内イメージングカルシウムショウジョウバエ卵活性化で

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの卵子活性化中のカルシウムを視覚化することです。この方法は、卵子の活性化におけるカルシウムの供給源、ダイナミクス、下流の役割など、発生生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、より高い空間分解能、活性化前の成熟卵子の物理的操作、および受精なしの卵子活性化の役割のテストを可能にすることです。

一般に、この方法に不慣れな個体は、成熟卵子を損傷なく単離し、サンプルを失うことなく成熟卵子に活性化バッファーを適用するのに苦労します。この手順を開始するには、解剖顕微鏡の倍率を4倍に設定します。最初のカバースリップで、卵室に穴を開けないように注意しながら、閉じた鉗子と解剖プローブのペアで卵管を引き裂くことにより、2つの卵巣を分離します。

次に、標準的な解剖プローブを卵巣の中心、閉じた鉗子の隣に挿入します。解剖プローブを卵巣を通して、成熟した卵子が位置する後極に向かってゆっくりと引きずります。成熟した卵子が卵巣の外側のカバーガラスに見えるようになったら、中央に一列に並ぶように3〜5個操作します。

次に、残りの卵巣組織を整列した卵子から引き離して取り除きます。次に、医療用ワイプの角で軽くたたいて余分な油を取り除きます。カバーガラスにマーカーで十字線を描き、顕微鏡下でサンプルの位置を特定します。

その後、準備した卵室をカバーガラスの上に置いて5〜10分間休ませ、卵が油に落ち着くようにします。準備したカバースリップ、室温活性化バッファー、ガラスピペットをイメージング施設に持参してください。成熟卵子全体のイメージングに適した対物レンズを選択します。

次に、最初に準備したカバースリップを顕微鏡ステージに取り付けます。次に、活性化のために成熟した卵室の視野を選択します。標準的なGFPの励起と発光のイメージングパラメータを設定します。

その後、成熟した卵子と変位した油を視覚化して方向付けるために、明るいフィールドビューを設定します。次に、成熟した卵子が見える最も低いZ平面を選択します。そして、40マイクロメートルのフルZスタックを1ステップあたり2マイクロメートルで設定します。

次に、画像を 30 分間キャプチャするように時系列を設定します。この手順では、画像キャプチャを開始し、活性化する前に成熟した卵子を示すために1〜2つの完全なZスタックを取得します。次に、約300マイクロリットルの活性化バッファーをガラスピペットに引き出します。

活性化バッファーの入ったガラスピペットの先端をカバーガラスから45度の角度で置き、ピペットをゆっくりとビーム経路に移動させ、イメージング対象の成熟卵子の真上に来るようにします。5秒未満で1〜2滴の活性化バッファーを追加し、オイルを置換します。1滴から2滴の活性化バッファーの添加は、正しい角度で、穏やかに、そして迅速に行う必要があります。

画像取得中に活性化バッファーを追加する際には、明視野チャネルをチェックして、オイルが変位していることを確認してください。オイルが正常に置換されたら、完了するまで時系列を実行します。集録したデータの投影法を作成するには、セクション全体の開始 Z スライスと停止 Z スライスを選択します。

その後、投影タイプ(最大強度など)を選択します。次に、チェックボックスにチェックを入れます すべての時間枠 選択した設定をシリーズ全体に適用します。画像の明るさとコントラストを調整するには、[画像]、[調整]、[明るさ/コントラスト]の順に選択します。

時系列をムービーとしてエクスポートするには、[ファイル]、[名前を付けて保存]、[AVI] の順に選択します。次に、フレームレートを選択します。ここに示されているのは、活性化バッファーの添加後に遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを発現するex vivo成熟ショウジョウバエの卵の時系列です。

細胞質カルシウムの上昇は後極で発生し、その後、毎秒約1.5マイクロメートルの平均速度で伝播します。波の開始は、通常、活性化バッファの追加から3分以内に観察されます。活性化後、成熟卵子の細胞内カルシウムレベルは回復します。

ショウジョウバエでは、このex vivo活性化アッセイを用いて、カルシウム波とアクチン細胞骨格の共可視化を達成することができます。アクチンは、白い矢印で示されているように、時間とともに変化しているように見えます。成熟卵子の中心でカルシウムシグナルが検出されないのは、画像キャプチャ中のサンプルの動きによるものです。

一度マスターすれば、このテクニック全体は、適切に実行すれば1時間未満で完了します。この手順を試行する際は、卵室を操作するとき、および取得用のパラメーターを設定するときに時間をかけることを忘れないでください。この手順は、卵子の活性化時に他の蛍光標識タンパク質、細胞小器官、またはカルシウムインジケーターを視覚化するために適応させることができます。

これは、カルシウムの供給源と下流の影響に関する疑問に対処するのに役立ちます。