定義するには、メニューから「Tools」を選択し、「Labware Editor」をクリックします。プルダウンメニューからラボウェアの種類を選択します。「Main Protocol」タブを選択し、「Configure Labware」をクリックして、各ラボウェアの位置を定義します。

「Run」をクリックして、プロトコルで使用するすべてのデバイスを初期化します。最後に、「Work Explorer」ウィンドウで「Add Work Unit」をクリックし、システム内のすべてのラボウェアを確認して、自動プロトコルを開始します。この手順で最も慎重な操作を要するのは、プロトプラスト形質転換です。

形質転換はロボティクスシステムによって行われるため、自動プロトコルを正確に設定することが極めて重要です。このビデオでは、自動プロトコルの中の選択されたステップのみを示します。形質転換プロトコルにおいて、自動液体分注プラットフォームは、6ウェルプレートから70 µLのプロトプラスト溶液を吸引し、それをネスト6にある96深井プレートに分注します。

次に、新しいピペットチップを使用して、プリロードされたディープウェルプレートから高粘度のポリエチレングリコール溶液を70 µLゆっくりと吸引し、ディープウェルプレートの該当するウェルに完全に分注します。続いて、自動液体ハンドリングプラットフォームがディープウェルプレートをネスト6からネスト9へ移動させ、プレートムーバーがプレートをピックアップしてプレートシェーカーステーションへ移動し、1500 RPMで30秒間振盪します。プロトプラストを平衡化させるため、振盪せずに20分間インキュベートした後、プレートムーバーが96ウェルディープウェルプレートをマルチモードディスペンサーに移動させ、洗浄プロトコルを開始します。

自動プロトプラスト分離および形質転換プロトコルが完了したら、ロボティクスシステムのホテル1から形質転換プロトプラストが入ったプレートを取り出します。倒立顕微鏡、カメラ、および蛍光灯の電源を入れます。プロトプラストの初期フォーカス合わせのために、10倍対物レンズを選択してください。

ハロゲンランプを点灯し、蛍光ランプのシャッターを閉じます。プレートを顕微鏡システムにセットし、明視野でプロトプラストに焦点を合わせます。次に、ハロゲン電球を消灯し、蛍光ランプのシャッターを開きます。

形質転換プロトプラストに発現したオレンジ色蛍光タンパク質を可視化するため、Cy3/TRITCフィルターセットを選択します。各ウェルをスキャンし、蛍光マーカーを発現しているプロトプラストの数を決定します。本プロトコルで指定した条件下でプロトプラストの酵素消化を行った結果、6ウェルプレートあたり2,820,000個のプロトプラストが得られました。

プロトコルの各移送ステップ後におけるプロトプラスト濃度の減少を評価した。消化プロトコルの後、96深孔プレートの各ウェルに11,500個のプロトプラストを移送した。形質転換プロトコルの完了後、96ウェル蛍光スクリーニングプレートに1,230個のプロトプラストを移送した。

複数回のピペッティング操作によってプロトプラストが損傷していないかを確認するため、プロピジウムヨード染色により生存率を測定しました。その結果、消化後、96ウェル蛍光スクリーニングプレートへの移送後、および形質転換プロトコルの実施後において、生存率に有意な差は見られませんでした。形質転換効率は約2%と低かったものの、本形質転換プロトコルにより、オレンジ蛍光タンパク質を発現する形質転換細胞の作製に成功しました。これは、使用したバイナリーベクターのサイズが大きいこと、および本プロトコルがBY-2プロトプラストに特化して最適化されていなかったことによるものです。

プロトコルのタイムコースから得られた指標により、時間の大部分が消化段階に費やされていることが示されました。プロトプラストの単離および形質転換の全所要時間は3時間50分53秒であり、オペレーターによる外部入力は不要でした。適切にセットアップされれば、この手法はロボットによって4時間未満で実行可能です。

本技術の開発により、植物バイオテクノロジー分野の研究者が、ゲノム編集やプロモータースクリーニングなどの高スループットな作物ゲノム解析を実施するための道が開かれています。