計測インビトロ ATPase活性

この手順の全体的な目標は、機能特性評価のために精製タンパク質のin vitro ATPase活性を定量化することです。この方法は、新しい推定ATPアーゼの特性評価、有効な潜在的な活性化因子または阻害剤の評価、およびATPアーゼ活性への特定のドメインまたは残基の寄与の決定に使用できます。この手法の主な利点は、in vitro ATPase活性を測定するためのシンプルで感度の高い方法であり、簡単に最適化できることです。

テキストプロトコールの指示に従って、精製タンパク質とのインキュベーションに必要なすべての試薬のストックを準備します。ATP加水分解反応を設定する直前に、100ミリモルの塩化マグネシウムと100ミリモルのATPを1対1の比率でプレミックスします。反応全体を通して定期的にサンプルを収集するための1.5ミリリットルチューブを準備し、標識します。

だけでなく、15分、30分、45分、60分でもサンプルを採取するチューブを準備します。各チューブに245マイクロリットルの1x HNGバッファーを加えて、ATP加水分解反応から収集したサンプルを1〜50の希釈で希釈します。次に、ドライアイスとエタノールの浴を準備してサンプルを急速凍結し、反応を停止します。

ゴム製のアイスバケツまたはその他の安全な容器に、ドライアイスを数個追加し、ドライアイスを覆うのに十分な70%から100%のエタノールを慎重に注ぎます。精製したタンパク質を1X HNGバッファーで希釈し、氷上に置いてください。準備した0.5ミリリットルのチューブでATP加水分解反応を設定し、事前に計算された量の水を加えて、最終反応量30マイクロリットルに到達します。

続いて、6マイクロリットルの5X HNGまたは他の緩衝液、3マイクロリットルの100ミリモル塩化マグネシウムATP混合物、および0.25〜5マイクロモルのタンパク質が続きます。タンパク質を添加しないネガティブコントロール条件のみのバッファーをインキュベートします。次に、タイムゼロで反応から5マイクロリットルを取り除きます。

次に、245マイクロリットルのHNGバッファーを含む準備した1.5ミリリットルのチューブでアリコート1を50に希釈します。サンプルをドライアイスエタノールバスですぐに凍結します。反応を37°Cでインキュベートし、ATP加水分解を1時間行います。

各間隔で、反応から5マイクロリットルのアリコートを取り除き、以前と同様にHNGバッファーを含む標識サンプルチューブに加えます。ATP加水分解反応の終了時に、希釈したサンプルを摂氏80度の冷凍庫に移して保存します。すべてのサンプルが完全に凍結していることを確認するには、少なくとも10分待ってから続行してください。

各時点のATP加水分解反応アリコートを含む希釈サンプルを室温で解凍します。次に、サンプルとリン酸標準物質を含む96ウェルプレートを調製します。0.5ミリリットルのチューブで、5.5マイクロリットルの標準液を104.5マイクロリットルのHNGバッファーに添加することにより、リン酸塩標準液を800マイクロモルから40マイクロモルに希釈します。

よく混合し、この40マイクロモルリン酸標準試料の100マイクロリットルを96ウェルプレートのウェルA1に加えます。50マイクロリットルのHNGバッファーをウェルB1からH1に加えて、リン酸標準液を1対1の段階希釈液にします。50マイクロリットルの40マイクロモルリン酸をウェルA1から取り出し、ウェルB1の50マイクロリットルのアッセイバッファーに加えて混合します。

次に、B1坑井から50マイクロリットルを取り出し、C1坑井に追加し、G1坑井を通じて希釈を続けます。混合後、G1ウェルから50マイクロリットルを廃棄して、各ウェルの容量が同じになるようにします。H1ウェルには、40マイクロモルからゼロマイクロモルまでのリン酸標準液を作成するためのバッファーのみを含める必要があります。次に、各サンプルの50マイクロリットルをプレートに二重に加えます。

同じ時点のサンプルを縦に列に追加し、異なる時点から水平方向に追加します。これにより、プレートあたり最大8つのサンプルと5つのタイムポイントが可能になります。滅菌ピペットを使用して、サンプルと標準液を含む各ウェルに100マイクロリットルを追加するのに十分な量のマラカイトグリーンメリプテートリン酸検出試薬を取り出します。

検出試薬をディッシュに加えると、マルチチャンネルピペットを使用して簡単にピペッティングできます。検出試薬を直接皿に注がないでください。リン酸塩汚染が発生する可能性があるためです。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに100マイクロリットルのリン酸塩検出試薬を追加し、気泡を導入せずに一定回数ピペッティングして慎重に混合し、最後の時点から最初の時点まで順番に作業します。

プレートを室温で25分間、または製造元の指示に従って放置します。結果を定量するには、吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、650ナノメートルでのサンプルの吸光度を読み取ります。キネティックATPアーゼおよびエンドポイントATPaseの代表的な結果が示されており、野生型および変異型の2型分泌型ATPアーゼ/EPSEの活性は、覚醒剤カルジオリピンの存在下と非存在下で決定されます。

ここに示されているのは、運動学的カルジオリピン刺激ATPaseの結果であり、野生型EPSEと二重リジン変異体、およびウシ血清アルブミンがネガティブコントロールとして機能している時間の経過に伴う線形リン酸塩放出を示しています。これらのデータは、各タンパク質のATPase活性を定量化して比較するために、1分あたりに放出されるリン酸塩の量をタンパク質濃度で割ったものとして表すことができます。このデータは、K417とK419の2つのリジン残基が、EPSEのカルジオリピン刺激ATPase活性に寄与していることを示しています。

カルジオリピン刺激なしで同じタンパク質のATPアーゼ活性を比較すると、これら2つのリジン残基はEPSEの低い基礎活性に寄与するのではなく、カルジオリピンによって刺激されるタンパク質の能力に寄与していることが示されています。このビデオを見れば、精製タンパク質のATPase活性を迅速かつ正確に定量する方法を十分に理解できるはずです。この手順を試行する際には、リン酸塩検出試薬の感度を考慮することが重要です。

リン酸塩汚染を避けるため、使い捨てプラスチック製品と超純水を使用し、タンパク質精製後にサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを実施することをお勧めします。