ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法
2016年9月20日
このプロトコルは、特定の目的の細胞タイプを分離するための、デスチオビオチン、ストレプトアビジン、およびAPTESシステムのカスタマイズ可能な表面機能化について説明しています。さらに、この原稿では、このプロセスのアプリケーション、最適化、および検証について説明します。
このガラス表面官能基化プロセスの全体的な目標は、目的の細胞を穏やかに捕捉し、放出できるようにすることです。この方法は、腫瘍血管新生の分野における重要な疑問に答えるのに役立ち、薬剤耐性を示す細胞バイオマーカーのスクリーニングを可能にします。この手法の主な利点は、事実上あらゆる関心のある細胞タイプに対して完全にカスタマイズ可能であることです。
細胞タイプに特異的な抗体がある限り、その表面をその捕捉に適合させることができます。この方法は、がんの血管新生に関する洞察を得ることができますが、より個別化された治療レジメンの開発には精製サンプルが必要であるため、他の疾患にも適用できる可能性があります。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、デスチオビオチンとアディビンファミリーとの相互作用を利用して、細胞を捕捉するための可逆的な放出メカニズムを開発しようとしていたときでした。
テキストプロトコルに従って酸素プラズママシンでガラス表面を5分間洗浄した後、50マイクロリットルのAPTESと2.45ミリリットルのエタノールを円錐管に組み合わせて、2.5ミリリットルの2%再構成3-アミノプロピルトリエトキシシラン、またはAPTES溶液を調製します。APTES溶液をガラス表面にピペットで移し、表面を覆って室温のプラットフォームシェーカーに50分間置き、APTES層を均一に分散させます。その間に、オーブンを55°Cに予熱し、8ウェルプレートと24ウェルプレートの場合は°C55°Cに、ガラス皿の場合は90°Cに予熱します。
シェーカーからプレートを取り外した後、エタノールを使用して、テキストプロトコルに従ってガラス表面をすすぎます。窒素ガス100%で表面を乾燥させます。次に、8ウェルプレートと24ウェルプレートをオーブンに2時間、ガラス皿をオーブンに1時間入れます。
次に、37.5マイクロリットルのDMSOに1.5ミリグラム/ミリグラムのDSBを混合し、2,462.5マイクロリットルの0.1モルMES緩衝液、pH 6に2,462.5マイクロリットルのEDCを添加することにより、2.5ミリリットルのd-デスチオビオチン、またはDSB溶液を調製します。次に、2 つのソリューションを組み合わせます。15分後、1マイクロリットルのBMEを加えて、DSBとEDCの間の反応を急冷します。
高温のAPTES機能化ガラス表面をオーブンから取り出し、5〜10分間冷まします。ガラス表面にMESバッファーを追加し、ピペットを70度の角度で保持して、先端が直接表面を向かないようにガラス表面をすすぎます。次に、ウェルの角などの固定点からバッファーを排出して引き出します。
次に、MESバッファーを使用してさらに2回すすぎます。ガラス表面にDSB溶液を塗布します。それらをシャーレ内の湿らせたペーパータオルに移し、ディッシュを覆い、冷蔵庫で18〜24時間インキュベー
トします。摂氏4度でのインキュベーション後、このビデオで前述したように、PBSを使用して各ガラス表面を3回すすぎます。次に、ストレプトアビジンまたはSAVストック溶液を0.4ミリグラム/ミリリットルに希釈し、ガラス表面に均一に塗布して薄い層を形成します。ガラスを18〜24時間インキュベートした後、150マイクロリットルのPBSを使用して各表面を3回すすぎます。
次に、ペーパータオルを脱イオン水で濡らし、プレートを囲む14センチメートルのシャーレに平らに置いて、ウェル内の水分を保持します。ペトリ皿をガラス面で覆い、必要になるまで摂氏4度のバイオセーフティレベル1冷蔵庫に入れます。細胞捕捉を行うには、細胞のT175フラスコから培地を吸引します。
次に、PBSを使用して細胞をすすぎ、バッファーを吸引します。フラスコに10ミリリットルの非酵素的リフティング剤(細胞解離溶液など)を加えます。その後、摂氏37度で6分間インキュベートします。
6分後、10ミリリットルの冷たいHBSSを追加して、リフティング剤を希釈します。次に、20マイクロリットルの細胞をピペットで取り、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞懸濁液を500 x g、摂氏4度で5分間遠心分離します。
そして、HBSSを使用して、細胞を1ミリリットルあたり10倍から6番目の細胞に再懸濁します。ピペットを上下に動かして細胞を溶液に再懸濁し、抗体の結合を減少させる可能性のある細胞凝集を減らします。次に、細胞懸濁液を別々の制御溶液と実験溶液に分割します。
ビオチン化抗体をそれぞれの細胞溶液に加え、エンドオーバーエンドミキサーで摂氏4度で30分間インキュベートします。ビデオの前半で示したように、150マイクロリットルのHBSSを使用して、8ウェルプレートで機能性ガラスを3回洗浄します。細胞溶液をウェルに加え、シェーカーの上で氷上で45分間インキュベートします。
その間に、滅菌HBSS中のビオチンの20ミリモル溶液を調製します。次に、インキュベーション後、150マイクロリットルのHBSSを穏やかに使用して、ガラスから細胞溶液を洗い流します。すすぎをさらに2回繰り返した後、各リリースウェルに150μリットルのビオチン溶液を加え、20分間インキュベートして反応を進行させます。
HBSSを使用して細胞を洗浄することにより、非特異的に結合した細胞を回収します。その後、テキストプロトコルに従って蛍光イメージングと分析に進みます。コントロールとしてフラスコ内の生細胞の画像を含めます。
この実験では、MCF7GFP細胞を機能化された表面に曝露し、細胞の60%をHLA-ABC抗体を用いて捕捉しました。20ミリモルビオチンに曝露すると、捕捉された細胞の80%が放出されました。
ここに示すように、MCF7GFP細胞をRAW 264.7細胞と混合すると、RAWマクロファージの50%が捕捉され、その後、20マイクロモルビオチンを添加すると、捕捉されたRAW細胞の80%が放出されました。この図は、ポジティブコントロールのRAWマクロファージが蛍光活性を示さないことを示しています。しかし、ネガティブコントロールMCF7GFP細胞はGFP蛍光陽性です。
過剰な抗体は細胞捕捉を減少させる可能性があるため、抗体濃度はHLA抗体のミリリットルあたり0〜10,000ナノグラムに滴定することによって最適化されました。その結果、理想的な抗体濃度は1ミリリットルあたり100〜1, 000ナノグラムであることが示されました。また、細胞最適化実験では、捕捉できる細胞の理想的な濃度は、10の1倍から5番目の細胞まで、10の1倍から6番目の細胞までであることがわかりました。
一度習得すれば、この技術は3日で、実験時間は6時間未満で完了します(夜間のインキュベーションは含まれません)。この手順を試みる際には、実験中に細胞洗浄物を収集することを忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、フローサイトメトリーなどの他の方法を実行して、目的の細胞がどのような受容体発現レベルを持っているかなどの追加の質問に答えることができます。
その開発後、表面機能化は、生体材料分野の研究者が、さまざまな病気や怪我の患者へのインプラントなど、材料のバイオセーフ統合を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ガラス表面を表面官能基化して目的の細胞を捕捉して放出し、下流の分析を可能にする方法について十分に理解できるはずです。アジ化ナトリウム中で生細胞を扱うことは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、適切なトレーニング、PPE、廃棄などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
このプロトコルは、デスチオビオチン、ストレプタビジン、APTESを使用して特定の細胞タイプを分離するカスタマイズ可能な表面機能化方法を説明しています。これは、細胞の優しい捕捉と放出を可能にし、腫瘍血管新生と薬剤耐性の研究を支援します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 腫瘍学
- バイオテクノロジー
背景
- 腫瘍血管新生を理解することは、がん研究にとって重要です。
- 細胞バイオマーカーは薬剤耐性を示すことができます。
- カスタマイズ可能な方法は、様々な細胞タイプの研究を強化します。
- 可逆的な放出メカニズムは、細胞の捕捉にとって重要です。
研究の目的
- 特定の細胞タイプを分離する手法を開発すること。
- がん生物学と治療に関する洞察を提供すること。
- 個別化医療のためのバイオマーカースクリーニングを容易にすること。
使用した方法
- デスチオビオチンとストレプタビジンによる表面機能化。
- ターゲット細胞タイプに特異的な抗体の使用。
- 捕捉と放出条件の最適化。
- 細胞分離における方法の有効性の検証。
主要な結果
- この方法は、様々な細胞タイプの効果的な捕捉を可能にします。
- 腫瘍における薬剤耐性の研究のためのプラットフォームを提供します。
- カスタマイズ可能な表面により、技術の汎用性が向上します。
- 得られた洞察は、個別化された治療戦略に情報を提供します。
結論
- このプロトコルは、細胞分離に対する斬新なアプローチを提供します。
- がん研究以外の潜在的な応用があります。
- この方法は、個別化医療の進歩に貢献する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in personalized medicine by enabling gentle, reversible isolation of specific cell populations without altering physiological expression. It supports biomarker screening for drug resistance in tumor angiogenesis studies, directly informing target validation and lead identification efforts. The customizable surface functionalization platform enhances reproducibility and scalability for downstream applications in oncology and immunology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through isolation of specific cell types for biomarker analysis.
- Operational Value: Provides a reversible capture-release system that preserves native cellular expression profiles.
- Predictive Value: Supports functional target validation by isolating cells indicative of drug resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified cell populations suitable for downstream screening assays and receptor expression analysis.
- Operational Value: Achieves up to 80% capture efficiency in single-cell mixtures with biotin-mediated gentle release.
- Platform Value: Enables assay standardization through quantifiable surface verification using plate reader and ImageJ analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical studies by providing disease-relevant isolated cells for xenograft and cancer separation models.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies through gentle cell recovery.
- Translational Value: Supports biomarker-aligned screening for personalized treatment regimen development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, enabling isolation of biomarker-positive cell populations for mechanistic and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating cells expressing specific surface markers.
- Screening: Delivers assay-ready purified cells with quantifiable capture and release metrics for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cell capture efficiency and release kinetics via fluorescence imaging and hemocytometer counting.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through application in xenograft models and cancer separation studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to any cell type with available antibody, reducing need for re-optimization across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by minimizing expression artifacts during isolation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized surface functionalization and biotin-mediated release.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling reliable screening of drug resistance biomarkers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in isolated cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, antibody conjugation, and cell handling techniques.
- Depends on access to oxygen plasma equipment, ovens for silanization, and fluorescence imaging systems.
- Necessitates standardization of antibody titration and cell concentration ranges for optimal capture.
- Involves adaptation considerations for different cell types and surface geometries (well plates vs. glass dishes).
- Includes practical limitations such as background signal at low cell concentrations and antibody optimization requirements.
