Name: 癌細胞の浸潤や衛星腫瘍形成を探検するための三次元培養アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶ コラーゲンとフィブリンゲルを用いた3次元培養アッセイで、がん細胞の浸潤性と衛星腫瘍形成を観察する方法。細胞外マトリックス濃度を調整し、がん進行メカニズムの研究に活用できます。

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仕事は、Prostate Cancer Canada（SGおよびCJDへの助成金#D2014-4)およびカナダ衛生研究所））(SGへの助成金#MOP-111069)によって部分的に資金提供されています。編集協力をしてくださったリチャード・プーラン博士と、技術協力をいただいたシャネル・デュポン夫人に感謝いたします。

注：いいえ倫理考慮動物およびヒトの癌細胞​​が購入または親切に私たちに提供されたので。 1.コラーゲンプラグ（擬似原発腫瘍）の作成<ol><li>コラーゲン分散液を準備します。以前に17を報告した 、または購入として私は、ラットの尾の腱（RTT）から型コラーゲンを抽出し、滅菌することができるのいずれか。 （; 5 2分の実行高速設定）均一な混合のために凍結乾燥したRTTコラーゲン（0.02 N酢酸で3.25から3.50 mg / mlで）ブレンダーを使用して分散させます。 </li><li>ハーベスト（トリプシン-EDTA、通常）とは、血球計数器を使用して生細胞をカウントするためのトリパンブルー排除を使用します。所望の細胞密度（プラグあたり5×10 4細胞）に調整します。 </li><li>無菌条件下で別々に全ての溶液（NaOHを、ウシ胎児血清、DMEM 5倍、 炭酸水素ナトリウム）（ 表1）を準備し、氷上で冷やしておきます。注：種々の溶液の添加の順序は、細胞内の浸透圧または酸性ショックを防止することが重要です。 </li><li>可能な限り迅速に最終コラーゲン溶液（5ミリリットル）に細胞分散（1.25×10 6細胞）を実行します。気泡を避けながら（上下にピペッティングすることによって）十分に混合し、その後すぐに96ウェルプレートの各ウェルにすぐに使用できる溶液200μlを分配します。穏やかに気泡を除去するために、ウェルの内部に均一に溶液を広げるために、細胞培養フードの作業領域表面上のマルチウェルプレートに衝突します。 </li><li> （このステップは96ウェルプレート当たり約15〜20分かかります）すべてのウェルを充填した後、インキュベーターに格納します。 </li><li>一晩に2時間から37℃でプレートをインキュベートします。コラーゲンゲル化（ すなわち 、原線維）は30分以内に起こります。一晩のインキュベーションを行うために培養し（100μl/ウェル）、培地を追加します。 </li></ol>フィブリンゲルの2第一層<ol><li>フィブリノーゲン溶液の調製。 注：フィブリンゲルの同じバッチは、理想的には、より再現resulのために使用されるべきですフィブリンゲル形成などのTSは、商業的な凍結乾燥フィブリノーゲンの異なるバッチ間で変化してもよいです。 <ol><li>常に新たに調製したフィブリノゲン溶液を使用します。水和物結晶の形成を回避するために、バイアルを開く前に室温に凍結乾燥したフィブリノーゲンを持参してください。 </li><li>徐々に（最低限必要な最終容量の15％超過を調製考える3 mg / mlでの作業濃度での Ca 2+ / Mgの2+ハンクス平衡塩溶液（HBSSに）予め温めた（37℃）でフィブリノゲンを溶解： 例えば 、5ミリリットルソリューションの5.75ミリリットルで17.25 mg）を。 <ol><li>フィブリノゲン断片を可溶化するために最初に予め温めたHBSSの滴下を追加します。ビーカー内のへらでより大きなフラグメントを打破します。混合を容易にするために、随時ビーカーを攪拌します。手順中の攪拌プレートを使用しないでください。サスペンションの上下にピペッティングすることによって、残りの粉末を溶かします。 </li></ol></li><li> steriながら生ぬるいフィブリノゲン溶液を保ちます0.22μmのフィルターを通すことにより、溶液をlizing。注：HBSSが十分に暖かいではないか、フィブリノゲンが完全に溶解していない場合は、解決策は、フィルターを詰まらせることがあります。該当する場合は、フィブリノーゲン濃度を低下させ、ひいてはフィブリン血餅剛性もよく、一度か二度フィルターを交換してください。 </li><li>別の方法として、その最終的な音量を調整しながら、すぐに使用できるフィブリノーゲン溶液に、目的とする細胞（ 例えば 、内皮細胞）をサスペンド。 </li></ol></li><li>トロンビン溶液を準備します。 <ol><li> ddH 2 O（50 NIH単位/ ml）の原液を調製し、その後、0.22μmのフィルターを使用して滅菌します。 </li><li>フィブリンゲルを生成するために0.0075（V / V）：フィブリノーゲン/トロンビン比≥1使用。 </li></ol></li><li>フィブリンゲルを生成します。 <ol><li>無菌フィブリノゲンを維持し、すべての次のステップの間、氷上でストック溶液をトロンビン。フィブリンゲルは、24ウェルプレート中に形成させました。 </li><li>速やかにオーバーレイ番目フィブリノゲン溶液（200μL/ウェル）で各ウェルのE面の気泡の形成を回避しつつ。一度に6ウエルを処理します。 </li><li>フィブリノゲン溶液は、完全に、ウェルの表面を覆って、45°の角度でプレートを傾け、ウェルの中心にトロンビンをドロップすることにより、第1のウェルにトロンビン溶液の1.5μlを添加し、その後緩やかにするために、水平プレートを旋回したら1-2秒。 <ol><li>層流フード（5〜10分）、ゲル化/凝固プロセスが完了するまで下に安定した位置にプレートを残す（NB：重合プロセスは、インキュベーターにプレートを輸送することにより、 例えば 、邪魔してはいけません）。 </li></ol></li><li>最初の6ウェルを重合した後、全てのウェルが処理されるまで、次の6ウェルについて同じ配列（ すなわち 3前の手順）を繰り返します。 </li></ol></li></ol>フィブリンゲルとに挟まれたコラーゲンプラグの3第2層<ol><li>オプションA：（すぐにコラーゲンプラグを使用）。 <ol><li>フィブリンゲルの第1層は微妙にプレートを傾けることによって、すべてのウェル中で重合していることを確認します。コラーゲンプラグの移動を容易にする（フィブリンゲルを含む）を24ウェルプレートで並んでコラーゲンゲルプラグの側面を含む96ウェルプレートを置き。 </li><li>コラーゲンプラグを含むプレートの各ウェルにHBSSの1滴を追加します。 </li><li>薄い（ハンドルとして使用）、注射器に取り付けられた針または（ビデオを見る）マイク​​ロスプーンを使用してウェルから各コラーゲンプラグを取り外します。コラーゲンプラグがウェルにセンタリングされ、その無菌性が良好に維持されていることを確認しながら、1または2つのマイクロスプーンを使用して第1のフィブリンゲル層の上に、各コラーゲンプラグを転送します。 </li><li>フィブリノゲン溶液の第二の層と、以前に形成されたフィブリンゲルをオーバーレイ（300μL/ウェル）、2.3で説明したようにトロンビンを導入し、最小限の1を維持：一度に0.0075比と6ウェルのシーケンスを&lt;/李&gt; </ol></li><li>オプションB（成長因子低減基底膜（GFRBM）の薄層でコラーゲンプラグをコーティング）。 <ol><li>事前にすべての準備ソリューションや楽器を冷却し、GFRBMの凍結アリコートを解凍中に過度の加熱速度に非常に敏感であるため、取り扱い時に（ 例えば 、ピペット、チップ、試験管）4℃または氷上で保管してください（メーカーの指示に従ってください） 。 </li><li>プレートのウェルから除去した後、純粋なGRFBM溶液100μlを含む氷上で1.5 mlの遠心管中で2分間、各コラーゲンプラグを浸します。 </li><li>前述したように、それは、よく中心で確保しつつ、第1のフィブリン層の上にそれぞれコーティングされたプラグを転送します。 GRFBMがゲルを形成することができるように5分間37℃で、プラグを含むプレートをインキュベート。ステップ3.1.4でのように、第2のフィブリン層を追加します。 </li></ol></li></ol> 4.細胞培養培地条件<ol><li> 4（培養液で各ウェルを充填00μl）を。培地および補充物は、細胞株および実験条件に基づいて選択されます。 </li><li> 100カリクレイン阻害剤単位（KIU）/ mlの最終濃度で培養培地へのアプロチニン、抗線維素溶解剤を追加します。 注：試験した細胞株に使用される条件の下で細胞培養インキュベーターでプレートを保管してください。 </li><li>一日おきに新鮮な培地で培養液を補充するか、実験的なスケジュールに従って、およびアプロチニンを追加します。新鮮な培地を追加する前に、わずかに（30-35°の角度で）プレートを傾け、慎重に一定の観察下に馴化培地を吸引しながら、ウェルの側面にピペットを傾け。 </li></ol>

<ol><li>Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+review%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">Metastasis review: from bench to bedside.</a> Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).</li>
<li>Roudsari, L. C., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+influence+of+angiogenesis+in+in+vitro+cancer+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2016).</li>
<li>Bill, R., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+EMT+in+breast+cancer+metastasis%3A+Correlation+or+causality%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Three-Dimensional+%283D%29+Models+in+Cancer+Research%3A+an+Update%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Obenauf, A. C., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+at+a+Distance+Organ-Specific+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis.</a> Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).</li>
<li>Sykes, J. A. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSykes%2C+JA+%22Human+Tumor+Cells+In+Vitro%22">Human Tumor Cells In Vitro</a>. Fogh, J. 1, Chapter 1 1-22 (1975).</li>
<li>Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Prostate+Epithelial+Morphogenesis+in+Response+to+Stroma+and+Three-Dimensional+Matrigel+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture.</a> Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+Oncogenesis+of+MCF-10A+Mammary+Epithelial+Acini+Grown+In+Three-Dimensional+Basement+Membrane+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Shaw, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell invasion assays.</a> Methods Mol. Biol. 294, 97-105 (2005).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Dynamic+Reciprocity%3A+Engineering+Three-Dimensional+Culture+Models+of+Breast+Architecture%2C+Function%2C+and+Neoplastic+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).</li>
<li>Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Spheroid+Cultures+of+Human+Prostate+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines.</a> Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).</li>
<li>Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Collagen-Based+Multicellular+Tumor+Spheroid+Model+for+Evaluation+of+the+Efficiency+of+Nanoparticle+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Artif.+Cells+Nanomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery.</a> Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).</li>
<li>Neto, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Hanging+Spherical+Drop+System+for+the+Generation+of+Cellular+Spheroids+and+High+Throughput+Combinatorial+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening.</a> Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).</li>
<li>Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Fibroblasts+are+Required+for+PC-3+Human+Prostate+Cancer+Cells+to+Produce+Capillary-like+Formation+of+Endothelial+Cells+in+a+Three-dimensional+Co-culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System.</a> Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).</li>
<li>Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Culture+System+as+a+Model+for+Studying+Cancer+Cell+Invasion+Capacity+and+Anticancer+Drug+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity.</a> Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).</li>
<li>Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+shRNA+Screen+Identifies+GAS1+as+a+Novel+Melanoma+Metastasis+Suppressor+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene.</a> Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+Of+Ready-To-Use%2C+Storable+And+Reconstituted+Type+I+Collagen+From+Rat+Tail+Tendon+For+Tissue+Engineering+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Human+Lung+Cancer-associated+Fibroblasts+in+Three-dimensional+In+Vitro+Co-culture+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model.</a> Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).</li>
<li>Banyard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genes+Regulating+Migration+and+Invasion+Using+a+New+Model+of+Metastatic+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer.</a> BMC Cancer. 30 (14), 387(2014).</li>
<li>Palumbo, J. S., Degen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+Tumor+Cell+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis.</a> Haemostasis. 31, Suppl. 1 11-15 (2001).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Stroma%2C+Tumor+Blood+Vessels%2C+and+Antiangiogenesis+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy.</a> Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).</li>
<li>Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Hypoxia+as+a+Driving+Force+in+Genetic+Instability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Integr%22%5BJournal%5D)">Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability.</a> Genome Integr. 4 (1), 5(2013).</li>
<li>Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+Relevant+In+Vitro+Tumor+Models+for+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li>
<li>Longati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Pancreatic+Carcinoma+Spheroids+Induce+a+Matrix-rich%2C+Chemoresistant+Phenotype+Offering+a+Better+Model+for+Drug+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing.</a> BMC Cancer. 13 (95), (2013).</li>
<li>Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Spatial+Configuration+of+Tumour+Cells+Confers+Resistance+to+Chemotherapy+Independent+of+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li>
<li>Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Cytotoxicity+of+Human+MCF-7+and+MDA-MB+231+Breast+Cancer+Cells+is+Altered+by+Osteoblast-Derived+Growth+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors.</a> Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).</li>
<li>Lang, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+Response+of+Cell+Invasion+to+Matrix+Stiffness+in+Three-Dimensional+Biopolymer+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks.</a> Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).</li>
</ol>

著者は開示していません。

重要な技術脚注として、ギャップは、中枢および末梢ゲルとの間の界面に存在しないことが必須です。それ以外の場合は、フィブリンゲルに侵入/移行する細胞の能力を低下させる可能性があります。トロンビンは、適切に希釈されていない場合、コラーゲンとフィブリンゲルとの間の空間は、培養の最初の24時間の間に形成してもよいです。試験した細胞株は、それによって両方のゲルの間に形成するために、比較的大きなスペースを引き起こし、培養中に収縮したコラーゲンゲルを導くかもしれないことも可能です。これは、間質細胞は、筋線維芽細胞様活性18による癌細胞と共にコラーゲンゲル内で混合される場合に特に期待されている。このアーチファクトを回避するために、コラーゲンプラグはより長い期間、37℃でインキュベートされるべきである（≥48時間）フィブリンサンドイッチを組み立てる前に、ゲルの収縮を誘導します。 また、アッセイで遭遇する問題は存在でありますフィブリン原線維または凝集体の識別可能。これは、癌細胞の遊走経路の摂動にデータの解釈を複雑にフィブリンゲルに曇っの代わりに半透...

癌細胞の浸潤/遊走およびその後の転移の確立の基本的および生物医学的特性を調査することは熱心な研究1,2の主題です。転移は、がんの究極の段階であり、その臨床管理はとらえどころのないままになります。細胞および分子レベルでの転移のより良い理解は、より効率的な治療法3の開発を可能にします。 転移性細胞のいくつかの特性は、それらの幹細胞性と移行し、内と原発腫瘍5から侵入する遷移状態（ 例えば 、類上皮間葉移行）を取得する可能性を含む試験管 4 で検討することができます。それは事実上の血液/リンパ循環の寄与を除外しかし、浸潤/転移過程のin vitro評価は、課題でした。コラーゲンゲルに腫瘍断片を埋め込む器官培養物previou有しますずる癌の攻撃性をモニターするために使用されて。腫瘍の複雑さ（ 例えば 、非癌性細胞の存在）を保持しているが、腫瘍断片を、制限された培地の拡散にさらされている、サンプリング変化、および間質細胞6の異常増殖です。別の方法は、三次元（3D）細胞環境を模倣する細胞外マトリックス（ECM）の構成要素内の癌細胞を成長させることにあります。コラーゲンゲルおよび/または基底膜由来のマトリックス中の乳癌細胞株の増殖は、3次元細胞培養物の最もよく特徴づけ実施例の中です。特定の三次元細胞培養環境を使用して、標準的な条件下で増殖させた乳癌細胞について観察された無秩序なアセンブリは、乳腺腺房と管状構造7-10の自発的形成を逆転させることができます。また、腺癌細胞由来の多腫瘍スフェロイドの形成は、（別の技術を使用して集まっ例えば、滴、浮遊スフェロイド、寒天埋め込 ​​み）を吊りは現在最も一般的に使用される三次元細胞培養アッセイ11-13を構成しています。しかし、このアッセイは、スフェロイドを形成することができる癌細胞株の制限されたセットによってこれらの条件で細胞を研究するために利用可能な短い期間によって制限されます。 この視覚化技術では、我々は、本明細書中に関心の癌細胞は、代わりに基底膜由来のマトリックスで被覆することができる擬似原発腫瘍のインビトロ形成を可能にするために、コラーゲンゲル中に包埋された洗練された三次元細胞培養アッセイ法を導入します。一旦形成されると、擬似原発腫瘍はその後、癌細胞は、2つの行列の区画との間の界面を横断することを可能にする無細胞マトリックス（ここでフィブリンゲル）に挟まれている（ 図1参照）。興味深いことに、攻撃的な癌細胞と共に擬似原発腫瘍に由来する二次性腫瘍のような構造は、で表示されフィブリンゲル。このような三次元培養系は、例えば、抗癌剤、遺伝子発現および細胞-細胞および/ ​​または細胞-ECM相互作用14-16、調査に必要な柔軟性を提供します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig1.jpg" /> 図1： メソッドの概要癌研究のためのモデルとして、3D細胞培養系を生成するための方法の概略要約<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54322/54322fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr>ラット尾腱由来の<td>凍結乾燥コラーゲン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7661</td><td>(可溶性分散液)または自家製(Rajan et al., ref.#14)</td></tr><tr><td>フィブリノーゲン(凍結乾燥)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F8630</td><td>Type I-S, 65 - 85% protein with &ge; 75% of protein is clottable</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>EMD Chemicals Inc.</td> (英語)<td>605157</td><td>&nbsp;ニュージャージー州ギブスタウン;NIH単位/mg乾燥重量&nbsp;</td></tr><tr><td>成長因子減少マトリゲル&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>356234</td><td>以前はBDバイオサイエンスの</td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279から&nbsp;</td><td>&nbsp;5 - 10T IU/ml の溶液 (トリプシン阻害剤ユニット)&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;マイクロスプーン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>2140115</td><td>フィッシャーブランド ハンディホールド マイクロスパチュラ</td></tr><tr><td>96 ウェル プレート、ラウンド ベース</td><td>Sarstedt</td><td>3925500</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル プレート</td><td>Sarstedt</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle's Medium</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>D5546</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>VWR</td><td>CAA15-701</td><td>FBS、カナダ産。</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>シグマケミカル株式会社</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>ハンク'平衡塩溶液&nbsp;</td><td>シグマケミカル(株)</td><td>H8264</td><td>HBSSの</td></tr></tbody></table>

癌細胞の浸潤や衛星腫瘍形成を探検するための三次元培養アッセイ

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

単層での哺乳動物細胞の培養は、広く様々な生理学的および分子プロセスを研究するために使用されます。しかし、成長細胞を研究するために、このアプローチは、多くの場合、不要なアーティファクトを生成します。したがって、多くの場合、細胞外マトリックス成 ​​分を用いた3次元（3D）環境内での細胞培養は、によりインビボ組織または臓器において天然にその近い類似に興味深い代替として登場しました。我々は、フィブリンゲルからなる疑似一次macrospherical腫瘍および（ii）の周辺の無細胞区画としてコラーゲンゲル作用に埋め込 ​​まれた癌細胞を含む中心コンパートメント、二つの区画、すなわち（i）を用いて、三次元細胞培養システムを開発しましたすなわち、中心部に使用されるものとは異なる細胞外マトリックス成 ​​分は、ここで癌細胞が遊走する（浸潤フロント）および/ ​​または第二またはサテライト腫瘍を表す微小球腫瘍を形成することができます。末梢コンパートメント内の衛星腫瘍の形成であります著しく、この3D培養系は、ユニークなネイティブの腫瘍細胞の既知の攻撃性または転移性の起源、と相関。この細胞培養アプローチは、癌細胞の浸潤性および運動性、細胞 - 細胞外マトリックス相互作用と抗がん剤の特性を評価する方法としてを評価するために考慮されるかもしれません。

前述したように、この三次元細胞培養アッセイの興味深い特徴は、癌細胞は、隣接するフィブリンゲルにコラーゲンプラグからの移行だけでなく、二次性腫瘍（ 例えば 、衛星腫瘍様構造）を確立することができないだけです。これは、直接、特に長い作動距離コンデンサ（ 図2）を用いて、ゲルの厚さを通って低及び高倍率で倒立位相差顕微鏡を用いて観察することができます。この三次元細胞培養法を用いて、既知の転移細胞の挙動を容易に、異なる実験セットアップ15で繰り返し示されているように、非転移性細胞において見られるものと比較することができます。例えば、多数の衛星腫瘍はごく少数の小さなサテライト腫瘍がそうその非転移性の対応、B16F0細胞株（ 図2を用いて検出することができるが、ランダムに転移性細胞株B16F10を有するフィブリンゲル中に分散していています）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/5432...

がん細胞をコラーゲンゲルに包埋し、その後、無細胞フィブリンゲルに挟み込むことで、浸潤性と衛星腫瘍の形成をモニタリングできる3D培養システムを生成します。

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

本手順の全体的な目的は、コラーゲンを埋め込んだがん細胞をフィブリンゲルでサンドイッチし、転移性腫瘍の浸潤性と形成をモニタリングするための3D培養システムを構築することです。この3Dイメージングシステムは、がん細胞のアポトーシスや遊走における様々な細胞および多くの重要な変異体の研究や、抗がん剤による細胞死の有効性を評価するための新たな手法を提供します。この3D細胞培養モデルの魅力的な特徴は、細胞外マトリックスの濃度を変更したり、3Dシステムの構築に別の細胞外マトリックスを使用したりできる点にあります。手順のデモンストレーションは、私の研究室のリサーチアシスタントであるMarie-France Coteと、私の指導下の大学院生であるAudrey Turcotteが行います。まず、凍結乾燥させたラット尾腱由来のtype one collagenを、高速設定で2分間の混合を5回繰り返し、コラーゲンを均一に分散させます。コラーゲンの組み込みが行われている間に、適切な酵素解離液を用いて目的の腫瘍細胞を回収します。続いて、トリパンブルー排除法により細胞数を計測します。解離した細胞をDMEMで希釈し、プラグ1個あたり50,000 cellsの濃度に調整します。コラーゲンの準備が整ったら、1,250,000個の細胞を速やかにコラーゲン溶液に加え、ピペッティングして細胞を均一に分散させます。直ちに、単一細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに200 µLずつ分注します。分注ごとにプレートを作業台の表面に軽く叩きつけ、気泡を除去して溶液をウェル内に均一に分散させます。すべての細胞を添加した後、プレートを37 °Cのインキュベーターに少なくとも2時間置きます。細胞をオーバーナイトで培養する場合は、最初の2時間経過後に各ウェルに100 µLの培養液を添加してください。最初のフィブリンゲル層を調製するには、水和結晶の形成を防ぐため、バイアルを開ける前に凍結乾燥フィブリンゲンを室温に戻します。次に、フィブリンゲンをガラスビーカーに移し、フィブリンゲン断片を溶解させるため、粉末に37 °CのHBSSを滴下して加えます。次に、スパチュラを用いて大きなタンパク質の塊を砕き、混合を促進させるため、必要に応じて適宜ビーカーを揺らします。懸濁液を数回ピペッティングして残りのタンパク質を溶解させ、22 µmフィルターで溶液をろ過滅菌します。その後、24ウェルプレートの各ウェルの表面に、気泡が入らないように注意しながら、200 µLのフィブリノゲンを直ちにオーバーレイします。すべてのウェルが十分にコーティングされたら、プレートを45度の角度に傾け、1つのウェルの中央にトロンビン溶液を1.5 µL滴下し、プレートを水平方向に1〜2秒間そっと回します。同様の手順でさらに5つのウェルをトロンビンで処理した後、溶液がゲル化するまで、ラミナーフローフード内でプレートを安定した水平な状態に5〜10分間置きます。コラーゲンプラグをすぐに配置するために、プレートを慎重に傾けて、フィブリンゲルが完全に重合していることを確認してください。次に、コラーゲンゲルプラグが入った96ウェルプレートを、フィブリンゲルが入った24ウェルプレートの横に配置し、各コラーゲンプラグのウェルにHBSSを1滴加えます。続いて、マイクロスプーンを用いて、24ウェルプレート内の最初のフィブリンゲル層の各中心に、コラーゲンプラグを1つずつ移します。すべてのプラグを移し終えたら、各ウェルに300 microlitersのフィブリノゲン溶液を加え、続いて、先ほど示した通りに2.25 microlitersのトロンビンを加えます。配置前にコラーゲンプラグを成長因子低減基底膜の薄い層でコーティングするため、各プラグを、100 µLの純粋な成長因子低減基底膜が入った氷上の1.5 mL遠心チューブに移します。2分間浸漬させた後、コーティングされたコラーゲンプラグ1つを各フィブリン層の中央に転送し、37 °Cで5分間インキュベートして成長因子低減基底膜を凝固させます。その後、先ほど示した通りに2層目のフィブリン層を加えます。ゲルの重合が完全に完了したら、各ウェルに適切な培地およびサプリメントを400 microliters充填します。次に、ウェルに抗フィブリン分解剤を添加します。その後、使用する腫瘍細胞株に応じた適切な条件下で3D培養を行います。適切な細胞給餌日に、プレートを30〜35度の角度に傾け、各ウェルの壁に沿ってピペットを斜めに差し込み、ゲルを乱さないように培地を吸引します。その後、各ゲル培養に400 µLの新鮮な細胞培養培地と抗フィブリノリシス剤を添加します。この3D細胞培養アッセイでは、コラーゲンプラグから隣接するフィブリンゲルへのがん細胞の遊走を直接可視化して二次腫瘍を形成させることができ、既知の転移性細胞の挙動を、非転移性または低転移性細胞の挙動と比較することが可能です。例えば、この実験では、転移性細胞株B16 F10を含むフィブリンゲルの至る所に多数のサテライト腫瘍がランダムに分散しましたが、転移能の低いB16 F0細胞株ではサテライト腫瘍は見られませんでした。対照的に、転移能は低いものの局所浸潤能が非常に高いこれらのマウス乳腺癌細胞は、フィブリンゲルのなかへ放射状に広がる遊走前線を形成します。14日間の培養後、乳腺癌細胞は遊走前線から離れ、乳腺構造に酷似した星状の構造を形成します。化学療法剤を用いて、組み込まれたがん細胞に対して試験を行うことができます。この代表的な実験では、化学療法剤によって誘導されたがん細胞のアポトーシスの発生頻度が高まるのに伴い、DNA断片化が増加することが観察されました。習熟すれば、この手法は、初期のコラーゲンプラグのインキュベーション期間に応じて、約6時間で完了させるか、または2日間に分けて行うことができます。この手順を行う際は、中心ゲルと周辺ゲルの界面に隙間が生じないようにすることが重要です。隙間ができると、がん細胞がフィブリンゲルへ浸潤する能力が低下する可能性があるためです。この手順の後、サテライトコロニー、コラーゲンプラグ、またはがん細胞に対して、金属組織学的解析やプロテオミクス解析を行い、目的とする遺伝子やタンパク質の発現差を特定させることができます。本手法の開発により、がん生物学分野の研究者が、さまざまながん細胞株を用いて、遊走、アポトーシス、転移抑制遺伝子の発現、あるいは血管新生などを探索することが可能となりました。このビデオを視聴することで、がん細胞をコラーゲンゲルに埋め込み、さらにフィブリンゲルでサンドイッチする方法を習得し、浸潤性とサテライト腫瘍の形成をモニタリングできるようになります。

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Medicine

医学

定量的形質転換成長因子（TGF）-β誘導性3次元コラーゲンゲル内侵入を測定するアッセイが記載されている。このアッセイでは、乳がんの開発のさまざまな段階を表現する細胞株のMCF10Aシリーズ、を活用しています。このメソッドは、他の細胞株で使用できるように採用することが可能と侵略の他の潜在的な活性化剤または阻害剤を調査するために使用される可能性があります。...

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

このビデオでは、3D基底膜タンパク質マトリックスで乳がん細胞を増殖させる詳細な方法論を提供し、周辺環境への細胞浸潤の評価における3D培養の可能性を例示しています。...

3D培養基底膜アッセイ:3D基底膜タンパク質マトリックス上でがん細胞を培養し、細胞浸潤を研究する

このビデオでは、腫瘍スフェロイドとT細胞の三次元共培養を確立する方法を示します。腫瘍スフェロイドを含むマイクロウェルを有するアガロースキャストを調製し、続いてT細胞を添加する。インキュベーション後、このセットアップにより、制御された3次元環境でT細胞と腫瘍スフェロイドとの相互作用を研究することができます。...

腫瘍スフェロイドにおける浸潤T細胞の三次元共培養モデル

この記事では蛍光さらなる修正と3D細胞培養のライブイメージングの両方に使用することができコラーゲンにラベルを付ける方法を紹介します。また、3D環境で培養された細胞の内因性細胞骨格タンパク質を可視化するために最適化されたプロトコルを提供する。...

3Dで浸潤癌細胞の細胞骨格組織を明らかにする

再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養は、良性乳房のインビボアーキテクチャを再現するために、良性乳房表現型から悪性の表現型を区別するために有用な方法である。重要なことに、このシステムは、他の組織に浸潤癌を研究するために適用することができる。...

三次元文化：乳細胞の悪性形質転換正常対腺房アーキテクチャを研究するためのツール

この資料は、乳癌細胞の浸潤を定量化するための3次元（3D）のアッセイの使用のための詳細な方法論を提供する。具体的には、細胞が侵入したときに発生する膜の完全性の喪失を検査するためにこのようなアッセイ、定量化、およびデータ分析だけでなく、メソッドを設定するために必要な手順を説明します。...

3次元（3D）モデルを用いた乳癌細胞浸潤の定量化

ここでは、多細胞相互作用やがん細胞の挙動の細胞外マトリックス依存性調節を調査するのに役立つ、3次元での共培養のプロトコールを紹介します。この実験モデルでは、ヒトのがん関連線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル上でがん細胞を培養します。...

腫瘍間質相互作用のための三次元共培養モデル

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。...

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

この方法は、スフェロイドから周囲の3Dマトリックスへの癌細胞の浸潤を評価します。 スフェロイドはハンギングドロップ培養法で作製し、基底膜材料とI型コラーゲンからなるマトリックスに包埋します。 その後、スフェロイドからの侵入が監視されます。...

3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

膀胱癌の浸潤を支配するプロセスは、バイオ マーカーと治療開発のための機会を表します。腫瘍の回転楕円体、タイムラプス イメージングと共焦点顕微鏡の...

侵略を勉強し、膀胱癌の治療を評価するための 3次元細胞培養システム

提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。...

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

学ぶ コラーゲンとフィブリンゲルを用いた3次元培養アッセイで、がん細胞の浸潤性と衛星腫瘍形成を観察する方法。細胞外マトリックス濃度を調整し、がん進行メカニズムの研究に活用できます。

癌細胞の浸潤や衛星腫瘍形成を探検するための三次元培養アッセイ

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