Name: インフルエンザウイルスAおよびBの急速な分子の検出と分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: 学ぶインフルエンザA・Bウイルスの迅速分子検出法。等温増幅と分子ビーコンプローブを用い、15分で結果を得られる臨床診断技術です。鼻咽頭スワブ検体を用いたユーザー操作が可能な検査法を習得できます。

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私たちは、臨床検体の収集に協力してくださったメモリアル・スローン・ケタリングがんセンターの臨床微生物学サービスのスタッフに感謝します。この研究は、MSKCCとAlere Scarborough(SK2013-0262)との間の研究契約によって部分的に支援されました。

倫理声明：左オーバー臨床検体の使用が承認され、メモリアル・スローンケタリングがんセンター施設内倫理委員会のガイドラインに準拠しています。 1.アッセイを実行する前に、 注：インフルエンザAおよびBアッセイは、鼻咽頭スワブ検体のためおよびウイルス輸送媒体に格納された鼻咽頭スワブのために承認されています。スワブは、キットに含まれており、最適なパフォーマンスを得るために使用されるべきです。しかし、レーヨン、発泡体、スワブまたはポリエステル鼻スワブは、鼻スワブサンプルを採取するために使用することができる植毛。 <ol><li>鼻腔スワブサンプルを収集するには、最も目に見える排水を持っているか、それが最も混雑している鼻孔に綿棒を挿入します。抵抗が満たされるまで穏やかに回転すると、鼻孔の中に綿棒を押し、ゆっくりと鼻孔から取り外す前に、鼻腔壁に数回回転させます。綿棒を保管し、ウイルス輸送培地（VTM）の3ミリリットルを含むバイアルでそれらを運びます。 注：approprに注意iate検体採取は、誤った結果を生じ得る不十分な検体収集として払わなければなりません。 注：スワブ検体は、採取後できるだけ早くテストする必要があります。ただし、最大2時間室温で保存するか、または検査が利用可能でない場合、最大24時間、2〜8℃で冷蔵してもよいです。採取直後の標本は、最適な試験性能に最適です。不適切な試料の取り扱い、保管、および/または輸送は、誤った結果をもたらすことができます。 注：予防措置として、このテストを実行する個人が検体を処理するときに普遍的予防策に従うことによって、潜在的に感染性として全ての検体を扱う必要があります。 </li><li>試験前に室温にすべてのサンプルを持参してください。 注：すべての試験成分は、単一の使用のためのものであり、複数のテストを実行するために使用すべきではありません。異なるロット番号のキットの成分を混合しないでください。その有効期限を過ぎキット試薬​​を使用しないでください。 </li><li>カンガルーに青色のサンプル受信機を持参試験前メートル温度。オレンジテストベースを室温に温めすることなくテストすることができます。 </li><li>使用直前まで、箔包装内のすべての試験片を残します。機器の側面にある電源ボタンを押して、機器の電源をオンにします。ユーザーIDと入力し、Enterキーを押します &#39;[OK]を。」 </li></ol> 2.テストの実行<ol><li>テストプロセスを開始するには、機器の画面上に「テストの実行」をタッチします。 「OK。」オンスクリーンキーボードまたはバーコードスキャナとプレスを使用して患者IDを入力してくださいふたを開けて、オレンジのテストベースホルダーにオレンジのテストベースを挿入します。 </li><li>正しいテストが画面に表示されていることを確認し、キーを押し、「OK」。青サンプルレシーバーホルダーにブルーサンプルレシーバーを挿入します。 注：これは正しい動作温度に達するの溶出バッファーを防ぐことができますし、テストのパフォーマンスに影響を与える可能性があるとして、機器に配置する前にサンプル受信機を開けないでください。 </li&gt; <li>サンプル受信機がウォームアップするのを待ちます。機器によってプロンプトが表示されたら、ホイルシールを取り外し、サンプルレシーバーに試験されるべき患者綿棒を配置します。 注：ホイルを取り外すとき、それは場所にとどまることを確実にするためにサンプルレシーバーの端に2本の指を置きます。 </li><li>積極的にあなたは綿棒から試料を取り除く手助けするためにそれを混ぜた側面サンプル受信機に対する綿棒ヘッドを押すと、10秒間液体に綿棒を混ぜます。続行するには押して「OK」。ウイルス輸送媒体に格納された綿棒をテストする場合は、サンプルの受信機に200μlを添加する10秒間VTMをボルテックス。 </li><li>青サンプルレシーバーに白転送カートリッジを押します。オレンジ色のインジケーターが上昇するまでサンプルレシーバーを押し続けます。 </li><li>持ち上げ、テストベースに転送カートリッジを接続します。カートリッジ転送が正しく接続されると、オレンジ色のインジケーターを守って下ります。蓋を閉じて、「テストの完了」まで開きません画面にメッセージが表示されます。 </li></ol> 3.品質管理<ol><li>ホーム画面上の「ファイル名を指定して実行QCテスト」をタッチします。 QCテストを選択し実行します。 「OK」をタッチすると、画面上でのテストを完了するために、プロンプトに従うだけで、テストのために意図されたQCサンプルと一致するようにテストの種類を確認してください。 </li></ol> 4.結果の解釈<ol><li>テストの実行が完了したら、インフルエンザA、B、未知のサブタイプの存在についての解釈で画面上に表示されたテストの結果を観察。無効な結果を得るためにテストを繰り返します。 </li></ol> 5.メンテナンスとクリーニング<ol><li> 70％エタノールまたは10％の漂白剤溶液で毎日楽器と周囲のベンチエリアを清掃してください。きれいに湿った、糸くずの出ない布に洗浄液をスプレーします。楽器に直接ソリューションをかけないでください。 </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Prevention+control+of+seasonal+influenza+with+vaccines.+Recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices--United+States%2C+2013-2014%22">Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014</a>. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).</li>
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<li>Chidlow, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assays+for+rapid+detection+and+identification+of+pandemic+%28H1N1%29+2009+and+seasonal+influenza+A%2FH1%2C+A%2FH3%2C+and+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses.</a> J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).</li>
<li>Bell, J. J., Selvarangan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Alere+I+influenza+A%26B+nucleic+acid+amplification+test+by+use+of+respiratory+specimens+collected+in+viral+transport+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium.</a> J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

インフルエンザウイルスは、罹患率および死亡率の重要な世界的な原因です。インフルエンザの迅速かつ正確な診断は、呼吸シーズン中にインフルエンザの大流行を管理するための主要な鍵の一つです。他の抗原ベースのテストでは、迅速かつ実行するのは簡単です。しかしながら、それらは、低い感度13を有しています。一方、伝統的な分子検査は感度を改善したが、実行し、より多くの費用がかかるために、より経験豊富な研究室の技術者を必要としています。この研究およびプロトコルに記載インフルエンザAおよびBアッセイは、技術は我々が示しインフルエンザウイルスA、Bの検出および分化のための等温増幅に基づいているインフルエンザAとBのためのCLIA-放棄、迅速な分子検査でありますアーカイブ、凍結NPS VTM試料のパネルにインフルエンザAおよびBアッセイの性能を実証するための代表的な結果は、他の分子に基づく呼吸パネルアッセイと比較して評価しました。 <p class="jove_content"&gt; RP試験によって「曖昧な」または「untypeable」であると決定されたサンプルは、インフルエンザAおよびBアッセイによ...

インフルエンザウイルス感染症は、罹患率および死亡率は毎年1、2、3の有意な量を生じさせます。合併症のないインフルエンザは、発熱、筋肉痛、頭痛、および非生産的な咳4、5として憲法と呼吸器症状によって特徴付けられます。高齢者、幼児、免疫不全患者、および基礎となる併存疾患を持つ患者は、肺炎、心筋炎、中枢神経系疾患、または死亡6、7などの重篤な合併症のリスクが高いです。 インフルエンザ感染は、疾患の重症度と長さ8を減らすことができ、症状の発症の48時間以内に抗ウイルス療法の迅速な投与の他の呼吸器ウイルスからユニークです。インフルエンザの迅速な同定もされています不必要な抗生物質9、10の使用を低減することが示さ。また、インフルエンザ感染症の入院患者は、適切な感染制御予防策と孤立した部屋に配置する必要があります。しかし、非インフルエンザウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患は、臨床的にインフルエンザと区別するのが困難な場合があります。この理由のため、インフルエンザのための迅速かつ正確な診断試験は、臨床患者管理のために非常に重要です。 いくつかのアッセイは、インフルエンザウイルスの検出および同定のために利用可能です。彼らは15〜30分11 12内の結果を使用して提供することが簡単であるため、迅速なインフルエンザ抗原検出試験（RIDTs）が広くポイント・オブ・ケア検査として臨床で使用されています。しかし、その感度は、製造業者およびテストされている人口、およびインフルエンザの種類とsubtyに応じて広く（百分の10から80）を変化させますPE 13、14、15。直接蛍光アッセイ（DFAS）はRIDTsよりも優れた感度を提供しますが、処理時間は大きい（〜3時間）であり、熟練した技術者16、17までに完了する必要があります。ウイルス培養は、インフルエンザ診断のゴールドスタンダードとなっており、両方RIDTsとDFAS 18以上の感度が向上しています。しかし、インフルエンザウイルス培養は、患者管理19を助けるには、その有用性を減少させる、完了するために2-14 Dからどこでも取ることができます。最後に、核酸増幅検査（NAAT）がインフルエンザ診断における新たなゴールドスタンダードとして培養技術を交換しました。 NAATは、数時間でインフルエンザを検出するための最大感度を有すると考えられます。しかし、NAATは、最も高価なアッセイであると5を実行するための特殊な装置や技術を必要とします<sアップ&gt;、20、21、22、23、24、25。 ここで説明するインフルエンザAおよびBアッセイは、容易に入手可能である第一CLIA-放棄分子の迅速なインフルエンザ検査です。このアッセイは、分子ビーコンプローブを使用してターゲット検出したインフルエンザ特異的プライマーを用いた等温増幅を使用していますニッキングエンドヌクレアーゼ増幅反応（NEAR）を使用することによって動作します。このアッセイは、BからA型インフルエンザを区別設定し、一つのサンプルを処理するために2分を必要とし、完了するまでに15分の合計が必要です。 ここでは、インフルエンザA＆Bアッセイのためのプロトコルを提示します。また、我々はアーカイブされた鼻咽頭スワブにインフルエンザAの性能およびBアッセイを比較するサンプルデータセット（NPS）を提供するウイルス輸送培地（VTに格納された試験片他の呼吸器病原体パネルアッセイとM）。

<table><tbody><tr><td>Alere i Instrument</td><td>Alere</td><td>NAT-000 (Global), NAT-024 (US)</td><td></td></tr><tr><td>インフルエンザA型 &B 24 Test</td><td>Kit Alere</td><td>425-000 (Global), 425-024 (US)</td><td></td></tr><tr><td>Alere i Barcode Scanner</td><td>Alere</td><td>EQ001001</td><td></td></tr><tr><td>Alere Universal Printer</td><td>Alere</td><td>55115 (Global), alereiprinter&nbsp;(米国)</td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;L 精密ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;l 使い捨てピペットチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウイルス輸送培地</td><td>Remel</td><td>M4-RT</td><td></td></tr></tbody></table>

インフルエンザウイルスaおよびbの急速な分子の検出と分化

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

インフルエンザはヒトにおけるインフルエンザウイルスAおよびBに起因する伝染性の呼吸器疾患であり、毎年の罹患率および死亡率の有意な量を生じさせます。インフルエンザAおよびBアッセイは、最初CLIA-放棄分子の迅速なインフルエンザ検査が利用可能でした。インフルエンザAおよびBテストでは、分子ビーコンプローブを使用してターゲット検出したインフルエンザ特異的プライマーを用いて等温増幅を使用することによって動作します。ここでは、凍結した上でインフルエンザAの性能およびBアッセイは、呼吸器パネルアッセイと比較した試験片のウイルス輸送培地（VTM）に格納された鼻咽頭スワブ（NPS）をアーカイブしました。 インフルエンザAおよびBアッセイの性能は、呼吸パネル基準方法の結果を比較することによって評価しました。総インフルエンザウイルスAのための感度は67.5パーセント（95％CI（CI）、56.6から78.5）だった、特異度は86.9パーセント（CI、71.0から100）でした。インフルエンザウイルスBテストの場合は、感度と特異度は90.2パーセントであった（CI、68.5から100）と、それぞれ98.8パーセント（CI、68.5から100）、。 このシステムは、完全に統合された、閉じた、小さなフットプリントシステム上で実行される任意の他の現在利用可能な分子アッセイと、単純な、ピペット無手順よりも大幅に短い試験時間の利点を有しています。全体として、本研究で評価インフルエンザAおよびBアッセイは、ポイントオブケア迅速インフルエンザ診断検査として機能する可能性を有します。

本研究では、NPS片をNPS片を3mlに提出された2012年12月15日と3月1日、2013年の間にインフルエンザ流行時のメモリアル・スローン・ケタリングがんセンター（MSKCC）でインフルエンザ様症状を呈した入院患者から採取したアーカイブVTMのと研究期間中にインフルエンザA、A-1、A-3、およびBを含む呼吸器ウイルス（RP）のパネルを検出する分子アッセイとの日常的な臨床実習の一環として試験、3675 ​​NPS標本が提出されましたテストのためMSKCC臨床検査へ。これらの試験片、45、425、37、および77のそれぞれのRPで、-1、A-3、A--未subtypable金（Au）、およびBをインフルエンザ陽性と判定されたウィルス。 360陽性検体、インフルエンザサブタイプのそれぞれからの40サンプル、および37金の合計。また、直前または陽性検体のそれぞれの後に研究室に到着した1-2陰性サンプルは、その後のTESTIのために選択しましたインフルエンザAおよびBアッセイを用いてngの。 <p class="jove_content" fo:keep-togeth...

我々は、迅速な分子ベースのインフルエンザAおよびBアッセイを説明します。インフルエンザアッセイは分子ビーコンプローブで標的検出したインフルエンザ特異的プライマーを用いて等温増幅を用いることにより、15分以内に各ターゲットを検出します。インフルエンザAおよびBアッセイは、ユーザーフレンドリーで、実行するために最小限のハンズオン時間を必要としました。

インフルエンザウイルスAおよびBの急速な分子の検出と分化

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

このアッセイの全体的な目標は、呼吸器系を呈する患者のインフルエンザウイルス感染を診断または除外することです。この方法は、呼吸器感染症の主な原因の診断など、臨床診断分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、任命されたケアの現場で使用できる迅速な方法であることです。手順を実演するのは、当研究室の技術者であるSam Kaplanです。鼻腔スワブサンプルを採取するには、スワブを最も目立つ排液がある鼻孔または最も混雑している鼻孔に挿入します。穏やかに回転させて、抵抗が満たされるまで綿棒を鼻孔に押し込み、鼻壁に対して数回回転させてから、ゆっくりと鼻孔から取り出します。その後、綿棒を保管し、3ミリリットルのウイルス輸送培地を含むバイアルに入れて輸送します。次に、テストする前に、サンプルと青色のサンプルレシーバーを室温に戻します。オレンジ色のテストベースは、室温まで温めることなくテストできます。使用直前まで、すべての試験片をホイルに入れたままにしておきます。次に、機器の電源を入れ、ユーザーIDを入力してを押してテストプロセスを開始し、機器画面の[テストの実行]をタッチ OK.To。次に、オンスクリーンキーボードまたはバーコードスキャナーを使用して患者IDを入力し、[OK]を押します。その後、蓋を開けて、オレンジ色のテストベースチューブをオレンジ色のテストベースホルダーに挿入します。正しいテストが画面に表示されていることを確認し、[OK]を押します。次に、青いサンプルレシーバーを青いサンプルレシーバーホルダーに挿入し、サンプルレシーバーがウォームアップするのを待ちます。その後、サンプルレシーバーの端に2本の指を置いて、ホイルシールをはがし、所定の位置に留まるようにします。次に、検査する患者の綿棒をサンプルレシーバーに入れます。綿棒と液体を10秒間激しく混合し、綿棒のヘッドをサンプルレシーバーの側面に押し付けて、試料を綿棒から取り除きます。試験用スワブをウイルス輸送培地に保管している場合は、ウイルス輸送培地を10秒間ボルテックスし、200マイクロリットルをサンプルレシーバーに加えます。次に、[OK]を押して続行します。その後、白いトランスファーカートリッジを青いサンプルレシーバーに押し込みます。オレンジ色のインジケーターが上がるまで、サンプルレシーバーを押し続けます。次に、トランスファーカートリッジを持ち上げてテストベースに接続します。オレンジ色のインジケーターは、カートリッジの転送が正しく取り付けられると下降します。蓋を閉め、結果画面が表示されるまで開かないでください。次に、ホーム画面の[QCテストの実行]をタッチします。実行するQCテストを選択します。次に、OKをクリックし、画面の指示に従ってテストを完了して、テストタイプがテスト対象のQCサンプルと一致することを確認します。テストの実行が完了したら、インフルエンザ A、B、または不明なサブタイプの存在を解釈して画面に表示されたテストの結果を観察し、無効な結果に対してテストを繰り返します。その後、装置と周囲のベンチエリアを70%エタノールまたは10%漂白剤溶液で清掃します。この図は、各インフルエンザサブタイプの陽性サンプルと陰性サンプルについてRPアッセイによって決定された平均CT値を示しています。この結果は、インフルエンザAおよびBアッセイによって決定された偽陰性サンプルが、ウイルス量サンプルが少ないことによるものであることを示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば15分で完了します。この手順を試行する際は、アッセイを最初にセットアップする際に、トランスファーカートリッジをカチッと音がするまでテストベースに接続する必要があることを覚えておくことが重要です。この2つのピースが適切に固定されていないと、実行は失敗し、最初から繰り返す必要があります。このビデオを見れば、インフルエンザの診断アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。インフルエンザに感染した可能性のある患者サンプルを扱うことは非常に危険であり、この手順を実行する際には、適切な個人用保護具を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ampliPHOX比色検出技術は、マイクロアレイの蛍光検出に安価な代替手段として提示されます。光重合に基づいて、ampliPHOXはわずか数分で肉眼で見える固体高分子スポットを生成します。結果はシンプルかつ強力なソフトウェアパッケージと一緒にして撮像し、自動的に解釈されます。...

インフルエンザのためのDNAマイクロアレイ上ampliPHOX比色検出

シンプルなスロットブロット法は、バイオインフォマティクス解析によって同定された彼らの最も保存された配列を標的とする普遍的な抗体を用いてインフルエンザウイルスのヘマグルチニンとノイラミニダーゼの定量化のために開発されました。この革新的なアプローチは、すべてのウイルスのヘマグルチニンとノイラミニダーゼの定量に有用な代替手段を提供することがあります。...

すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ

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野鳥の鳥インフルエンザウイルスの迅速な診断：フィールドのポータブルRRT - PCR及び凍結乾燥試薬の使用

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インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

このビデオは、インフルエンザウイルスAとBを定量するためのアッセイを示しています。このアッセイでは、インフルエンザ特異的プライマーによるニッキングエンドヌクレアーゼ増幅と、分子ビーコンプローブを用いた標的検出を採用しています。...

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定量的マイクロ中和アッセイの最適化

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我々は、異なるウイルス株から250以上の抗原に対して複数の抗体アイソタイプの血清を同時にプローブするために、ニトロセルロースコーティングされたスライドにインフルエンザ抗原を印刷することによって構築されたタンパク質マイクロアレイを使用するためのプロトコルを提示し、したがって、ウイルスサブタイプ間の血清抗体の幅の測定を可能にする。...

インフルエンザ抗原マイクロアレイを用いたウイルスサブタイプにわたる血清抗体の幅を測定

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アシネトバクター・バウマニーの迅速かつ正確な検出を容易にするために、A.

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インフルエンザウイルスAおよびBの急速な分子の検出と分化

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