イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

この手順の全体的な目標は、無傷の心臓の奥深くにある蛍光タンパク質標識細胞を体積的に画像化し、心臓の発生中および出生後の心臓の単一細胞分解能で遺伝子機能を研究することです。この方法は、遺伝子機能の研究や、心臓発生中の単一細胞分解能での画像化、アニミダルアーティファクトなど、心臓発生中の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、比較的単純で安価であり、無傷の胚または心臓における単一細胞の分解能で遺伝子およびタンパク質機能の特別な時間的分析において賢明

マウスの心臓発生の研究にこのシステムを使用していますが、筋肉、脳、肺などの他の臓器系や他のモデル生物の研究にも使用できます。ここでは、タモキシフレン処理されたR-26 Cre-RET2紙吹雪ダム由来の蛍光タンパク質陽性胚を使用しています。染色を開始するには、各パラホルムアルデヒド固定胚を0.1%PBSTの1ミリリットルに48ウェルプレートのウェルに浸します。

プレートシェーカーで室温で2時間インキュベートし、組織を透過化します。次に、透過化溶液を1 mLのブロッキングバッファーに交換し、振とうしながら室温で2時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、内皮細胞特異的抗体であるPECAMを各ウェルの0.3ミリリットルのブロッキングバッファーに1〜100希釈分に調製し、これを胚を含むウェルに加えます。

4°Cで振とうしながら48時間インキュベートします。インキュベーション後、胚をPBSTで5回、毎回30分間洗浄し、組織から余分な一次抗体を除去します。次に、胚をAlexa Fluor 647ヤギ抗ビタミン二次抗体溶液に浸し、光から保護しながら摂氏4度で48時間振とうしながらインキュベー

48時間後、前に洗い流した後、胚を4%PFAで室温で1時間振とうしながら後固定します。その後、PBSで2回、各回5分間洗浄した後、胚をDAPI核染色剤で10分間インキュベートします。その後、PBSをそれぞれ5分間ずつ2回洗浄し、ティッシュのクリアリングに進みます。

組織の透明化は、心臓を単一細胞の解像度で画像化するためのこのプロトコルの最も重要なステップです。また、スケールまたはCUBICのいずれかのクリアリング方法の選択は、無傷の胚性心臓における蛍光シグナルを保存するためにも非常に重要である。洗浄して染色した胚を、1ミリリットルのスケールA2溶液を含むアルミホイルで包んだシンチレーションバイアルに移します。

摂氏4度でインキュベートし、時折手で穏やかに振とうしながら48時間。スケールA2のインキュベーション後、バイアル内の溶液を1ミリリットルのスケールB4溶液と交換し、摂氏4度でインキュベートし、時折穏やかに振とうしながらさらに48時間インキュベートします。胚をさらに48時間インキュベートし、1ミリリットルのスケール70で摂氏4度で、前と同じように時折穏やかに振とうします。

最後に、スケールクリアしたサンプルを90%グリセロールの1ミリリットルに浸し、イメージングまで摂氏4度で保存します。イメージングするには、サンプルを最小限の90%グリセロールでガラス底のペトリ皿に移し、2光子機能を備えた共焦点顕微鏡でイメージングします。CUBICクリアリングでは、各胚を1ミリリットルのCUBICに沈め、時折穏やかに振とうしながら摂氏37度で48時間行います。

48時間後、溶液を同量の新しいCUBIC試薬と交換し、以前と同様にサンプルをさらに48時間インキュベートします。インキュベーション後、CUBIC One処理した胚をPBSで数回洗浄し、手で穏やかに振とうして余分なCUBIC One溶液を除去します。次に、胚をCUBIC 2溶液に37°Cで48時間浸し、時々手で穏やかに振とうします。

イメージングまでに遅延が生じる場合は、30%50%および70%グリセロールとPBSを1ミリリットルずつ添加して、サンプルをそれぞれ30分間インキュベートします。シリーズを移動した後、摂氏4度で保存するために90%グリセロール溶液に移します。準備ができたら、前と同じように、グリセロール90%のガラス底のシャーレでイメージします。

この動画は、スケール処理されたE 8.75心臓の心臓表面から内腔までの光学切片を示しています。黄色はPECAMの発現を示し、すべての心筋細胞は緑色で表示されます。深さは110.4ミクロンで、スライスは全部で93枚。

これは、先ほど示した再建された心臓の3D表面画像です。ここでも、黄色はPECAM発現を示し、緑はすべての心筋細胞を示します。この動画は、流出路領域にあるスケール処理されたE 9.5心臓の単一の前駆細胞クローンの切片を示しています。

黄色はPECAM式を示し、クローンは緑色で表示されます。深さは36ミクロンで、スライスは全部で10枚あります。この動画は、CUBIC処理されたP 2ハートの表面から内腔までの切片を示しています。

深さは130ミクロンで、セクションごとに3ミクロンです。この動画は、CUBIC処理されたE 17.5心臓の表面から内腔までの部分を示しています。深さは630ミクロンで、セクションごとに6ミクロンです。

これは、示したばかりの心臓の3D表面画像を、3D再構築ソフトウェアで再構築したものです。この手順を試みるときは、胚が壊れやすく、心臓の病状が簡単に乱される可能性があることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、染色を使用して、ポストオストレーションおよび泡立った遺伝子機能を研究することにより、他のタンパク質を実現できます。