Name: ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶガラス表面機能化を用いた標的細胞の単離法。デスチオビオチンとストレプトアビジンを活用し、がん血管新生や薬剤耐性バイオマーカーのスクリーニングに応用可能な柔軟な細胞捕獲・放出技術を習得する。

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私たちは、資金援助について、アメリカ癌協会、イリノイ支部(282802)、および国立科学財団CBET(1512598)に感謝します。また、顕微鏡トレーニングを提供してくださったイリノイ大学ベックマン研究所のDianwen Zhang博士にも感謝いたします。最後に、洞察に満ちた議論をしてくれたJared Weddell氏、Stacie Chen氏、Spencer Mamer氏に感謝します。

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<li>De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mRNA+expression+analysis+in+kidney+glomeruli+using+microdissection+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques.</a> Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).</li>
<li>Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+VEGFRs%2C+NRP1%2C+and+PDGFRs+on+Endothelial+Cells+and+Fibroblasts+Reveals+Serum%2C+Intra-Family+Ligand%2C+and+Cross-Family+Ligand+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).</li>
<li>Cheung, L. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+of+captured+cancer+cells+under+flow+acceleration+in+a+bio-functionalized+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel.</a> Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).</li>
<li>Privorotskaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+thermal+lysis+of+cells+using+silicon-diamond+microcantilever+heaters%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters.</a> Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).</li>
<li>Park, K., Akin, D., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capture+and+lysis+of+vaccinia+virus+particles+using+silicon+nano-scale+probe+array%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array.</a> Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).</li>
<li>Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+breast+cancer+and+gastric+cancer+circulating+tumor+cells+by+use+of+an+anti+HER2-based+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device.</a> Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).</li>
<li>Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chip+for+combinatorial+mixing+and+screening+of+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays.</a> Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).</li>
<li>Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+detection+of+cancer+cells+by+utilizing+integrated+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems.</a> Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a.</a> PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+pancreatic+circulating+tumour+cells+implicates+WNT+signalling+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis.</a> Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).</li>
<li>Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%3ECapture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">>Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).</li>
<li>Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-performance+microsystem+for+isolating+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells.</a> Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+cell-to-cell+variation+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors.</a> Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+VEGF+receptors+on+endothelial+cells+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (9), e44791(2012).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

細胞分離技術の改善は、血管生物学19で細胞の再生生物学でのプログラミング、および血管新生シグナル伝達幹、神経科学18における構造と機能の関係に科学的研究をfurthers。実際、初代細胞培養物20（ 例えば 、HUVECを）血管生物学のは、主として細胞分離技術を使用して行われます。細胞の単離は、最近細胞膜受容体3,14,15,19,21の定量的な流れ（qFlow）フローサイトメトリー分析に使用しました。しかしながら、既存の細胞単離方法は、細胞表面受容体のレベルに影響し、人員および試薬の両方に高価です。我々は、これらの欠点を満たす細胞タイプの混合物からの単一細胞型の再現可能な捕獲の穏やかなシステムの構築を可能にする表面機能17に新たな方法を進めてきました。この技術は、cの可能性を可能にする、反復システムに統合することができ特異的抗体を使用して段階的に異なる細胞型をapturing。さらに手順を明確にするために、トラブルシューティングの質問と回答の数は、以下に提供されています： <p class="jove...

現在のベンチトップ細胞分離手法（ 例えば 、蛍光活性化細胞は1ソート、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション2、免疫磁気ビーズ分離1）が準備し、ソートの数時間かかることがあります。これらの大きな時間スケールは、生理学的応答3の代表ではない分析の結果、生理学的応答および発現レベルに影響を与えることができます。システムは、迅速かつ効率的な生物医学的用途のための細胞の単離及び濃縮を改善するために、細胞表面受容体レベルを中断することなく、特定の細胞型を分離することができる必要とされています。したがって、我々のアプローチの理論的根拠は、細胞単離のための穏やかなアプローチを開発することです。 「ラボオンチップ」概念が速く（時間・ツー・分）細胞単離を桁違いの約束を提供し、最も頻繁に表面上に細胞を捕捉し、細胞や細胞内のコンテを解放することを含みます4,5物理的または化学的方法6を通じてNTS。これらのアプローチは、このようなRNA発現9-11、あるいはin vitro培養12,13のための細胞を提供する識別、タンパク質7,8式を識別するなど、いくつかの利点を提供していますが、これらの技術の多くは、このような原因で細胞受容体プロファイリングなどの診断に翻 ​​訳することはできませんそれらの非生理的な環境です。このようなコラゲナーゼなどの酵素リフティング剤もこれらのリフティングエージェントが正確な生理学的データを生成しません使用する細胞受容体の定量化技術を意味し、これらの受容体の量14,15に影響を与えることができます。細胞溶解は、天然の表面受容体との間の差別化を防止し、あらかじめ16を内在したもの。このプロトコルは、細胞単離のための高速かつ穏やかなアプローチを説明しています。

<table><tbody><tr><td>(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)</td><td>Acros Organics</td><td>919-30-2</td><td>2%APTES溶液の製造に使用</td></tr><tr><td>プラズマクリーナー ピコ</td><td>・ディーナー</td><td>モデル1</td><td>表面を洗浄し、PDMSのガラスへの結合を可能にする</td></tr><tr><td>d-デスチオビオチン(DSB)</td><td>シグマ</td><td>D20655</td><td>細胞捕捉表面の放出メカニズムとして使用されます。&nbsp;</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>British Drug Houses(BDH)</td><td>BDH1115-1LP</td><td>DSBを溶液</td></tr><tr><td>1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)</td>に溶解します<td>Thermo-Scientific</td><td>5g:22980 25g:22981</td><td>カルボン酸を活性化し、タンパク質のガラス表面への結合を可能にします。</td></tr><tr><td>コーティングされていない8ウェル培養スライド</td><td>BDファルコン</td><td>24のケース:354118 96のケース:354108</td><td>初期捕捉および放出定量実験などのツァイス蛍光顕微鏡を含む細胞実験に使用</td></tr><tr><td>ガラス底24ウェルプレート</td><td>MatTek</td><td>P24G-0-13-F</td><td>抗体や細胞滴定実験などのプレートリーダーを含む細胞実験に使用</td></tr><tr><td>メルカプトエタノール</td><td>サイエンスラボ</td><td>60-24-2</td><td>EDCとDSBの反応を急冷するために使用</td></tr><tr><td>4-モルフォリノエタンスルホン酸水和物 (MES水和物99%)</td> <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AC172590250</td><td>EDC反応で使用するための0.1M MESバッファーの製造に使用</td></tr><tr><td>精密オーブン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>11-475-153</td><td>PDMSおよびAPTES層の硬化に使用。</td></tr><tr><td>タイトラマックス 1000 シェーカー</td><td>ハイドル</td>フ <td>13-889-420</td><td>APTESが表面に均一に分布するように使用します。</td></tr><tr><td>1x ストレプトアビジン 5 mg [e7105-5mg]</td><td>Proteo Chem</td><td>9013-20-1</td><td>ビオチン結合タンパク質。刺激を引き起こす可能性があります。</td></tr><tr><td>5 cm グラスディッシュ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08748A</td><td>HUVEC研究だけでなく、将来のプロファイリング研究にも使用されます。</td></tr><tr><td>カバー付き14cmシャーレ</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z717231</td><td>機能化されているサンプルを保持し、それらを輸送するために使用されます。</td></tr><tr><td>MCF7-GFP細胞</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR211</td><td>液体窒素に保存</td></tr><tr><td>RAW264.7マウスマクロファージ</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>イリノイ大学のスミス研究室から贈られました。液体窒素で保存されています。</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>室温で 100 ml で保存</td></tr><tr><td>Dulbecco'UIUC</td><td>50003PC</td>の<td>化学科学部で</td>修正されたイーグル培地細胞培地施設<td>サプライヤー:コーニング</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸UIUC25-025-CI</td>の<td>化学科学部の細胞培地施設</td><td></td><td>は、すでに施設によってDMEMに追加されています。サプライヤー:コーニング。</td></tr><tr><td>細胞スクレーパー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-565-58</td><td>小型 23 cm 50パック</td></tr><tr><td>細胞解離液</td><td>コーニング</td><td>MT-25-056CI</td><td>細胞実験で使用するために細胞を非酵素的に持ち上げるために使用されます</td></tr><tr><td>血球計算計</td><td>ハウサー</td><td>02-671-54</td><td>細胞溶液の定量化と捕捉および放出の有効性のために細胞をカウントするために使用されます。</td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>アムレスコ</td><td>58-85-5</td>表面<td>から細胞を放出するために使用されます。</td></tr><tr><td>HBSS</td> レシピ<td>N/A</td><td>から作成</td><td>細胞を懸濁液で生き続けるため、また非特異的結合の洗浄面に使用します。コールドスプリングハーバープロトコルから適応:500&nbsp;ml、4&nbspを使用します。g NaCl, 0.2&nbsp;g KCl, 0.0402&nbsp;g Na2PO4&#8226;7H2O, 0.03&nbsp;g KH2PO4 および 0.5&nbsp;gグルコース。DI水を追加して&nbsp;500ml、ろ過し、冷蔵します。</td></tr><tr><td>HLA-ABC 抗体</td><td>BioLegend</td><td>311402</td><td>MCF7gfp細胞を捕捉するために使用される抗体</td></tr><tr><td>hIgG抗体</td><td>BioLegend</td><td>HP6017</td><td>MCF7gfp細胞を捕捉するために使用される抗体</td></tr><tr><td>MCF7 GFP細胞</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-211</td><td>緑色蛍光タンパク質がトランスフェクションされた管腔性乳がん株。</td></tr><tr><td>各種コニカル</td><td>Thermo-Scientific</td><td>15mL: 12-565-268</td><td>50/15 ml プラスチックコニカル 溶液とアリコートを保管します。</td></tr><tr><td>ミニチューブローテーター(エンドオーバーエンドミキサー)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-450-127</td><td>抗体をインキュベートし、他の細胞溶液を混合するために使用</td></tr><tr><td>Axiovert 200M (蛍光顕微鏡)</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Zeiss Axiovert 200 M 倒立蛍光顕微鏡。</td></tr><tr><td>Zeba脱塩カラム</td><td>Thermo-Scientific</td><td>PI-87770</td><td>ビオチン化キットの使用後に新たにビオチン化抗体を精製するために使用されます。指示書は以下で提供されます: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf</td></tr><tr><td>EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit</td><td>Thermo- Scientific</td><td></td><td>抗体をビオチン化してキャプチャー表面と統合できるようにするために使用されます</td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>BioTek</td><td>Synergy HTX マルチモードリーダー</td><td>滴定実験で蛍光強度を定量的に測定するために使用されます。</td></tr></tbody></table>

ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

個別化医療の採用と進歩に対する制限要因の一つは、患者から患者への表現における個々のニュアンスを調査する診断ツールを開発できないことです。このニッチを埋めるために細胞を分離しようとする現在の方法論は、生理学的発現の混乱をもたらし、分離技術は診断ツールとして役に立たなくなっています。このプロトコルでは、細胞の捕捉と放出のための表面の機能化と最適化について説明します。この官能基化された表面は、ビオチン化抗体とアミノシラン(APTES)、デスチオビオチン、ストレプトアビジンで官能基化されたガラス表面を統合しています。ビオチンの導入により細胞の放出が促進され、表面に捕捉された細胞の回収と精製が可能になります。この放出は、二次部分であるデスチオビオチンを標的とすることで行われ、その結果、はるかに穏やかな放出パラダイムが得られます。このように、過酷な試薬とせん断力が減少するため、細胞発現の変化が減少します。 官能基化された表面は、単一細胞混合物中の細胞の最大80%を捕捉し、デュアルセル混合物では50%の捕捉が実証されています。この技術の異種移植片および癌分離研究への応用が調査されています。プレートリーダーやImageJ分析などの表面検証のための定量化技術についても説明します。

このプロトコルを使用して、我々は、細胞捕捉（ 図3A）とMCF7GFP細胞ならびに生細胞対照（ 図4）の細胞の放出（ 図3C）を示しています。 60％と80％が放出されたとして、我々は（ 図3C）細胞捕獲を定量化しました。私たちは、RAW 264.7マクロファージおよびMCF7GFP細胞の混合物にこのアプローチを拡張すると、RAWマクロファージの50％が捕獲された（ 図3D）およびRAWマクロファージの80％は、20 mMのビオチン（ 図3B）でリリースしました。過剰な抗体は、細胞捕獲を減少させることができるので、我々はHLA抗体の0〜10,000 nMのを滴定を経由して、最適化、および理想的な抗体濃度は100〜1000 mMの抗体（ 図1）の間にあることを確認します。同様に、我々は、細胞の数の下に、値が背景17より...

このプロトコルは、特定の目的の細胞タイプを分離するための、デスチオビオチン、ストレプトアビジン、およびAPTESシステムのカスタマイズ可能な表面機能化について説明しています。さらに、この原稿では、このプロセスのアプリケーション、最適化、および検証について説明します。

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

このガラス表面機能化プロセスの全体的な目的は、目的の細胞を穏やかに捕捉し、遊離させることです。この手法は、腫瘍血管新生の分野における重要な問いへの回答に寄与し、薬剤耐性を示す細胞バイオマーカーのスクリーニングを可能にします。本技術の主な利点は、事実上あらゆる目的の細胞型に合わせて完全にカスタマイズ可能であることです。細胞型に特異的な抗体が存在すれば、その捕捉に合わせて表面を適合させることが可能です。この手法はがんの血管新生に関する知見を提供できるだけでなく、より個別化された治療計画の開発には精製されたサンプルが必要となるため、他の疾患にも応用できる可能性があります。私たちがこの手法を考案したのは、desthiobiotinとadivinファミリーの相互作用を利用して、細胞捕捉のための可逆的な放出メカニズムを開発しようとしていた時でした。テキストプロトコルに従って酸素プラズマ装置でガラス表面を5分間洗浄した後、コニカルチューブに50 µLのAPTESと2.45 mLのエタノールを加えて、2%に再構成した3-Aminopropyl triethoxysilane（APTES溶液）を2.5 mL調製します。ガラス表面にAPTES溶液をピペットで滴下し、表面を覆って室温のプラットフォームシェーカーに50分間置き、APTES層を均一に分布させます。その間に、8ウェルおよび24ウェルプレートの場合は55 °Cに、ガラスディッシュの場合は90 °Cにオーブンを予熱しておきます。シェーカーからプレートを取り出した後、テキストプロトコルに従ってエタノールでガラス表面を洗浄します。100%窒素ガスを用いて、表面を乾燥させます。その後、8ウェルおよび24ウェルプレートをオーブンで2時間、またはガラスディッシュをオーブンで1時間加熱します。次に、1.5 mg/mLのDSBを37.5 µLのDMSOに混合し、さらに5 mg/mLのEDCを2,462.5 µLの0.1 M MES緩衝液（pH 6）に加えることで、2.5 mLのd-Desthiobiotin（DSB）溶液を調製します。その後、これら2つの溶液を混合します。15分後、1 µLのBMEを添加し、DSBとEDCの間の反応を停止させます。加熱したAPTES機能化ガラス表面をオーブンから取り出し、5〜10分間冷却させます。ピペットを70度の角度に保持し、チップが表面に直接向かないようにしながら、MES緩衝液をガラス表面に加えて洗浄します。その後、ウェルの隅などの固定した箇所から緩衝液を排出および吸引します。次に、MES緩衝液を使用してさらに2回すすぎます。ガラス表面にDSB溶液を塗布します。それらをペトリ皿の中の湿ったペーパータオルに移し、皿に蓋をして、冷蔵庫内で18〜24時間インキュベートします。4 °Cでインキュベートした後、このビデオの前半で示したように、PBSを用いて各ガラス表面を3回洗浄します。次に、ストレプトアビジン（SAV）ストック溶液を0.4 mg/mLに希釈し、薄い層が形成されるようにガラス表面に均一に塗布します。ガラスを18〜24時間インキュベートした後、150 µLのPBSを用いて各表面を3回洗浄します。次に、脱イオン水でペーパータオルを湿らせ、14 centimeterのペトリ皿に平らに敷き詰め、ウェルの湿度を維持するためにプレートの周囲に配置します。ペトリ皿をガラス表面で覆い、使用時まで4 degrees Celsiusのバイオセーフティレベル1冷蔵庫で保存します。細胞回収を行うには、T175フラスコから培地を吸引します。次に、PBSを用いて細胞を洗浄し、バッファーを吸引します。Cell Dissociation Solutionなどの非酵素的剥離剤を10 milliliters、フラスコに加えます。その後、37 degrees Celsiusで6分間インキュベートします。6分後、冷えたHBSSを10 milliliters添加してリフト剤を希釈します。次に、細胞懸濁液を20 microliters分ピペッティングし、血球計数計を用いて細胞数を計測します。細胞懸濁液を4 °Cで500 x g、5分間遠心分離します。次に、HBSSを用いて細胞を1×10⁶ cells/mLに再懸濁します。ピペッティングを行い、溶液中で細胞を再懸濁させ、抗体結合を低下させる原因となる細胞の凝集を抑制します。その後、細胞懸濁液をコントロール群と実験群の溶液に分けて分注します。ビオチン化抗体をそれぞれの細胞溶液に加え、エンドオーバーエンドミキサーを用いて4°Cで30分間インキュベートします。ビデオの前半で示した通り、150 µLのHBSSを用いて、8ウェルプレート内の機能化ガラスを3回洗浄します。ウェルに細胞溶液を加え、シェーカーに乗せて氷上で45分間インキュベートします。その間に、滅菌済みHBSSを用いて20 millimolarのビオチン溶液を調製します。その後、インキュベーションが終了したら、150 microlitersのHBSSを用いてガラスから細胞溶液を穏やかに洗い流します。この洗浄操作をさらに2回繰り返した後、各リリースウェルに150 microlitersのビオチン溶液を加え、反応を進行させるため20分間インキュベートします。HBSSを用いて細胞を洗浄し、非特異的に結合した細胞を回収します。その後、テキストプロトコルに従って蛍光イメージングおよび解析を行います。コントロールとして、フラスコ内の生細胞の画像を含めてください。本実験では、MCF7GFP細胞を機能化表面に曝露させた。細胞の60%がHLA-ABC抗体を用いてキャプチャーされた。20 millimolarのビオチンに曝露したところ、キャプチャーされた細胞の80%が放出された。ここに示すように、MCF7GFP細胞をRAW 264.7細胞と混合したところ、RAWマクロファージの50%が捕捉され、その後20 micromolarのビオチンを添加することで、捕捉されたRAW細胞の80%が放出されました。この図は、ポジティブコントロールであるRAWマクロファージに蛍光活性が見られないことを示しています。一方、ネガティブコントロールであるMCF7GFP細胞はGFP蛍光陽性です。抗体の過剰存在は細胞のキャプチャ効率を低下させる可能性があるため、HLA抗体の濃度を0から10,000 ng/mLまで滴定して最適化しました。その結果、最適な抗体濃度は100から1,000 ng/mLの間であることが示されました。さらに、細胞の最適化実験により、キャプチャ可能な細胞の最適濃度は1 × 10⁵から1 × 10⁶個の間であることが判明しました。それ以下の量では、バックグラウンドよりも低くなるためです。この手法に習熟すれば、オーバーナイトのインキュベーション時間を除き、実働の実験時間は6時間未満で、3日間で完了させることができます。本手順を実施する際は、実験中の細胞洗浄液を回収することを忘れないでください。これらの洗浄液から、表面の有効性に関する重要な情報を得ることができます。本手順の後、目的の細胞がどのような受容体発現レベルを有しているかといった追加の疑問を解決するために、フローサイトメトリーなどの他の手法を実施することが可能です。表面機能化の開発により、バイオマテリアル分野の研究者は、さまざまな疾患や外傷に対する患者へのインプラントなど、材料のバイオセーフな統合を探索することが可能になりました。このビデオを視聴することで、標的細胞を捕捉・遊離させ、その後の解析に利用するためのガラス表面の機能化方法について深く理解できるはずです。アジ化ナトリウムを用いて生細胞を扱うことは非常に危険であるため、この手順を行う際は、適切なトレーニング、個人用保護具（PPE）の着用、および廃棄方法などの予防措置を常に講じることを忘れないでください。

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JoVE Journal

Cancer Research

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ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法

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