ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法

このガラス表面機能化プロセスの全体的な目的は、目的の細胞を穏やかに捕捉し、遊離させることです。この手法は、腫瘍血管新生の分野における重要な問いへの回答に寄与し、薬剤耐性を示す細胞バイオマーカーのスクリーニングを可能にします。本技術の主な利点は、事実上あらゆる目的の細胞型に合わせて完全にカスタマイズ可能であることです。

細胞型に特異的な抗体が存在すれば、その捕捉に合わせて表面を適合させることが可能です。この手法はがんの血管新生に関する知見を提供できるだけでなく、より個別化された治療計画の開発には精製されたサンプルが必要となるため、他の疾患にも応用できる可能性があります。私たちがこの手法を考案したのは、desthiobiotinとadivinファミリーの相互作用を利用して、細胞捕捉のための可逆的な放出メカニズムを開発しようとしていた時でした。

テキストプロトコルに従って酸素プラズマ装置でガラス表面を5分間洗浄した後、コニカルチューブに50 µLのAPTESと2.45 mLのエタノールを加えて、2%に再構成した3-Aminopropyl triethoxysilane（APTES溶液）を2.5 mL調製します。ガラス表面にAPTES溶液をピペットで滴下し、表面を覆って室温のプラットフォームシェーカーに50分間置き、APTES層を均一に分布させます。その間に、8ウェルおよび24ウェルプレートの場合は55 °Cに、ガラスディッシュの場合は90 °Cにオーブンを予熱しておきます。

シェーカーからプレートを取り出した後、テキストプロトコルに従ってエタノールでガラス表面を洗浄します。100%窒素ガスを用いて、表面を乾燥させます。その後、8ウェルおよび24ウェルプレートをオーブンで2時間、またはガラスディッシュをオーブンで1時間加熱します。

次に、1.5 mg/mLのDSBを37.5 µLのDMSOに混合し、さらに5 mg/mLのEDCを2,462.5 µLの0.1 M MES緩衝液（pH 6）に加えることで、2.5 mLのd-Desthiobiotin（DSB）溶液を調製します。その後、これら2つの溶液を混合します。15分後、1 µLのBMEを添加し、DSBとEDCの間の反応を停止させます。

加熱したAPTES機能化ガラス表面をオーブンから取り出し、5〜10分間冷却させます。ピペットを70度の角度に保持し、チップが表面に直接向かないようにしながら、MES緩衝液をガラス表面に加えて洗浄します。その後、ウェルの隅などの固定した箇所から緩衝液を排出および吸引します。

次に、MES緩衝液を使用してさらに2回すすぎます。ガラス表面にDSB溶液を塗布します。それらをペトリ皿の中の湿ったペーパータオルに移し、皿に蓋をして、冷蔵庫内で18〜24時間インキュベートします。

4 °Cでインキュベートした後、このビデオの前半で示したように、PBSを用いて各ガラス表面を3回洗浄します。次に、ストレプトアビジン（SAV）ストック溶液を0.4 mg/mLに希釈し、薄い層が形成されるようにガラス表面に均一に塗布します。ガラスを18〜24時間インキュベートした後、150 µLのPBSを用いて各表面を3回洗浄します。

次に、脱イオン水でペーパータオルを湿らせ、14 centimeterのペトリ皿に平らに敷き詰め、ウェルの湿度を維持するためにプレートの周囲に配置します。ペトリ皿をガラス表面で覆い、使用時まで4 degrees Celsiusのバイオセーフティレベル1冷蔵庫で保存します。細胞回収を行うには、T175フラスコから培地を吸引します。

次に、PBSを用いて細胞を洗浄し、バッファーを吸引します。Cell Dissociation Solutionなどの非酵素的剥離剤を10 milliliters、フラスコに加えます。その後、37 degrees Celsiusで6分間インキュベートします。

6分後、冷えたHBSSを10 milliliters添加してリフト剤を希釈します。次に、細胞懸濁液を20 microliters分ピペッティングし、血球計数計を用いて細胞数を計測します。細胞懸濁液を4 °Cで500 x g、5分間遠心分離します。

次に、HBSSを用いて細胞を1×10⁶ cells/mLに再懸濁します。ピペッティングを行い、溶液中で細胞を再懸濁させ、抗体結合を低下させる原因となる細胞の凝集を抑制します。その後、細胞懸濁液をコントロール群と実験群の溶液に分けて分注します。

ビオチン化抗体をそれぞれの細胞溶液に加え、エンドオーバーエンドミキサーを用いて4°Cで30分間インキュベートします。ビデオの前半で示した通り、150 µLのHBSSを用いて、8ウェルプレート内の機能化ガラスを3回洗浄します。ウェルに細胞溶液を加え、シェーカーに乗せて氷上で45分間インキュベートします。

その間に、滅菌済みHBSSを用いて20 millimolarのビオチン溶液を調製します。その後、インキュベーションが終了したら、150 microlitersのHBSSを用いてガラスから細胞溶液を穏やかに洗い流します。この洗浄操作をさらに2回繰り返した後、各リリースウェルに150 microlitersのビオチン溶液を加え、反応を進行させるため20分間インキュベートします。

HBSSを用いて細胞を洗浄し、非特異的に結合した細胞を回収します。その後、テキストプロトコルに従って蛍光イメージングおよび解析を行います。コントロールとして、フラスコ内の生細胞の画像を含めてください。

本実験では、MCF7GFP細胞を機能化表面に曝露させた。細胞の60%がHLA-ABC抗体を用いてキャプチャーされた。20 millimolarのビオチンに曝露したところ、キャプチャーされた細胞の80%が放出された。

ここに示すように、MCF7GFP細胞をRAW 264.7細胞と混合したところ、RAWマクロファージの50%が捕捉され、その後20 micromolarのビオチンを添加することで、捕捉されたRAW細胞の80%が放出されました。この図は、ポジティブコントロールであるRAWマクロファージに蛍光活性が見られないことを示しています。一方、ネガティブコントロールであるMCF7GFP細胞はGFP蛍光陽性です。

抗体の過剰存在は細胞のキャプチャ効率を低下させる可能性があるため、HLA抗体の濃度を0から10,000 ng/mLまで滴定して最適化しました。その結果、最適な抗体濃度は100から1,000 ng/mLの間であることが示されました。さらに、細胞の最適化実験により、キャプチャ可能な細胞の最適濃度は1 × 10⁵から1 × 10⁶個の間であることが判明しました。それ以下の量では、バックグラウンドよりも低くなるためです。

この手法に習熟すれば、オーバーナイトのインキュベーション時間を除き、実働の実験時間は6時間未満で、3日間で完了させることができます。本手順を実施する際は、実験中の細胞洗浄液を回収することを忘れないでください。これらの洗浄液から、表面の有効性に関する重要な情報を得ることができます。本手順の後、目的の細胞がどのような受容体発現レベルを有しているかといった追加の疑問を解決するために、フローサイトメトリーなどの他の手法を実施することが可能です。

表面機能化の開発により、バイオマテリアル分野の研究者は、さまざまな疾患や外傷に対する患者へのインプラントなど、材料のバイオセーフな統合を探索することが可能になりました。このビデオを視聴することで、標的細胞を捕捉・遊離させ、その後の解析に利用するためのガラス表面の機能化方法について深く理解できるはずです。アジ化ナトリウムを用いて生細胞を扱うことは非常に危険であるため、この手順を行う際は、適切なトレーニング、個人用保護具（PPE）の着用、および廃棄方法などの予防措置を常に講じることを忘れないでください。