Name: in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶ角膜内皮間葉転換のメカニズムをin vitroおよびin vivoモデルで。牛角膜内皮細胞の初代培養とラット角膜凍傷モデルを用いて、角膜再生医療の治療戦略開発に貢献する知見を得ます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、国立台湾大学病院医学研究部第二コアラボのスタッフの技術サポートに感謝します。

すべての手順は、眼科と視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科計算書の研究のための協会に従う本研究で続き、国立台湾大学病院の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 1.単離、初代培養の準備、およびウシのCECの免疫染色<ol><li>地元の食肉処理場から新鮮な牛の目を獲得。 </li><li> 3分間10％w / vのポビドンヨード溶液中で目を消毒。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液でそれらを洗浄します。 </li><li>無菌条件下でのメスやハサミで角膜ボタンを収穫。ピール解剖顕微鏡下でピンセットでデスメ膜は、（本研究では、ウシ目は地元の食肉処理場により摘出していることに注意してください。したがって、最初の研究手順は研究室でpreenucleated目の消毒ありました）。 </li><li>トライの1ミリリットルでデスメ膜をインキュベート37℃で30分間PSIN。 5分間112×gで遠心分離することによってウシのCECを収集します。補充ホルモン上皮培地（SHEM）HEPES緩衝ダルベッコ改変イーグル培地、5％ウシ胎児血清を補充したハムF12培地、0.5％のジメチルスルホキシド、人間の表皮の2 ng / mlでの等量を含有する1mlの細胞を再懸濁成長因子、インスリンの5 mg / mlで、トランスフェリンの5 mg / mlで、セレン5ngの/ mlのコレラ毒素の1ナノモル/ Lのゲンタマイシンを50mg / mlであり、アンフォテリシンBの1.25 mg / mlで</li><li> 6センチメートル皿に細胞（眼あたり約1×10 5細胞）をシード。 SHEM文化それらを。空気中5％のCO 2の雰囲気中、37℃で皿をインキュベートします。 3日ごとに培地を変更します。 </li><li>細胞がコンフルエントに達したとき、PBSでそれらを洗浄し、5分間37℃でトリプシン1mlにそれらをインキュベートします。 5分間、112×gで遠心分離することによって、それらを収集します。 SHEMの1ミリリットル中に細胞ペレットを再懸濁します。 <ol&gt; <li>血球計で細胞をカウントします。 24ウェルプレート中のウェル当たり1×10 4の密度、および文化SHEM中の細胞でカバースライド上の細胞をシード。マリマスタットのEnMT抑制効果を調査するために、培養培地に添加しマリマスタットの10μMとSHEM中で細胞をインキュベートし、3日ごとに培地を変更します。 </li></ol></li><li>室温で30分間、4％パラホルムアルデヒドを250μl、pH7.4で指示された時点で細胞を固定してください。 5分間、0.5％トリトンX-100250μlの透過性。 30分間、10％のウシ血清アルブミンでブロックします。 </li><li> 4℃で一晩アクティブβ-カテニン（ABC）、カタツムリ、およびナメクジに対する一次抗体で細胞をインキュベートします。用いた一次抗体の希釈は1：200。抗体を10mMのPBS、1％w / vのウシ血清アルブミン、および0.09％のw / vアジ化ナトリウムからなる抗体希釈液で希釈します。 </li><li> 15分間、PBSで2回細胞を洗浄し、インキュベート室温で1時間：アレクサフルオロ結合二次抗体（抗体希釈液で100 1）を持つメートル。 </li><li> 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを2μg/ mlの細胞をカバーすることにより細胞核対比、15分間、PBSで2回細胞を洗浄し、取り付け溶液抗退色でそれらをマウント。 </li><li> 20X対物倍率でレーザ走査共焦点顕微鏡を用いて405および488nmでの励起波長での免疫蛍光画像を得ます。 </li></ol> 2.ラット角膜内皮Cryoinjuryモデルと房内注入<ol><li> 2％キシラジン（5.6ミリグラム/キログラム）とチレタミンプラスゾラゼパム（18ミリグラム/キログラム）の筋肉内注射で12週齢の雄性Sprague-Dawleyラットを麻酔。優しく肌のけいれんの不在下で適切な麻酔を確認するために、動物の皮膚をつまみます。 </li><li>眼の痛みや瞬目反射を最小限に抑えるために、各ラットの右眼に0.5％塩酸プロパラカインを一滴を植え付けます。植え付けます角膜の乾燥を防ぐために、左眼にテトラサイクリン軟膏。 </li><li>液体窒素中でステンレススチールプローブ（直径= 3 mm）を冷却します。 30秒間、右眼の角膜中央にステンレス製のプローブを適用します。頻繁に角膜の乾燥を防ぐための処置中に右眼にPBSを植え付けます。 </li><li>すぐcryoinjuryた後、0.1％アトロピンおよび0.3％の硫酸ゲンタマイシンを植え付けると、一日一回毛様体のけいれんに起因する眼の痛みを和らげるために、感染を防ぐために。 <ol><li>手順の後、ヒートランプを使用して温め、そして彼らは、モータ制御を取り戻すまで、15分ごとに、麻酔後にそれらの回復を観察したラットを保ちます。また、回復期間中に角膜の乾燥を防ぐために、右目にテトラサイクリン軟膏を適用します。 </li></ol></li><li> 3日間連続して角膜cryoinjuryを繰り返します。 </li><li>前述のようにラットの眼の前房内にマリマスタットまたはbFGFのを提供するために、ラットを麻酔。一滴を植え付けます眼の痛みや瞬目反射を最小限に抑えるために、右眼に0.5％プロパラカイン塩酸塩。 </li><li>滅菌PBSで眼表面を灌漑。アイリスに上記と平行面でparalimbal透明な角膜で1mlシリンジに取り付けた30 G針を挿入することにより、手術用顕微鏡下で前房穿刺を行います。 </li><li>針のベベルアップを回し、少しいくつかの房水を排出し、眼圧を低下させるために角膜の傷を押し下げます。房内薬剤の0.02ミリリットルを注入します。静かに針引き抜きの間綿棒で針管を圧縮します。 </li><li>手術用顕微鏡下で指示された時点で、外部の目を撮影します。 </li></ol> 3.収穫ラット角膜ボタンと免疫染色<ol><li>ラットを安楽死させるために、安楽死室でそれらを配置し、毎分室容積の10から30パーセントの充填率で100％のCO 2を吹き込みます。以下のためのCO 2注入を維持します呼吸と色あせた目の色の欠如後の追加分。 </li><li>鋭利な刃で角膜輪部でのラットの目を貫通します。角膜輪部に沿って角膜ハサミで角膜をカットします。スライド上の角膜を平ら。角膜が丸まる場合には、追加の半径方向の切開を行います。 </li><li>室温で30分間、4％パラホルムアルデヒドを250μl、pH7.4で角膜を修正しました。 5分間、0.5％トリトンX-100250μlの透過性、及び30分間、10％のウシ血清アルブミンでブロックします。 </li><li> 1の希釈で4℃で一晩ABCに対する一次抗体を用いて角膜をインキュベート：抗体希釈液で200。 15分間、PBSで2回角膜を洗浄し、二次抗体でそれらをインキュベート：1時間室温で（1抗体希釈液中の100）。 4を2μg/ mlの細胞を覆うことによって細胞核を対比染色 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、及び15分間、PBSで細胞を2回洗浄します。 </li><li>退色防止マウントソリューションで角膜をマウントします。オビ20X対物倍率でのレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて405と561 nmでの励起波長での免疫蛍光画像をテイン。 </li></ol>

<ol><li>Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+location+of+the+fluid+pump+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The location of the fluid pump in the cornea.</a> J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).</li>
<li>Joyce, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+capacity+of+the+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Proliferative capacity of the corneal endothelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).</li>
<li>Morishige, N., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bullous+keratopathy+as+a+progressive+disease%3A+evidence+from+clinical+and+laboratory+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies.</a> Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).</li>
<li>Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudophakic+bullous+keratopathy%3A+relationship+with+endothelial+cell+density+and+use+of+a+predictive+cell+loss+model.+A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report.</a> Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).</li>
<li>Wilson, S. E., Lloyd, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+and+its+receptor%2C+basic+fibroblast+growth+factor%2C+transforming+growth+factor+beta-1%2C+and+interleukin-1+alpha+messenger+RNA+production+in+human+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).</li>
<li>Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta2+in+aqueous+humor+suppresses+S-phase+entry+in+cultured+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).</li>
<li>Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDTA%3A+a+promoter+of+proliferation+in+human+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).</li>
<li>Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+corneal+endothelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Growth of human corneal endothelial cells in culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).</li>
<li>Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+endothelial+cell+expansion+for+corneal+endothelium+transplantation%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview.</a> Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).</li>
<li>Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+expression+in+human+corneal+endothelial+cells+cultured+from+young+and+older+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors.</a> Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).</li>
<li>Ko, M. K., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+FGF-2+on+type+I+collagen+expression+during+endothelial+mesenchymal+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).</li>
<li>Lee, H. T., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-2+induced+reorganization+and+disruption+of+actin+cytoskeleton+through+PI+3-kinase%2C+Rho%2C+and+Cdc42+in+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells.</a> Mol Vis. 9, 624-634 (2003).</li>
<li>Pipparelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+Inhibitor+Enhances+Adhesion+and+Wound+Healing+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells.</a> PloS one. 8 (4), e62095(2013).</li>
<li>Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li>
<li>Jakobiec, F. A., Bhat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrocorneal+membranes%3A+a+comparative+immunohistochemical+analysis+of+keratocytic%2C+endothelial%2C+and+epithelial+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins.</a> Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ZEB1+and+Snail1+in+excessive+production+of+extracellular+matrix+in+Fuchs+endothelial+corneal+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+on+primate+corneal+endothelial+cell+survival+in+vitro+by+a+ROCK+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).</li>
<li>Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+p120+catenin+unlocks+mitotic+block+of+contact-inhibited+human+corneal+endothelial+monolayers+without+disrupting+adherent+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).</li>
<li>Ho, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Matrix+Metalloproteinase+Activity+Reverses+Corneal+Endothelial-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).</li>
<li>Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen+and+fibronectin+synthesis+by+retrocorneal+fibrous+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Signal+Regulates+Corneal+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+Inhibitor+Eye+Drop+Accelerates+Corneal+Endothelium+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).</li>
<li>Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+in+corneal+epithelium+and+blood-retina+barrier%3A+emerging+role+of+transporters+in+ocular+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).</li>
</ol>

著者には、宣言すべき競合する金銭的利益はありません。

CECは、細胞増殖中EnMTを受けるそれらの傾向のために知られています。治療目的のためにEnMTプロセスを抑制するための戦略を開発するには、EnMTメカニズムの完全な理解が必要です。我々はEnMT、 インビトロ培養モデルおよびラット角膜内皮cryoinjuryモデルで 、すなわちウシCECを調査するために2モデルを説明しました。我々の結果は、両方のモデルでEnMTプロセスを実証しました。さらに、マリマスタットのEnMT抑制効果は、これらの2モデルが同じメカニズムを共有することを示唆し、両方のモデルで再現されました。 体外培養モデルにおけるウシCECは、操作のしやすさを提供しています。また、以前の研究17,18で採用インビトロ培養モデルにおけるヒトまたは霊長類CECと比較して、ウシの目が大きく、取得が容易であるため、より多くのCECを用意して。私たちの研究では、地元の食肉処理場から除核された牛の目を獲得しました。そのためFRESの<html>ウシ目の時...

角膜内皮細胞(CEC)は、活発なポンピング1を通じて角膜間質の水分補給状態を調節することにより、角膜の透明度、ひいては視力を維持する上で重要な役割を果たします。ヒトCECの増殖能力が限られているため、細胞数は年齢とともに減少し、損傷後の角膜内皮創傷の修復は通常、細胞の有糸分裂ではなく、細胞の拡大と移動によって達成されます2。CEC数が約500細胞/mm2の閾値を下回ると、角膜間質の脱水状態が維持できなくなり、水疱性角膜症や視力障害につながる3,4。
ヒトCECの限られた増殖能力は、老化細胞における上皮成長因子とその受容体の発現減少5、房水中の抗増殖性TGFβ26、および接触阻害2,7を含むいくつかの要因に起因しています。塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)などの一部の成長因子は、培養されたヒト角膜内皮での増殖を増加させることができますが、培養効率は依然として限定的です8,9。さらに、CECは、ex vivo拡大中に表現型の変化を受けることがあり、これは上皮間葉転換(EMT)10-13に似ている。内皮間葉転換(EnMT)は、細胞結合の不安定化、頂端-基底極性の喪失、細胞骨格の再配列、α平滑筋アクチン発現、およびI型コラーゲン分泌を特徴としています14。これらの特性はすべて、CECの正常な機能を低下させ、組織工学におけるex vivo培養CECの使用を妨げる可能性があります。さらに、EnMTは、フックス角膜内皮ジストロフィーや角膜後膜形成など、いくつかの角膜内皮疾患の病因と関連しています15,16。したがって、EnMTのメカニズムを理解することは、EnMTプロセスの操作に役立ち、CECの再生を促進して適切な機能を可能にする可能性があります。
この研究では、角膜ボタンからウシのCECを分離する方法について説明しました。in vitroでの初代培養では、表現型の変化、β-カテニンの核移行、EMT制御因子のカタツムリとスラッグを含むEnMTプロセスが観察されました。さらに、ラット角膜内皮凍結損傷モデルを用いてin vivoでEnMTを実証する方法について説明しました。これら2つのモデルを用いて、ブロードスペクトラムマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)阻害剤であるmarimastatがEnMTプロセスを抑制できることを実証しました。記載されているプロトコルは、EnMTメカニズムの詳細な分析と、さらなる臨床応用のためのEnMTプロセスを操作するための戦略の開発を容易にします。

<table><tbody><tr><td>トリプシン</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'S modified Eagle medium and Ham's F12 medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>ヒト上皮成長因子</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>インスリン、トランスフェリン、セレン&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>コレラ毒素</td><td>シグマ</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>111219</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ</td><td>T8787&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td></td><td>Σ A7906</td><td></td></tr><tr><td>マリマスタット</td><td>Σ</td><td>M2699-25MG</td><td></td></tr><tr><td>抗活性β-カテニン抗体</td><td>ミルポア</td><td>05-665</td><td></td></tr><tr><td>抗カタツムリ抗体</td><td>サンタクルス</td><td>sc28199</td><td></td></tr><tr><td>抗ナメクジ抗体</td><td>サンタクルス</td><td>sc15391</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗マウスIgG(H + L)二次</td><td>ウシCECのABC染色用</td>抗体サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11001</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG(H + L)二次抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11003</td>ラット<td>角膜内皮ヤ</td></tr><tr><td>ギ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体</td>のABC染色用サーモ<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11008</td>ウ<td>シCECのカタツムリとナメクジの染色用</td></tr>抗体<tr><td>希釈剤</td><td>Genemedバイオテクノロジー</td><td>10-0001</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>封入剤</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン&nbsp;</td><td>バイエル</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>タイルタミンとゾラゼパム</td><td>ビルバック</td><td>N/A</td><td>動物用医薬品</td></tr><tr><td>プロパラカイン 塩酸塩 眼科用溶液</td><td>アルコン</td><td>N/A</td><td>動物用医薬品</td></tr><tr><td>0.1% アトロピン</td><td>Wu-Fu Laboratories Co., Ltd</td><td>N/A</td><td>臨床薬&nbsp;</td></tr><tr><td>0.3%ゲンタマイシン硫酸塩</td><td>シンファーグループ</td><td>N / A</td><td>臨床薬&nbsp;</td></tr><tr><td>基本的な線維芽細胞増殖因子</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PHG0024</td><td>臨床薬&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

角膜内皮細胞(CEC)は、活発なポンピングを通じて角膜の透明度を維持する上で重要な役割を果たします。CEC数の減少は、角膜浮腫や視力の低下につながる可能性があります。.しかし、ヒトCECは増殖能力が損なわれやすい傾向があります。さらに、細胞増殖の刺激は、漸進的な内皮間葉転換(EnMT)によってしばしば複雑になります。したがって、EnMTのメカニズムを理解することは、適切な機能を持つCECの再生を促進するために必要です。本研究では、角膜ボタンからDescemet膜でCECを剥離することにより、ウシCECの初代培養を調製し、in vitro培養において、ウシCECが表現型の変化、β-カテニンの核内移動、EMT制御因子のカタツムリとスラッグなどのEnMTプロセスを示すことを実証した。さらに、ラット角膜内皮凍結損傷モデルを使用して、in vivoでのEnMTプロセスを実証しました。全体として、ウシCECのin vitro初代培養とin vivoラット角膜内皮凍結損傷モデルは、EnMTのメカニズムを調査するための有用なプラットフォームを提供します。

ウシのCECの単離後、細胞をインビトロで培養した。 図1は、ウシのCECの位相コントラスト画像を提示します。コンフルエンスの細胞の六角形は、細胞が細胞単離の間、角膜間質線維芽細胞によって汚染されていないことを示した。 図2に示された時点でABC、カタツムリ及びナメクジに対する抗体を用いて行った免疫染色を示します。 in vitro培養における表現型の変化とは別に、ABCとEMTレギュレータの対応する核内移行を観察した。 図3は、in vitroで培養されたウシのCECのEnMTプロセスに、マリマスタット、広域スペクトルのMMP阻害剤の効果を示す。 図図4は、房内注入しcryoinjury後のラットの外部目の写真を含んでいる。 図5は、Rの免疫染色を示しています<html>房内注射、続いcryoinjury後ABCに対する抗体を用いて行...

ウシ角膜内皮細胞の初代培養は、角膜内皮間葉移行のメカニズムを調べるために使用しました。さらに、ラット角膜内皮cryoinjuryモデルは、in vivoで角膜内皮間葉移行を示すために使用されました。

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

本手順の目的は、角膜内皮の内皮間葉転換（Endothelial-mesenchymal Transition）のメカニズムをin vitroおよびin vivoで調査することです。この手法は、角膜内皮再生の分野における角膜内皮間葉転換に関する疑問の解明に寄与します。本技術の利点は、in vitroおよびin vivoの両モデルに適用できることです。また、操作が容易です。本手法の意義は、角膜内皮間葉系移行に関連する疾患の治療に向けられています。例えば、これらのモデルを用いることで、角膜内皮間葉系移行のプロセスを抑制する物質を選別することが可能になります。本手順は、研究室の技術者であるJung-Shen Chang氏によって実演されます。まず、新鮮なウシの眼球を10% (w/v) ポビドンヨード溶液で3分間消毒します。その後、PBSで洗浄します。メスと鋏を用いて角膜ボタンを採取し、PBSで洗浄する。解剖顕微鏡下で、ピンセットを用いてデスメ膜を剥離する。その後、デスメ膜を1 mLのTrypsin中、37 °Cで30分間インキュベートする。次に、112 ×gで5分間遠心分離し、ウシCECを回収する。遠心分離後、細胞を1 mLのSHEMで再懸濁します。細胞を6 cmディッシュに播種し、SHEMで培養します。続いて、細胞を37 °C、5% CO2条件下でインキュベートし、3日ごとに培地を交換します。細胞がコンフルエントに達したら、PBSで洗浄します。次に、1 mLのTrypsin中、37 °Cで5分間インキュベートします。112 ×gで5分間遠心分離して細胞を回収します。5分後、細胞ペレットを1 mLのSHEMで再懸濁します。次に、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。その後、24ウェルプレート内のカバーガラス上に細胞を播種し、SHEMで培養します。MaramastatのENMT抑制効果を調べるため、10 micromolarのMaramastatを含むSHEMで細胞をインキュベートし、3日ごとに培地を交換します。その後、指定したタイムポイントで、250 microlitersの4%Paraformaldehydeを用いて室温で30分間細胞を固定します。続いて、250 microlitersの0.5%Triton X-100を用いて5分間透過処理を行います。その後、10% BSAで30分間ブロッキングを行います。続いて、ABC、snail、およびslugに対する一次抗体とともに、細胞を4°Cで一晩インキュベートします。翌日、PBSを用いて細胞を15分間ずつ2回洗浄します。その後、Alexa Fluor結合二次抗体とともに室温で1時間インキュベートします。次いで、2 µg/mLのDAPIで細胞を覆い、細胞核を対比染色します。PBSを用いて、1回15分間、細胞を2回洗浄します。そして、免疫蛍光画像を取得する前に、抗退色封入剤で封入します。12週齢の雄性SDラットを麻酔した後、動物の皮膚を軽くつまみ、皮膚の痙攣がないことを確認して麻酔が適切にかかっているかを確認します。次に、疼痛と瞬目反射を最小限に抑えるため、ラットの右目に0.5% Proparacaine Hydrochlorideを1滴点眼します。続いて、角膜の乾燥を防ぐため、左眼にテトラサイクリン軟膏を塗布します。次に、ステンレス製プローブを液体窒素で冷却します。右眼の角膜中央に、このステンレス製プローブを30秒間適用します。角膜の乾燥を防ぐため、処置中に右眼へPBSを頻繁に点眼してください。また、毛様体痙攣による眼痛の緩和および感染防止のため、凍結損傷直後から1日1回、0.1% Atropineおよび0.3% Gentamicin Sulfateを投与してください。処置後は、ヒートランプを使用してラットを保温し、運動機能が回復するまで経過を観察します。回復期間中の角膜乾燥を防ぐために右眼にTetracycline軟膏を塗布し、角膜凍結損傷処置を3日間連続で繰り返します。Maramastatまたは塩基性FGFをラットの眼内室に投与するため、麻酔をかけたラットの右目に0.5%プロパラカイン塩酸塩を1滴点眼し、疼痛と瞬目反射を最小限に抑えます。次に、滅菌PBSで眼表面を洗浄します。手術用顕微鏡下で、1 mmシリンジに装着した30ゲージ針を、虹彩の上方かつ平行に、角膜辺縁部の透明な角膜に挿入し、前房穿刺を行います。その後、針の刃先を上に向け、角膜の創部をわずかに押し下げて房水を一部排出し、眼圧を下げます。薬剤0.02 millilitersを前房内に注入し、針を抜く際に綿棒で穿刺部位を軽く圧迫します。この図は、ウシCECおよびその培養細胞の位相差像を示しています。コンフルエント状態における細胞の六角形状は、細胞分離時に角膜実質線維芽細胞による汚染がなかったことを示しています。ウシCECのin vitro培養中、ABC、snail、およびslugの核内移行が14日目まで検出されました。この図は、広スペクトルMMP阻害剤であるMaramastatが、in vitro培養されたウシCECのENMTプロセスに及ぼす影響を示しています。ここでは、冷凍損傷後、前房内注入を行ったラットの眼外部写真を示します。写真は、basic FGF注入後に角膜浮腫が軽減した様子を示しています。一方、Maramastatはbasic FGF単独の場合と比較して、角膜浮腫をさらに軽減させました。また、この図は、凍結損傷後に前房内注入を行ったラット角膜ボタンの、ABC抗体を用いた免疫染色の結果を示しています。PBS群ではABCの核内移行が観察され、basic FGF群ではそれが有意に増加しており、Wnt Beta-cateninシグナル伝達およびENMTプロセスの活性化が示唆されました。前房内注射において、basic FGFに続いてMaramastatを投与すると、ABCの核染色は減弱し、MaramastatのENMT抑制効果が示唆されました。本手法の開発により、角膜内皮間葉系移行（Corneal Endothelial-mesenchymal Transition）分野におけるin vitroおよびin vivoの研究に道が開かれました。このビデオを視聴することで、ウシ角膜内皮細胞の分離方法、および角膜凍結損傷と前房内注射の手法について深く理解することができます。

in-vitro-vivo-models-to-study-corneal-endothelial-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

プロトコルは、マウスにおいて開発された角膜マイクロポケットアッセイを説明しています。...

角膜マイクロアッセイ：マウス眼における血管新生のモデル

マウスは、角膜移植を含む多くの移植形態を研究するためのモデルとして使用されてきました。...

ネズミ角膜移植：固体臓器移植の最も一般的な形態を研究するためのモデル

上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。...

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

このプロトコルでは、新規三次元の in vitroモデル、角膜間質細胞と分化した神経細胞が一緒に培養試験と 2...

角膜組織工学: In Vitroのモデル人間の角膜の神経間質相互作用

体外誘導 EndMT に関与する細胞のシグナル伝達経路を調査するために有用である内皮間葉転換 (EndMT) のためのプロトコルを説明します。この実験モデルでは、EndMT は MS 1 血管内皮細胞における TGF-β...

成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析

元のプロトコル vivo 角膜器官培養モデル創傷治癒の研究を説明に役立ちます。このモデル系は、再生治癒を促進するエージェントまたは整頓されていた 3 D...

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

ここでは、ブタ分割角膜ボタンの調製および栽培のためのステップバイステップのプロトコルが提示される。このオルガノ典型的に栽培された臓器培養モデルは、ヒトドナー角膜に匹敵する15日以内の細胞死亡率を示すので、有毒なデキストランを添加することなく非ヒト角膜の長期培養を可能にする最初のモデルを表す。...

分割角膜ボタンを用いてのブタ角膜内皮器培養モデル

ここでは、腫瘍性角質症(BK)のエクスビボ病モデルとして、ネオジム:YAG(Nd:YAG)レーザーを用いて、デセメットの膜(DM)から角膜内皮細胞(CEC)を剥離するプロトコルを提示する。...

角膜内皮細胞損失の非侵襲的レーザー支援実験モデルの開発

このプロトコルは、ヒトまたは羊組織の外植植物から角膜内皮細胞培養を確立し、成長させるために必要な重要なステップを記述する。膜状生体材料上の角膜内皮細胞を下塗りする方法も提示されている。...

生体物質膜上におけるヒトおよび羊角膜内皮細胞層の増殖

細胞形態変化を観察し、免疫蛍光染色を用いたEndMT関連マーカー変化の発現を調べることにより、内皮細胞におけるTGF-β2誘導EndMTを調べる方法について述べる。CRISPR/Cas9遺伝子編集は、TGF-β2誘導EndMTにおけるその役割を調査するためにカタツムリをコードする遺伝子を枯渇させるために記述され、使用された。...

TGF β媒介性間葉転移(EndMT)およびCRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたEndMTエフェクターの機能評価

ここでは、角膜上皮の機械的および化学的損傷のためにマウスとウサギに基づく動物モデルを開発し、新しい治療法とそのメカニズムをスクリーニングします。...

角膜上皮の機械的および化学的損傷のためのEx Vivoおよびin vivo動物モデル

学ぶ角膜内皮間葉転換のメカニズムをin vitroおよびin vivoモデルで。牛角膜内皮細胞の初代培養とラット角膜凍傷モデルを用いて、角膜再生医療の治療戦略開発に貢献する知見を得ます。

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

さらに動画を探す