Name: イメージングは、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学ぶ 組織透明化と全マウント染色を用いた単一細胞解像度の心臓イメージング法。胚および出生後の心臓における遺伝子機能を詳細に解析し、心臓発生の理解を深める比較的簡便で費用対効果の高いプロトコルです。

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科学的な議論に対して、M.W.研究室のメンバーに感謝します。この作業は、AHA [13SDG16920099] から M.W. への支援を受け、National Heart, Lung, and Blood Institute の助成金 [R01HL121700] から M.W. への画像がアルバニー医科大学のイメージング コア施設で撮影されました。

全ての動物実験は、アルバニー医科大学で制度動物実験委員会（IACUC）によって承認され、実験動物の管理と使用に関するNIHガイドに従って行いました。 1.ソリューションの準備注：Rosa26Cre ERT2 15、R26R-紙ふぶき 16、αMHC-Creを17、 とのRosa26-mTmG（mTmG）20マウスのラインが商業的に購入したcTnTの-Creを 18は、アラバマ大学の博士交通からの贈り物だったのNFATc1-Creを 。医学19のアルバートアインシュタイン大学の博士ビン周からの贈り物でした。マウスは、二国間の開胸、断頭または頸椎脱臼により死亡検証の物理的手段に続いて、少なくとも60秒間密閉チャンバーに二酸化炭素吸入によって安楽死させました。 <ol><li>タモキシフェンを準備します。ヒマワリ種子大井の10ミリリットルにタモキシフェン10mgを溶かしリットル。 -20℃で完全に溶解したら、アリコートとストア。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備します。 Na 2 HPO 4（1.41960グラム）、KH 2 PO 4（0.24496グラム）、塩化ナトリウム（8.0669グラム）及び蒸留水1L中のKCl（0.20129グラム）を溶解し、pHを7.4に調整します。 </li><li> PBSTを調製0.1％のTween-20溶液をPBS中でPBS 100mlのTween-20を100μlの溶解させることによって。 </li><li>ブロッキングバッファーを準備します。 0.2％のTween-20を含有するPBST 100mlにBSAを3gを溶解し、3％ウシ血清アルブミン（BSA）ブロッキング溶液を作ります。 </li><li> CUBIC-1（試薬1）を準備します。 25重量％の尿素、25重量％のN、N、N &#39;、N&#39;-テトラキス（2-ヒドロキシプロピル）エチレンジアミンとのdH 2 O中15重量％のTriton X-100を混合</li><li> CUBIC-2（試薬2）を準備します。 50重量％のショ糖、25重量％の尿素、10重量％の2,2 &#39;、2&#39; &#39;ミックス- nitrilotriethanolおよび0.1％（Vし/ V）のdH 2 O中のトリトンX-100 </li><li> Sca ル A2を準備します。4 M尿素、w / vグリセロール10％および0.1％のw / vのトリトンX-10dH 2 O中0 7.7にpHを調整します。 </li><li> Sca ルの B4を準備しますのdH 2 Oで8 M尿素およびワット/ vのトリトンX-100を0.1％ 8.7にpHを調整します。 </li><li> 4 M尿素、70％のw / vのグリセロールおよび0.1％W / VトリトンX-100 の dH 2 O中：のSca ル 70を準備します</li></ol> 2.タモキシフェン誘導、胚の単離と固定<ol><li>タモキシフェン誘導および胚の単離<ol><li> （R26Cre ERT2雄マウスで塞が）女性R26Cre ERT2紙吹雪マウスは、胚の発達日E7.75 33でタモキシフェンを10μg/ gの湾曲した栄養管を使用して、承認されたプロトコル（ACUP 13から12007）、強制飼養。胎生9.5（E9.5）またはE10.5では、CO 2および頸椎脱臼と雌マウスを安楽死させます。 </li><li>マウスの死亡確認後（セクション1を参照してください。注）、はさみでマウス腹腔を開き、子宮角を解剖、ハサミやピンセットの助けを借りて卵管層を除去し、再子宮管23,24から胚をリース。 <ol><li> PBS（pHは7.4）を含有するペトリ皿に胚を移します。解剖顕微鏡下では、ピンセットの助けを借りて、非胚層（絨毛膜、卵黄嚢と羊膜）を削除。 </li></ol></li><li>以前に22を報告したようにピンセットやハサミを使用して、遺伝子型決定のための雌マウスと胚の尾のサンプルを収集します。プラスチックピペットを用いて、1×PBSの1ミリリットルを含む48ウェルプレートのウェルに各胚を移します。 </li><li>蛍光顕微鏡下では、カメラ付き倒立顕微鏡を介して、GFP / RFP / CFP陽性の胚を識別します。ピール離れてピンセットを用いて、心膜とGFP / RFP / CFPフィルターと心の両面上の蛍光クローンの数を決定するために、湾曲したピンセットの助けを借りて心/胚を回転させます。いいえカットは必要ありません。 </li></ol></li><li> GFP / RFP / CFP陽性の胚を識別した後、すぐに目で1×PBSで2回（各2分）の胚を洗います室温（RT）でプレートシェーカー上で電子48ウェルプレート。これは、過剰な血液を除去します。 </li><li> RTで4％パラホルムアルデヒド（PFA）を使用して、胚/胎児心を修正しました。定着時間は、胚の年齢や組織のサイズによって異なります。 E9.5室温で2時間の胚を修正。後期胚の段階の胚でも生後心臓のために24時間まで延長することができ、より長い定着時間を必要とします。 注意：パラホルムアルデヒドは毒性があり、皮膚、目や粘膜との接触を避けます。 </li><li>固定後、室温でプレートシェーカー上で二回（各10分）1×PBSで48ウェルプレートに胚/心を洗います。これは、胚/心臓から過剰PFAを削除します。胚はその後さらにホールマウント染色および組織をクリアするために処理されます。 </li></ol> 3.ホールマウント染色注：次のようにPFA固定後胚/心臓が全体のマウント染色に供されます。 <ol><li> 1メートルを使用して、48ウェルプレートに胚/心を透過性RTでプレートシェーカー上で2時間、0.1％PBSTのリットル。 </li><li>透過処理に続いて、4ºCでプレートシェーカー上で2時間または一晩、ブロッキング緩衝液1mlに胚/心を浸します。 </li><li> 4ºCでプレートシェーカー上で48時間、ブロッキング緩衝液0.3ミリリットルで：（100 1）で希釈し、内皮細胞特異的抗体PECAM（CD31）に胚/心を浸し。 </li><li>プレートシェーカー上で室温でPBSTを5回、30分ごとを使用して胚/心を洗ってください。これは、組織からの過剰非特異的結合した一次抗体を除去します。 </li><li> 4ºCでプレートシェーカー上で48時間、ブロッキング緩衝液1ミリリットル中：（千1）で希釈し、アレクサフルオロ647ヤギ抗ラット二次抗体で胚/心を浸します。 </li><li>二次抗体を洗浄する手順を繰り返し3.4。 </li><li>プレートシェーカー上で室温で1時間、4％PFAで胚/心を後固定し、PBSで5分間、それぞれで二回洗浄します。 </li><li>コンセントでPBSTで希釈した核染色4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（と胚/心を染色RTでプレートシェーカー上で10分間、0.01 mg / mlで）の比。それぞれ5分の2回のPBS洗浄に従ってください。 </li></ol> 4.胚/のSCA リットルの eまたはキュービック法とハートのクリア注：ホールマウント染色した後、胚/心臓がのSca ルまたはCUBIC組織のクリア方法のいずれかに供されます。方法の選択は、組織のサイズおよび胚の年齢に依存します。 E11.5以前の年齢の胚のための、のSCA リットル電子組織のクリア方法を使用して、古い胚または出生後の心のためにCUBIC組織クリア方法が好ましいが。 <ol><li>規模組織のクリア方法<ol><li>時折穏やかに4℃で48時間（手で）振とうしながら（アルミホイルに包んで）シンチレーションバイアル中のSCA リットル電子 A2溶液1mlと胚/心をインキュベートします。 </li><li> Sca リットル電子のA2のインキュベーションの後、時折穏やかanot振とう同じバイアル中で4℃でのSCA リットル電子B4の溶液1 mLで胚/心をインキュベート彼女の48時間。 </li><li>時折穏やかに振とうしながら4℃で1ミリリットルのSCA リットル電子 70と別の48時間胚/心をインキュベートします。 90％グリセロールを使用してマウント胚（セクション5.1を参照）。 </li></ol></li><li> CUBIC組織のクリア方法<ol><li>全胚/心CUBICクリアするため、時折穏やかに37ºC7で48時間振とうCUBIC-1の1ミリリットル中の各胚/心を浸します。 48時間後、新鮮なCUBIC試薬1の同じ体積で溶液を交換し、時折手で振盪しながら37℃でさらに48時間、サンプルをインキュベートします。 </li><li>穏やかに手で振盪しながら室温で1×PBSで数回CUBIC-1処置した心臓/胚を洗ってください。これは、過剰CUBIC-1溶液を除去します。 </li><li> PBSでCUBIC-1を洗浄した後、時折穏やかに手で振盪しながら37ºCで48時間CUBIC-2溶液（胚/心あたり1グラム）で胚/心を浸します。これは、グリセロールを用いた実装胚/心を次の（第5節参照します0.2）。 </li></ol></li></ol> 5.サンプル取付け・イメージング注：のSCA リットル電子 70またはCUBIC-2溶液中でクリア胚または器官がそれぞれ、イメージング媒体としてのスケール70とCUBIC-2溶液を用いて直接画像化することができます。しかし、試薬をクリアする胚サンプルの脆弱性を考慮すると、サンプルはすぐに画像化されたが、長期的に保存されていない場合、以下のプロトコルに従って、90％グリセロール中でサンプルを格納。 <ol><li>直接のSca LEが撮像されるまで4℃で90％グリセロール、店舗の1mlのサンプルをクリア浸します。 </li><li>二回1×PBSで5分間ずつCUBIC処理サンプルを洗浄し、順次30分間、30％、50％、70％、90％グリセロール溶液をそれぞれ1 mlのサンプルをインキュベートします。 </li><li>イメージングのために、2光子機能を備えた共焦点顕微鏡を用いて、90％のグリセロールおよび画像クローンの最小量のガラス底ペトリ皿に試料を移します。 </li><li> 10X / 0.3 NA、25X / 0.8 NAの浸漬、または40X / 1.2 NA水矯正対物レンズと画像グリセロールで心臓や胚を。サファイアカメレオンレーザー：コヒーレントチタンから2光子励起を用いた画像DAPI。顕微鏡対物レンズの選択は光学シート蛍光顕微鏡を利用することができ、超解像のために、例えば 、実験の目的に依存するであろう。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

胚の分離は非常に重要なステップです。 E9.5胚ので細心の注意が単離中の胚/心臓の構造に損傷を与えないように注意する必要があり、サイズは非常に壊れやすいと小さいです。胚全体を撮像する場合、胚/心臓を包む非胚余分な層は、特に慎重に除去しなければなりません。これは、胚組織の奥深く抗体および清算混合物の浸透を可能にし、また、撮像する際のバックグラウンド信号を除去するのに役立ちます。 PECAMに対する抗体を含む複数の抗体、アセチル化αチューブリン及びインテグリンβ1を試験し、すべてが正常に検出された（データは示していない）33。これは、分子の完全性は、細胞の完全性および抗原互換性がこの決済処理中に破壊されなかったことを示しています。 広口トランスファーピペット（先端をカット）を使用して、胚/心を転送します。これは、取り扱い中の損傷を避けることができます。 GFP / YFP / RFP / CFP発現パターンとnクローンのアンバーは、慎重に1心あたりのクローンまたは任意の他の臓器にラベルを付けるための適切な投与量を決定するために、心臓に記録されるべきです。タモキシフ...

心臓の形態形成は、心臓の別個のセクタに心臓前駆細胞の4つの異なるタイプの時空間組織を必要とし、また、機能的な心1,2を形成するために、このプロセスを調整するために、複数の遺伝子制御ネットワークを必要とするシーケンシャルイベントです。心臓の仕様、分化、パターニング、及びチャンバ成熟は心原性転写因子3によって規制されています。心臓前駆細胞の遺伝的変異またはこれらの因子の転写後収差は、胚性致死または先天性心臓欠陥（CHD）4のいずれかになる可能性があります。心臓の形態形成の研究では、3次元（3D）に固有の構造的な詳細を理解する必要がありますし、心臓の開発中にトレース単一ラベルされた心臓前駆細胞系譜は、心臓の形態形成の理解を促進します。高解像度の部分ベース断層撮影法の数が目に開発されています画像臓器構造5,6に数十年の過去の電子。しかしながら、これらの方法は高価で特殊な機器、広範な労働力を必要とし、最終的な体積再構成された画像7,8における単細胞解像度で詳細な構造組織を欠いています。 単一細胞レベルでの3Dボリュームイメージングは、 生体 7 に前駆細胞の分化および細胞の挙動を研究するための手段を提供します。しかし、組織の光散乱が深く、無傷の心の中の3Dでの細胞や構造を画像化する主要な障害となっています。脂質は、光散乱の主要な供給源であり、脂質および/または脂質およびその周辺地域との間の屈折率差の調整の除去は、組織透明8を高めるための潜在的なアプローチです。過去数年間で、組織のクリア方法の数は、組織の不透明度と光の散乱を低減しており、開発されたBABB（ベンジルアルコール、ベンジルbenzoatなどEの混合物）とDBE（テトラヒドロフラン、ジベンジル）;しかし、これらの方法では、蛍光消光が問題8-10まま。溶媒としては、例えばSeeDB（フルクトース/チオグリセロール）と3DISCO（ジクロロメタン/ジベンジル）などの親水性の方法を、ベースの蛍光シグナルを維持するが、7,8,11透明な臓器全体をレンダリングしません。比較では、CLARITY組織クリア方法は、透明な臓器をレンダリングするが、それはまた、7,13を埋め込むヒドロゲルを必要とする、PACT（パッシブ明確にする技術が）同じように、脂質8,12を除去するために、特殊な電気泳動装置を必要とします。利用可能なすべての組織クリアする方法に関する詳細情報については、 ら 、リチャードソンとリヒトマンの表1を参照してください。7。 2011年に、ハマらは偶然マウス脳と胚transparをレンダリングする親水性混合物」のSca ル 」（尿素、グリセロールおよびTriton X-100混合物）を発見しましたENT完全に標識されたクローン14からの蛍光シグナルを維持しながら。これは、無傷の数ミリメートルの深さで脳や細胞内の解像度でニューロン集団と突起の大規模な再構成の撮像を可能にします。須崎ら。さらにクリア時間を減少させ、リン脂質可溶化を増加し、多色蛍光イメージング8に許可された組織のクリア方法は、アミノアルコールを添加することにより、のSca ルを改善し、「CUBIC」（クリア、遮るもののない脳画像カクテルやコンピュータ解析）を開発しました。本研究では、心臓の間に心の中のSca ルの利点とCUBIC組織決済技術と高解像度の3D光学切片、個々のクローンを取ることはRosa26Cre ERT2 15、R26R-紙ふぶき 16、αMHC-Creを17、cTnTの-のCreを使用して追跡しました18、 </strong&gt; NFATC1-Creを 19、とのRosa26-mTmG（mTmG）20マウス系統。ホールマウント染色（WMS）メソッドの組み合わせは、以前に21,22、さらに標識されたクローン中の他のタンパク質の染色のためにと3Dボリュームコンテキストで彼らの行動の研究のために許可された組織のクリア方法とを開発しました。組織のクリア及びWMSの組合せは、心臓の開発中の異なる遺伝子およびタンパク質の役割のよりよい理解を可能にし、先天性心臓欠陥の病因。このプロトコルは、開発中に、他の前駆細胞の分化、細胞の挙動、および臓器形態形成事象を研究するために適用することができます。

<table><tbody><tr><td>2,2&素数;,2&素数;'-ニトリロトリエタノール&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr>PBS <td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td>BSA Fischer Scientificの<td>4%パラホルムアルデヒド</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>BP16000</tr><tr><td>N,N,N',N'-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル) エチレンジアミン&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液 生理食塩水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>タモキシフェン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>ヒマワリ種子油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>550274</tr><tr><td>Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI核染色剤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37oC インキュベーター</td><td>Thermoscientific Fischer</td><td>Heratherm, Compact Microbiological Incubators</td><td></td></tr><tr><td>48ウェルプレート</td><td>Cell Treat</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>ツァイス 510 共焦点顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ユニトロン</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>オブザーバー。Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 ガラスビーズ滅菌器</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>ペア はさみ</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 60 mm x15 mm&nbsp;</td><td>TPPテクノプラスチックプロダクツAG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>ロッカーII&nbsp;プラットフォーム</td><td>ロッカーBoekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr>シン<tr><td>チレーティングチューブ</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr>ピン<tr><td>セット</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

全心臓レベルで単一のクローン追跡および分析は、心臓の開発中に、心臓前駆細胞の挙動および分化を決定し、正常と異常な心臓の形態形成の細胞および分子基盤の研究を可能にすることができます。レトロスペクティブ単一クローン解析の最近の新技術は、実現可能な単一細胞の解像度で心臓の形態形成の研究を行います。しかし、撮像深さ、心臓の組織の不透明性と光散乱は単細胞解像度で妨げる全心臓イメージングを増加させます。これらの障害を克服するために、照明および検出の両方のための透明性の高い心をレンダリングすることができます全胚清算システムが開発されなければなりません。幸いなことに、ここ数年では、このようなCLARITYなどの全生物の決済システム、のSca ル 、SeeDB、ClearT、3DISCO、CUBIC、DBE、BABBとPACTのための多くの方法が報告されています。このラボでは、カードの細胞および分子メカニズムに興味がありますIACの形態形成。最近、我々はROSA26-CreをERT2を経由してトレース単一細胞系統を確立し、ROSA26-紙吹雪システムまばらにラベル細胞に心臓の開発中に。私たちは、心の内の画像の単一クローンにホールマウント染色と組み合わせて胚をクリアするためのSca ルとCUBIC（クリア、遮るもののない脳画像カクテルやコンピュータ解析）を含むいくつかの胚全体-クリアする方法論を適応しました。心臓が正常に単一細胞の解像度で画像化しました。私たちは、SCA ルは、胚の心をクリアすることができることを発見しましたが、組織を効果的に溶解することによって胚の心をCUBICは、生後の心をクリアすることができますが、生後の心をクリアしますが、損害賠償はできません。ここに記載される方法は、順番に、先天性心臓欠陥の細胞および分子基盤を明らかにすることができ、心臓の形態形成、間に単一クローンの解像度での遺伝子機能の研究を可能にします。

クリア胚の心臓を画像化脊椎動物の心臓の形成は時空間的に調節形態形成のプロセスであり、4つの異なるソース1からの組織および前駆細胞の分化に依存します。心臓三日月の最初の心臓領域からの細胞は、線形心管を形成するために、腹側正中線に向かって折ります。最初に最初の心臓領域にdorsomediallyに存在する第二の心臓フィールドからの細胞は、その後、彼らは線形心管の既存の足場に移行するところから、咽頭および内臓中胚葉に移行します。第二の心臓野の細胞は右心室、流出路（OFT）心筋に、いくつかの心内膜25-28に貢献していきます。心臓の神経堤細胞（CNCC）、postotic rhombomeres 6、図7、図8からの発信は、尾側咽頭に移行し、signifiに貢献しますOFTにおける平滑筋層と心内膜クッションにcantly。彼らはまた、大動脈肺動脈中隔29,30の形成に寄与しています。第四の人口は...

私たちは、無傷の胚および出生後の心臓の奥深くにある蛍光タンパク質標識細胞を体積的に画像化するプロトコルを記述します。組織透明化法とホールマウント染色を併用することで、胚性または出生後の心臓内の単一蛍光タンパク質標識細胞を鮮明かつ正確にイメージングすることができます。

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

この手順の全般的な目的は、蛍光タンパク質で標識された細胞を、無傷の心臓内部の深部で体積イメージングし、心臓の発達過程および出生後の心臓における単一細胞解像度での遺伝子機能を研究することです。この手法は、心臓の発達過程における遺伝子機能の研究や、単一細胞解像度でのイメージング、および動物個体におけるアーティファクトの解析など、心臓発達における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、比較的簡便かつ低コストであること、そして無傷の胚または心臓において、遺伝子およびタンパク質の機能を単一細胞解像度で時間的に解析できる点にあります。本システムはマウスの心臓形成の研究に用いていますが、筋肉、脳、肺などの他の器官系や、他のモデル生物の研究にも適用可能です。ここでは、タモキシフェン投与後のR-26 Cre-RET2 confetti マザーマウスから得られた蛍光タンパク質陽性胚を使用します。まず、パラホルムアルデヒドで固定した各胚を、48ウェルプレートの各ウェルに分注した1 mLの0.1% PBSTに浸し、染色を開始します。組織を透過処理するため、プレートシェーカーを用いて室温で2時間インキュベートする。次に、透過処理溶液を1 mLのブロッキングバッファーに置換し、振盪しながら室温で2時間、または4 °Cで一晩インキュベートする。続いて、各ウェル用に、内皮細胞特異的抗体PECAMをブロッキングバッファー0.3 mLで1:100に希釈して調製し、胚が入ったウェルに加える。4°Cで48時間、振盪しながらインキュベートします。インキュベート後、組織から過剰な一次抗体を除去するため、PBSTで30分間の洗浄を5回繰り返します。次に、胚をAlexa Fluor 647 goat antivat二次抗体溶液に浸し、遮光した状態で4°Cで48時間、振盪しながらインキュベートします。48時間後、事前に洗浄を行った後、胚を4% PFAで室温にて1時間振盪しながら後固定します。次に、PBSで5分間ずつ2回洗浄し、DAPI核染色液で胚を10分間インキュベートします。続いてPBSで5分間ずつ2回洗浄し、組織透明化へと進みます。単一細胞解像度で心臓をイメージングするためには、組織透明化が本プロトコルにおいて最も重要なステップとなります。また、無傷の胚心臓における蛍光信号を保持するためには、scaleまたはCUBICのどちらの透明化手法を選択するかという点も非常に重要です。洗浄および染色済みの胚を、1 mLのscale A2溶液が入ったアルミホイルで包まれたシンチレーションバイアルに移します。4°Cで、時折手で穏やかに振盪しながら48時間インキュベートします。スケールA2のインキュベーション後、バイアル内の溶液を1 mLのスケールB4溶液に交換し、同様に時折穏やかに振盪しながら4°Cでさらに48時間インキュベートします。その後、1 mLのスケール70を用いて、同様に時折穏やかに振盪しながら4°Cで胚をさらに48時間インキュベートします。最後に、スケール除去したサンプルを1 mLの90% glycerolに浸し、イメージングまで4°Cで保存します。イメージングの際は、サンプルを少量の90% glycerolを入れたガラス底ペトリ皿に移し、2光子励起機能を有する共焦点顕微鏡で撮影します。CUBIC透明化を行う場合は、各胚を1 mLのCUBIC oneに浸し、37°Cで時折穏やかに振盪しながら48時間処理します。48時間後、溶液を同量の新鮮なCUBIC reagent oneに交換し、前と同様にサンプルをさらに48時間インキュベートします。インキュベーション後、CUBIC one処理した胚をPBSで数回、手で穏やかに振って洗浄し、余分なCUBIC one溶液を除去します。次に、胚をCUBIC two溶液に浸し、37 °Cで時々手で穏やかに揺らしながら48時間静置します。イメージングまで時間がかかる場合は、30%、50%、70%のグリセロールおよびPBSを順に1 mLずつ加え、それぞれ30分間インキュベートします。一連の処理後、90%グリセロール溶液に移し、4 °Cで保存します。準備ができたら、前述と同様に、90%グリセロールを入れたガラス底ペトリ皿を用いてイメージングを行います。この動画では、スケール処理を施したE 8.75の心臓の、心臓表面から腔までを光学切片で示しています。黄色はPECAMの発現を示しており、心筋細胞はすべて緑色に表示されています。深さは110.4 micronsで、合計93枚のスライスがあります。これは、先ほど示した再構築された心臓の3D表面画像です。ここでも、黄色はPECAMの発現を示し、緑色はすべての心筋細胞をラベルしています。この動画では、スケール処理を施したE 9.5心臓の流出路領域における、単一の前駆細胞クローンの切片を示しています。黄色はPECAMの発現を示し、クローンは緑色に表示されています。深さは36 micronsで、合計10スライスあります。この動画では、CUBIC処理を施したP2期の心臓の表面から腔までを断面で示しています。深さは130 µmで、1セクションあたり3 µmです。この動画では、CUBIC処理を施したE 17.5の心臓の表面からルーメンまでのセクションを示しています。深さは630 µmで、1セクションあたり6 µmです。これは、先ほど示した心臓の3D表面画像であり、3D再構成ソフトウェアを用いて構築したものです。この手順を行う際は、胚が脆弱であり、心臓の病理学的構造が容易に乱れうることに留意することが重要です。この手順に続き、染色を用いることで、心拍停止後などの遺伝子機能を研究するための他のタンパク質の可視化が可能です。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

&gt;jove_content&lt;先天性心疾患を引き起こす突然変異は、発生中の心臓構造のin...

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

我々は、光のクリアランス、共焦点顕微鏡に続く標準的な免疫学的染色法を用いて、E15.5までの全胚マウス心臓における冠血管の分析のためのプロトコルを提示します。この技術は、連続切片の時間のかかる分析を必要とすることなく、心臓全体にわたって血管の可視化を可能にします。...

クリア胚ハーツにおける冠状血管の分析

心筋細胞の細胞分裂と細胞周期の変動を区別するために、私たちは2つのトランスジェニックマウス系統を使用したプロトコルを提示します:Myh6-H2B-mChトランスジェニックマウスは、心筋細胞の核を明確に識別し、CAG-eGFP-アニリンマウスは細胞分裂と細胞周期の変動を区別するためのものです。...

生後心筋細胞における細胞周期変化の可視化と核の決意

ここでは、全体のマウント蛍光マウス初期胚のイメージに基づく定量的容積測定分析のためのプロトコルについて述べる.定性的と定量的開発時に心臓の構造を評価し、他の器官に広く適応可能があることを提案する強力な方法としてこのテクニックを紹介します。...

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

この研究は、マウスの心を研究するのに光クリアと組み合わせて両面イルミネーション ライト シート蛍光顕微鏡 (LSFM)...

マウス心臓の研究のための光シート蛍光顕微鏡

心筋細胞増殖後の傷害は、非筋細胞集団からの細胞外の手がかりの交響を必要とする動的プロセスである。系統トレース、パッシブクラリティ、3次元全型共焦点顕微鏡技術を利用して、様々な細胞タイプが心臓修復および再生に及ぼす影響を分析することができます。...

クリアされた心臓3次元イメージングによる標的細胞集団の心臓損傷応答のキャプチャ

我々は、組織形質転換と染色の新たな進歩と軸走査型ライトシート顕微鏡の開発を組み合わせることにより、マウス心臓全体のメゾスコピック再構成法を報告する。...

マウス心臓全体のメゾスコピック光学イメージング

マウス胚における初期心臓前駆細胞のライブイメージング

このプロトコルは、高度なライトシート顕微鏡法と適応した組織透明化法を利用して、げっ歯類の心臓の複雑な心臓構造を調査し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。...

げっ歯類の心臓の構造を明らかにするためのライトシートイメージング

このプロトコルは、ライトシート蛍光顕微鏡を使用した定量的なホールマウント3次元血管イメージングの迅速な方法を導入します。この方法の有効性は、ニワトリ胚モデルの咽頭アーチ動脈系を使用して実証され、血行動態の力は計算流体力学 によって...

定量的研究のための小動物血管系の迅速なホールマウント高分解能イメージング

学ぶ 組織透明化と全マウント染色を用いた単一細胞解像度の心臓イメージング法。胚および出生後の心臓における遺伝子機能を詳細に解析し、心臓発生の理解を深める比較的簡便で費用対効果の高いプロトコルです。

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

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