培養細胞を加熱して細胞の熱作用を調べるための連続波型ツリウムレーザー

この手順の全体的な目標は、正確な温度と時間制御で培養細胞を加熱することにより、in vitroで熱用量依存的な細胞生物学的応答を研究することです。この方法は、網膜レーザー治療の研究など、温熱療法に対する細胞または組織の応答を調査する分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞の迅速な加熱と加熱時間の正確な制御により、実験中に再現性の高い熱曝露が可能になることです。

この方法は、熱レーザー照射に対する培養網膜色素上皮細胞の応答に関する洞察を提供しますが、がん細胞などの他のモデルにも適用できます。この方法を思いついたのは、メラニンを含む細胞を可視レーザー光で加熱したときでした。しかし、その結果、色素沈着のばらつきにより温度プロファイルが変動しました。

手順を開始するには、ホットプレートを清潔なベンチの上の調整可能な金属製ラボスタンドに置きます。ホットプレートを摂氏39度に設定します。スタンドの水平アームにコア径365μmの0.22NAファイバーを固定します。

金属製のアームをホットプレートの上に置き、ファイバーの先端がホットプレートから12センチメートル上にくるようにスタンドを調整します。1.94マイクロメートルの20ワットのThuliumレーザーと365ナノメートルの1ミリワットの照準ビームをファイバーチップに接続します。直径30mmの培養皿をホットプレートに置きます。

ホットプレートの表面で皿の周囲を注意深くなぞり、皿を取り出します。照準ビームをオンにし、ホットプレートのビームスポットの中心がトレースされた円と一致するまでスタンドを調整します。次に、照準ビームをオフにします。

温度校正手順を開始するには、20ゲージの針の先端をブンゼンバーナーで加熱します。加熱した針先で、直径30mmの培養皿の底近くに90度間隔で4点ずつ穴を開け、直径約300μmの穴を開けます。穴に電気テープを貼ります。

細い針で、各穴を覆うテープに直径約200μmの穴を開けます。培養皿の下側で、穴の各ペアの間に180度間隔で線を引きます。線の交点から開始し、各線に沿って半径方向に3ミリメートルごとにマークして、21の測定ポイントを指定します。

次に、摂氏37度に予熱した新鮮な培地を正確に1.2ミリリットルを皿に入れます。皿に蓋をして、ホットプレートのなぞった円の中に皿をセットします。直径200マイクロメートルの熱電対をレーザー制御コンピューターに接続し、温度校正プロトコルを開きます。

熱電対を皿の穴の1つに挿入して、先端がマークの位置の1つで皿の底にくるようにします。温度は深さによって異なる可能性があるため、熱電対の先端が測定された精度で皿の底に触れているかどうかを確認することは非常に重要です。培地が摂氏37度で安定するのを待ちます。

次に、Thuliumレーザーをオンにし、レーザー出力を希望の開始レベルに設定します。予熱時間が140秒と8秒に設定されていることを確認してから、予熱照射シーケンスを開始します。ビープ音が鳴った140秒後、すぐに培養皿のカバーを外します。

予熱が終了し、10秒間の照射が行われるまで待ちます。その後、すぐに皿を覆います。この方法で21マークの位置の温度を測定します。

この手順を、レーザー出力範囲にまたがる 3 ワットの出力間隔でそれぞれ 3 回実行します。終了したら、ツリウムレーザーをオフにします。温度データをエクスポートして分析します。

実験に先立ち、色素上皮細胞を直径30径の培養皿で培養します。細胞培養物を5%二酸化炭素雰囲気下で摂氏37度に維持し、ライブセルイメージングシステムを使用して確認します。照射の1時間前に、各皿の培地をちょうど1.2ミリリットルの新鮮な培地と交換します。

培養物をインキュベーターに戻します。照射ステーションの準備ができており、ホットプレートが摂氏39度に設定されていることを確認します。照射を開始する準備ができたら、希望の出力でツリウムレーザーを開始します。

実験プロトコルを開き、予熱時間が140秒と8秒に設定されていることを確認します。RPE細胞培養物をホットプレート上のマークされた位置の閉じた皿に入れ、すぐに140秒と8秒の予熱照射シーケンスを開始します。140秒間予熱した後、ディッシュカバーを取り外します。

予熱が終了し、10秒間の照射が行われるまで待ちます。すぐに皿を覆い、7秒待ってから、皿をインキュベーターに戻します。レーザー出力レベルを上げて追加のサンプルを照射します。

終了したら、ツリウムレーザーをオフにします。細胞生存率の評価を開始するには、照射した細胞をPBSで洗浄します。生きたアポトーシス細胞と壊死細胞を分化できるキットを入手してください。

次に、暗い場所で、500マイクロリットルの結合緩衝液と25マイクロリットルのエチジウムホモダイマー-3、FITCアネキシン、およびHoechst 33342を組み合わせます。この染色溶液で細胞を室温で15分間インキュベートします。次に、細胞を1X結合バッファーで2回洗浄します。

結合バッファーをPBSに交換し、DAPI、FITC、およびTRITCフィルターを備えた蛍光顕微鏡のステージに細胞を置きます。顕微鏡の光路を接眼レンズに設定し、DAPIフィルターを選択します。イルミネーションライトをオンにし、4倍の対物レンズで焦点面を見つけます。

顕微鏡カメラへの光路を設定します。顕微鏡イメージングソフトウェアを使用して、画像の中央にピントを合わせます。DAPIフィルターを使用して画像取得のパラメーターを定義します。

フォーカスプロセスと画像取得のセットアップをFITCフィルターとTRITCフィルターで繰り返します。次に、イメージングソフトウェアを使用して、ディッシュ全体に3つのフィルターセットで複数の画像を取得し、それらを培養ディッシュ全体の1つの画像に結合します。分析ソフトウェアを使用して、アポトーシスと細胞死の温度閾値を決定します。

細胞培養皿の中心での最大温度上昇とレーザー出力との間の比例関係は、記載された熱較正手順によって決定されました。次に、細胞培養皿全体の最大温度分布をガウス関数に適合させました。照射後に3つの染色パターンが観察された。

摂氏43度以下の温度にさらされた培養物では、生存率の変化は観察されませんでした。アポトーシスは、47°Cの照射から3時間後に初めて観察されました。細胞死は、摂氏51度以上から3時間以上後に観察されました。

次に、アポトーシスと細胞死の平均閾値温度は、死者領域とアポトーシス領域の測定半径の平均を温度分布を記述するガウス関数に適用することによって決定されました。この手順に従うと、さまざまなレーザープロファイル、スポットサイズ、照射時間など、さまざまな条件下で照射を行うことができます。これは、細胞レベルでの個々の時限温度の原因に関連する問題を理解し、調査するのに役立ちます。

このビデオを見れば、温度と時間を適切に制御しながら細胞培養を加熱する方法を十分に理解できるはずです。これは、さまざまな熱照射条件に対する生物学的応答を研究する可能性に乗る可能性があります。レーザーでの作業は、目や肌に非常に危険を及ぼす可能性があることを忘れないでください。

レーザー照射の安全教育について最新情報を入手してください。この手順を実行するときは、常に適切な安全メガネ、白衣、手袋を着用してください。