Name: マウスの中大脳動脈閉塞再灌流誘発性の脳卒中のための外科的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶマウスの中大脳動脈閉塞再灌流法による脳卒中モデル構築。Longa法を用いて虚血を再現し、高い生存率と再現性を確保しながら、治療標的の探索や神経機能評価を行う手法を解説します。

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この作業は、国立衛生研究所、国立心肺血液研究所（NIHおよびNHLBI;HL125572-01A1)とLSUHSC-SはFNEギャビンズに資金を提供します。

このプロトコルとビデオで報告した実験はLSUHSC-S施設内動物管理使用委員会によって承認され、NIHのガイドラインに準拠しているました。 注：25体重の雄C57BL / 6マウス - 47 gをこの研究で使用しました。マウスは個別換気ケージで12時間の明/暗サイクルの下で、水に自由にアクセスさせて、標準的な固形飼料ペレット食で維持しました。手順は、滅菌技術（ 例えば 、滅菌手袋、滅菌器具）を用いて無菌条件下で行われます。 1.手術前の準備<ol><li>ケタミン（150ミリグラム/ kg）およびキシラジン（10mg / kg）の組み合わせを使用して麻酔を誘導腹腔内（IP）を注射しました。麻酔が達成された後、5分及び10分ごとに - 最初は足のピンチごとに3によって麻酔深度を監視します。動物が麻酔下にある間、乾燥を防ぐために無菌眼軟膏を管理します。ケタミン/キシラジンの初期投与量は、通常、AB持続します30-40分アウト。足のピンチに対する動物の応答により検証され、必要に応じて追加の用量を投与することができます。 </li><li>温度調節熱マットの上に仰臥位でマウスを置き、直腸プローブを使用して検証されて36.5±0.1℃、で体温を維持。 </li><li>首を剃ると、70％のエチルアルコールで皮膚を消毒します。 </li></ol> MCAの2閉塞（図1） <ol><li>アイリスストレートはさみを使用して、正中頸部切開を行い、血管を露出させるために軟組織を（リトラクターを使って）後退させます。 </li><li>迷走神経を損傷することなくデュモンの鉗子を使用して周囲の組織からCCAとECAを解剖。 </li><li> 6-0シルクを使用して、CCAの周りの緩い結び目を結ぶことにより、一時的な縫合糸を作ります。 </li><li> ECAの周りに永久縫合糸、しっかりと（CCAの分岐に対して遠位）血管を結紮することによって、それから延びる小型船を作ります。 </li><li>縫合糸AROを作りますCCAの分岐にECAの近位をUND。 </li><li>内頸動脈（ICA）と翼口蓋動脈（PPA）の周りの微小血管クリップを配置します。 </li><li>春のはさみを解剖マイクロを使用して、ECAの小さな切開を行い、180μmのシリコンチップ付きモノフィラメントを挿入します。フィラメントのより容易な操作のために可能な限り永久縫合糸へのカットはの近くにしてください。 </li><li>挿入されたフィラメントとECAの周りに一時的な縫合糸を締めて、微小血管クリップを削除します。 </li><li>永久、遠位縫合糸と春のはさみを解剖マイクロを使用して、フィラメントのエントリポイント間のECAをカットします。 </li><li> MCAに - （CCAの分岐を超えて10μmの約9）抵抗が感じられるまでICAを通してフィラメントを案内します。 注：フィラメントの大部分はまだ表示されている間あまり抵抗が感じられる場合には、フィラメントは、PPAを入力した可能性があります。この問題が発生した場合は、ゆっくり膿、分岐点に戻って、フィラメントを引っ張りますICAへの前進時間デュモンの鉗子を使用して、それがICAで可視化することができるまで、フィラメントを進めます。 </li></ol> 3.再灌流<ol><li> 30分の閉塞期間の後、静かにデュモンの鉗子を使用して、それを引き戻すことにより、フィラメントを除去し、ECAの開放端の周りに縫合糸を固定します。 </li><li>慎重デュモンの鉗子を使用して、合字を緩めて血流がCCAを通して再開されることにより、CCAの周りに一時的な縫合糸を取り外します。 </li><li>連続外科手術用縫合糸で切開を閉じます。皮膚の閉鎖は、連続又は中断どちら縫合することによって達成することができます。スキンステープルも許容方法です。 </li><li>ボリューム補充などの鎮痛カルプロフェンと生理食塩水を皮下の1ミリリットルをマウスに注入する（5ミリグラム/キログラム、SC）の外科的処置、追加の疼痛緩和がバック猫背含ま必要であることを示す兆候、ungroomedコートからの痛みや不快感の軽減のため、異常な、活性の低下姿勢、そして食欲を減少させました。 </li><li>温度コントローラーを使用して、規制ヒートランプを使用して加熱された30℃のケージ内の麻酔からの回復を通じてマウスを観察し、食べることを奨励するために、ケージの床にペトリ皿にマッシュ飼料を配置します。マウスは、再灌流期間中のケージ当たり1匹収容されます。 </li></ol> 4.シャム手術<ol><li>モノフィラメント挿入せずに、同じ手順に従うことをマウス。 </li></ol> 5.術後の神経学的スコア（表1;図2） <ol><li>神経学的全般を評価する18ポイントスコアリングシステムを用いて適切な再灌流期間の後、マウスを評価します。モーター;感覚;固有感覚。高い神経学的スコアは、神経学的機能の低下に相当します。 注：応答しないと歩くことができないと判断されたマウスは安楽死させます。人道的な安楽死のための他の基準は20％以上の体重減少を含む、呼吸ジ手術領域の周りのストレス、および感染症。 CO 2チャンバーは、安楽死のために使用され、死を確認するための物理的方法は、頸椎脱臼または開胸になります。 </li></ol>測定脳梗塞体積の6（図3） <ol><li>麻酔が達成された後5分および10分毎 - ケタミン（150ミリグラム/ kg）およびキシラジン（10mg / kg）を最初に足ピンチ毎に3によって麻酔のIP監視深注入の組み合わせを使用して麻酔を誘導します。 </li><li>仰臥位でマウスを置き、アイリスをまっすぐはさみを使用して腹膜に続く首に腹部から皮膚をカット。 </li><li>デュモンの鉗子を使用して胸骨を持ち上げ、心臓を露出するリブをカット。 </li><li>心臓を露出させ、止血の2ペアを使用して左と右胸を開きます。 </li><li>左心室に5ミリリットルの注射器に取り付けた26 G針を挿入し、右心房を切りました。室温通常の生理食塩水またはホスファで潅流TE緩衝食塩水（PBS）液が透明になるまで（通常3 - 5分）。 </li><li>アイリスストレートはさみとデュモンの鉗子を使用して慎重に離れて脳から頭蓋骨を削除します。 </li><li>嗅球と脳がマトリクス状に収まるようにカミソリの刃を使用して、小脳をカット。でもセグメントに脳をスライスし、この行列を使用します。クールな組織を維持するために、使用前に行列を冷やします。マトリックスに脳を置き、氷の上に置きます。 </li><li> 2かみそりの刃を使用して、2ミリメートルの冠状セグメントに脳をスライス。上から2ミリメートルを開始するカミソリの刃を使用して最初のカットを作成し、代わりにこのかみそりの刃を残します。最初の後ろにカットし、別の2ミリメートルを行います。付着した組織との最初のカミソリの刃を取り外します。すべての組織がスライスされるまで、このプロセスを繰り返します。 注：4があるはずです - 終了時に5つのセグメント。 </li><li>その後、浅い水浴aで配置され、2％2,3,5- triphenyltetrazaliumクロリド（TTC）を含む24ウェルプレートにセグメントを配置します20分間T 37℃です。個々のウェルに各セグメントを配置すると、それらがカットされた順序でそれらを維持するのに役立ちます。 TTC溶液が完全に組織セグメントをカバーしていることを確認してください。 10分には、すべてのスライスを裏返した後。 </li><li>新しい24ウェルプレートのウェルに10％ホルマリンの少量を置き、それが切断されたために、このプレートにセグメントを転送します。 </li><li>コンピュータにセグメントをスキャンし、ImageJの解析ソフト（NIH 1.57 Imageソフトウェア）6を用いて全脳切片6の割合として梗塞サイズを分析します。 <ol><li>面積測定を生成するために、梗塞領域の輪郭を描きます。次の領域を決定するために、全体の半球を測定します。対側半球の面積によって梗塞領域を分割し、梗塞体積を決定するために100を掛け。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

20年前の概念ので、フィラメントの挿入を含むヒトの脳卒中のMCAOモデルは、研究の膨大な数に使用されています。これは、それが脳卒中（ すなわち、虚血性脳卒中）の最も一般的な形で臨床的に何が起こるかを模倣したという事実のために主です。線条体は大脳皮質よりも虚血に対してより敏感であり、そのようなものとして、虚血時間の長さは、線条体と背皮質の両方が影響を受け、または単に線条されるかどうかに翻訳されます。両方梗塞および再灌流時間はそれに応じて変化させることができ、これは研究者にはるかに大きな梗塞に一過性脳虚血発作（TIA）に関連する病理学的効果を研究することができるようにする能力を提供しています。 長年にわたって修正およびにMCAoのフィラメント方法のトラブルシューティングは、感染9の危険性を避けるために無菌状態で実行される手順の重要性を示しています。結果が異なる場合がありますげっ歯動物種間で、歪み10,11、体重、および麻酔薬を使用（解剖学的バリエーションが示されている）が、ここで提示された結果の傾向はにMCAoが行われてい...

脳卒中は、病気から4分ごとに死んで一人で、世界的な死因の第5位です。 80万人のアメリカ人は、患者のためだけでなく、その家族のためだけでなく、壊滅的であるストローク毎年、苦しみます。脳卒中は成人の身体障害の主な原因であり、歳出は非常にいくつかの治療オプションが利用可能であるにもかかわらず$ 36.5 10億のオーダーであると推定されます。 組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）は唯一の食品医薬品局（FDA）は、虚血性脳卒中のための薬のライセンスを取得しています。脳卒中の発症から3~6時間以内に患者に投与し、そしてこれらのケースでは、患者2のわずか4％に利益をもたらす場合は、それだけに有効です。したがって、脳卒中の再現可能な、臨床的に関連する動物モデルは、この疾患の潜在的な治療戦略および治療法の開発を助けるために使用されることが必須です。 in vitroでのことに注意することが重要です</em&gt;のモデルは、脳機能障害の特定の側面をモデル化するのに有用な一方で、脳卒中後の脳と周辺で発生する複雑な生理学的相互作用を反復することができません。その結果、in vivoでのモデルが不可欠です。 脳卒中の最も一般的なタイプは、全ストロークの87％を占め、原点における虚血性です。他のストロークは脳内出血（9％）とくも膜下出血（4％）であり、中大脳動脈（MCA）の塞栓によって最も頻繁に引き起こされます。これは、破砕になるために脳に入る層の血流を引き起こすMCAのルートにある著名な曲線、に起因するものです。 MCAは、内頸動脈（ICA）から生じ、大脳基底核と一次運動や感覚皮質を含む前頭葉、頭頂と側頭葉の側面、に分岐し、プロジェクトの横方向溝に沿ってルート。ウィリス動脈輪はある大脳動脈によって作成されます脳動脈と後部の通信動脈に接続されています。 MCAoの腔内フィラメントまたは縫合糸モデルは、最も広く脳卒中の研究で使用されるの一つです。しかし、このモデルの異なるバリエーションがいくつかあり、これらはマイクロフィラメントが外頸動脈に挿入されているかどうかに基づいている（ECA、ロンガ法と呼ばれる）3、またはそれはICAに挿入されたかどうか（小泉と称される方法）4。ロンガの方法で、それが永久に5を接続する必要があり、そのECAありながらフィラメントは、CCAの切開部からの出血を防ぐために削除された場合は小泉の方法では、手術の側の総頸動脈（CCA）は、恒久的に接続する必要があります。私たちは、これははるかに優れおよび虚血性脳卒中のより臨床的に関連する外科的なモデルであると感じるようにここでロンガの方法が使用されます。また、特にロンガ法によるシリコン先端モノフィラメントの使用は、非常に生産します多くの場合、不完全閉塞および/またはくも膜下出血6を生成難鈍化しモノフィラメントとは対照的に、再現可能にMCAo。 腔内フィラメント法は、永久的または一時的閉塞4,6のモデルとして使用することができます。過渡モデルを実行するために、フィラメントは、虚血の期間（ 例えば、30分、60分、または2時間）後に除去され、そして再灌流が起こることが許されます。このモデルは、ある程度、ヒトにおける血栓塞栓性血餅を溶解するために、自発的または治療的介入（ 例えば 、tPAの投与）後の血流の回復をシミュレートします。永久的なモデルでは、フィラメントは、単に時間の期間（ 例えば 、24時間）のための場所に放置されているので、何の再灌流は発生しません。腔内フィラメント法の別の利点は、開頭術が頭蓋骨をそのまま残すことを可能にすると、頭蓋内圧や温度の変化を回避し、実行する必要がないという事実です。

<table><tbody><tr><td>オス C57BL/6 マウス</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine Hydrochloride</td><td>Morris &ディクソン、シュリーブポート、ルイジアナ</td><td>州67457-108-10</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn、Inc、レイクフォレスト、イリノイ州</td><td>NADA#139-236</td><td></td></tr><tr><td>DC温度制御システム</td><td>FHC、Bowdoin、ME</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>ミニ直腸サーミスタプローブ</td><td>FHC、Bowdoin、ME</td><td>40-80-5D-02</td><td></td></tr>加熱<tr><td>パッド</td><td>FHC、Bowdoin、ME</td><td>40-90-2-06</td><td></td></tr><tr><td>クリッパーズ</td><td>アマゾン、Bellevue, WA</td><td>#64800</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Worldwide Medical Products, Bristol, PA</td><td>#51011023</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Olympus, Center Valley, PA</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>Iris はさみ (ストレート)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 鉗子 (45°; 曲がった先端)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>マイクロベッセルクリップ</td><td>ファインサイエンスツール、フォスターシティ、CA</td><td>18055-05</td><td></td></tr>マイクロ<tr><td>解剖スプリングはさみ(ストレート)</td><td>ファインサイエンスツール、フォスターシティ、CA</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>リトラクター(鈍器)</td><td>ファインサイエンスツール、フォスターシティ、CA</td><td>18200-11(ヘレンは17022-13を使用)</td><td></td></tr><tr><td>綿チップアプリケーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ</td>州<td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼスポンジ</td><td>Covidien、マンスフィールド、MA#</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>7-0シルク編組外科縫合</td>糸<td>Braintreeサイエンティフィック、ブレインツリー、MA</td><td>SUT-S103</td><td></td></tr><tr><td>0.9%塩化ナトリウム</td><td>Morris &Dickson, Lake Forest, IL</td><td>0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament)</td><td>Doccol Corporation, Sharon, MA</td><td>6023PKRe</td><td></td></tr><tr><td>Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk</td><td>Covidien, Mansfield, MA</td><td>SUT-14-1</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer, New York, NY</td><td>NADA# 141-199</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Dechra, Norwich, UK</td><td>NDC17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Physitemp 温度コントローラー</td><td>ハーバード装置、マサチューセッツ州ホリストン</td><td>TCAT-2AC</td><td></td></tr><tr><td>ヒートランプ</td><td>ハーバード装置、マサチューセッツ州ホリストン</td><td>HL-1</td><td></td></tr><tr><td>レーザードップラープローブ</td><td>AD インスツルメンツ、コロラドスプリングス、コロラド州</td><td>MSP100XP</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州</td><td>#353226</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)</td><td>Life Technologies、カールスバッド、CA</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>シングルエッジカミソリの刃フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ</td>州<td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-トリフェニルテトラザリウムクロリド(TTC)</td><td>シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ</td><td>州T8877-50G</td><td></td></tr><tr><td>マウス脳マトリックススライサー</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック、ブレインツリー、マサチューセッツ</td><td>州BS-A 5000C</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>VWR、ラドナー、ペンシルバニア州</td><td>#182</td><td></td></tr><tr><td>10%ホルマリン</td>シ<td>グマAldrich、セントルイス、ミズーリ</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ分析ソフトウェア</td><td>NIH、ベセスダ、メリーランド州</td><td>無料ダウンロード</td><td></td></tr><tr><td>Retractor</td>医療機器<td>購入、ニューカッスル、カリフォルニア州</td><td>MP-740</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの中大脳動脈閉塞再灌流誘発性の脳卒中のための外科的アプローチ

Surgical Approach for Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion Induced Stroke in Mice

脳卒中は、世界中の主要な死亡原因であり、長期的な成人の障害の主要な原因の一つであり続けています。ストロークの約87％が起源における虚血性であり、中大脳動脈（MCA）の領土で発生します。現在、食品医薬品局（FDA）は、この壊滅的な疾患の治療のための薬物を承認し、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）です。しかし、tPAが投与のための小さな治療窓があり（3から6時間）、および実際にそれを受けた患者の4％でのみ有効です。現在の研究は、潜在的な治療標的を見つけるために脳卒中の病態生理を理解することに焦点を当てています。したがって、信頼性のあるモデルが重要であり、MCA閉塞（MCAO）モデルは、虚血性脳卒中の最も臨床的に関連する外科的モデルとみなされる（さらに腔内フィラメントまたは縫合糸モデルと呼ばれる）、およびかなり非侵襲的かつ容易に再現可能です。典型的には、MCAOモデルは、特にによるマウスと、げっ歯類で使用されていますこの種のために利用可能なすべての遺伝的変異に。ここでは、成功し、信頼性と再現性のあるデータを生成するために、マウスでは（再灌流で）MCAOモデルを実行する方法について説明します（とビデオに存在します）。

マウスは、（24時間と1週間がここに提示されているが、再灌流の長さを変化させることができる）再灌流の期間に続いて30分にMCAo誘発性脳虚血（ 図1）を受けました。 MCAo時の死亡率は、（約2％）最小でした。ポスト虚血、（最初の24時間以内）の死亡率は約26％でした。 レーザードップラー流量測定は、にMCAo /再灌流前後のMCA領域における血流灌流を確認した。 図4は、一時的なCCAタイの発生が30フィラメントを除去するための虚血分の再灌流後に放出されたときに、サージが存在することを明らかに実証します&lt;ベースライン灌流（ すなわち 、手術前に）再灌流に5分の100％に達した灌流、インチ （前の梗塞容積の測定に）脳卒中発症neurol後24...

脳卒中の病態生理学を理解するためには、信頼性のあるモデルを使用することが重要です。この論文は、マウスにおいて最も頻繁に使用される脳卒中モデルのいずれかを説明する、中大脳動脈閉塞（MCAO）モデルと呼ばれる再潅流と（また腔内フィラメントまたは縫合モデルと呼ばれます）。

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ...

Longa法の全体的な目的は、中大脳動脈（MCA）の根元で虚血を再現することであり、これはヒトにおける虚血性脳卒中の多くがMCAの閉塞によって起こるためです。この手法は、本疾患の治療に適した治療標的をどのように見つけるかなど、脳卒中研究における重要な問いに答えるのに役立ちます。代替技術と比較したLonga法の主な利点は、生存率にあります。また、この手法を用いると、白血球と内皮細胞の相互作用および梗塞体積が増加します。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のマネージャーであるShantel Vitalが行います。テキストのプロトコルに従ってC57BL/6系統の雄マウスに麻酔を導入した後、足指へのピンチ刺激で麻酔深度を確認し、乾燥を防ぐために滅菌眼軟膏を塗布してください。次に、動物の頸部を剃毛します。マウスを温度調節マットの上に仰向けに配置し、直腸プローブを挿入して、体温を36.5 ± 0.1 °Cにモニターおよび維持します。その後、70%エタノールを用いて皮膚を消毒します。次に、Irisストレート鋏を用いて正中切開を行い、軟部組織を牽引して血管を露出させます。Dumontピンセットを使用し、迷走神経を損傷しないように注意しながら、総頸動脈（CCA）および外頸動脈（ECA）を周囲組織から剥離します。7-0シルクを用いて、CCAの周囲にゆるい結び目を作り、一時的な縫合を行います。次に、外頸動脈（ECA）およびそこから伸びる細い血管をしっかりと結紮し、永久縫合を行います。続いて、総頸動脈（CCA）の分岐点より近位側のECAを縫合します。その後、内頸動脈（ICA）および翼口蓋動脈（PPA）にマイクロ血管クリップを留置します。マイクロ解剖用スプリングシザーを用いて、永久縫合部にできるだけ近いECAに小さな切開を加え、180 µmのシリコンチップ付きモノフィラメントを挿入します。フィラメントを挿入した状態で、ECA周囲の一時縫合糸を締め、マイクロ血管クリップを取り除きます。マイクロ解剖用スプリングシザーを用いて、永久的な遠位縫合部とフィラメントの挿入点の間でECAを切断します。フィラメントをICAに通し、MCAで抵抗を感じるまで進めます。詳細はテキストプロトコルの追加情報を参照してください。30分間の閉塞期間後、Dumontピンセットを用いてフィラメントを慎重に引き抜き、ECAの開口部を縫合して固定します。結紮を慎重に緩めてCCA周囲の一時的な縫合糸を取り除き、CCAの血流を再開させます。リトラクターを取り除き、連続縫合を用いて切開部を閉鎖します。液量補填のため、生理食塩水1mLをマウスの皮下に注射し、また手術による痛みと不快感を緩和するために鎮痛剤のカルプロフェンを投与します。30°Cに加熱した専用ケージ内で、マウスが麻酔から回復するまで観察し、摂食を促すためにケージの床にペトリ皿に入れたマッシュ状の飼料を配置します。適切な再灌流期間の後、18点満点のスコアリングシステムを用いて、全般、運動、感覚、および固有受容のスコアを評価し、マウスの神経学的評価を行います。神経学的スコアが高いほど、神経機能の低下に対応します。脳梗塞体積を測定するため、テキストのプロトコルに従って麻酔を導入し、麻酔深度を確認した後、マウスを仰向けに寝かせ、Iris直線鋏を用いて腹部から頸部にかけて皮膚を切開し、続いて腹膜を切開します。Dumontピンセットで胸骨を持ち上げて肋骨を切断します。その後、2本の止血鉗子を使用して胸腔の左右を広げ、心臓を露出させます。26ゲージの針を装着した5mLシリンジを左心室に挿入し、右心房を切断します。次に、室温の生理食塩水またはPBSを用いて、液が透明になるまで心臓を灌流します。アイリス直線型鋏とピンセットを用いて動物の頭部を切断し、頭蓋骨から慎重に脳を取り出します。次に、カミソリを用いて、脳がマトリックスに収まるように嗅球と小脳を切り離します。マトリックスを冷却した後、脳を中に配置し、氷上に置きます。続いてカミソリを使い、脳の上端から2 mmのところで最初の切断を行い、そのままブレードを置いておきます。2枚目のカミソリを用いて、1枚目の切開箇所の後方にさらに2 mmの切開を加えます。次に、組織が付着した1枚目のカミソリを取り除きます。すべての組織がスライスされるまで、この操作を繰り返します。各セグメントを、切断した順に、2% 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）を含む24ウェルプレートの各ウェルに入れ、プレートを37 °Cの浅いウォーターバスで20分間静置する。10分間インキュベートした後、スライスを裏返す。次に、新しい24ウェルプレートのウェルに少量の10% ホルマリンを入れ、切断した順にセグメントをホルマリンのウェルへ移す。セグメントをコンピュータに取り込んだ後、ImageJ解析ソフトウェアを使用して、梗塞領域を囲み面積を算出することで、脳切片全体に対する梗塞サイズの割合を解析します。次に、対照側半球全体の面積を測定します。最後に、梗塞面積を対照側半球の面積で除し、100を掛けることで、梗塞体積を算出します。ここに示すように、MCA再灌流の前後にMCA領域の血流灌流を確認するために、レーザードップラー血流計が使用されました。フィラメントの除去と再灌流を行うため、30分間の虚血後に一時的なCCA結紮を解除すると、灌流が急増し、再灌流5分後にはベースライン灌流の100%弱に達しました。この表には、全般的、感覚的、運動的、および固有受容的な欠損の評価に関する神経学的スコアが記載されています。このグラフは、24時間後の27匹のマウスのスコアが12.56 ± 0.7であり、1週間後も11.50 ± 1.5と高いままであったことを示しています。神経学的スコアが高いほど、神経機能の低下を表します。梗塞体積は、24時間後の神経学的スコアと同様のパターンを示しました。本手法で示した通り、MCAoから24時間後においてマウスに大きな梗塞体積が認められ、脳卒中から1週間後にはさらに増大しました。習熟すれば、正しく実施することでこの手技は15分以内に完了させることが可能です。本手順を行う際は、温度を36.5 °Cに維持することが重要です。本手順に続き、盲腸結紮穿刺などの他の手法も実施可能です。これにより、脳卒中前後の敗血症の影響といった追加の疑問を検討することができます。このビデオを視聴することで、モノフィラメントを中大脳動脈に挿入して虚血を誘導し、その後それを抜去して再灌流させる方法について十分に理解できるはずです。アイリス鋏や鉗子などの器具の使用には危険が伴うため、常に十分な注意を払ってください。

surgical-approach-for-middle-cerebral-artery-occlusion-reperfusion

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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このプロトコルは、総頸動脈を介した中大脳動脈閉塞再灌流の準備プロセスを説明しています。...

中大脳動脈閉塞再灌流のための修正モデル調製

学ぶマウスの中大脳動脈閉塞再灌流法による脳卒中モデル構築。Longa法を用いて虚血を再現し、高い生存率と再現性を確保しながら、治療標的の探索や神経機能評価を行う手法を解説します。

マウスの中大脳動脈閉塞再灌流誘発性の脳卒中のための外科的アプローチ

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