Name: 肝組織工学のための三次元細胞培養プラットフォーム：逆コロイド結晶ポリ（エチレングリコール）足場の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶPEGベースの逆コロイド結晶足場の作製法。肝細胞の長期的機能維持を可能にする三次元培養プラットフォームで、創薬スクリーニングや再生医療への応用が期待されます。Huh-7.5細胞を用いた評価手法も解説します。

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著者らは、国立研究財団フェローシップ（NRF -NRFF2011-01）と競争的研究計画（​​NRF-CRP10-2012-07）からの支援を承認したいと思います。

著者らには、開示すべき競合する金銭的利益はありません。

組織工学足場は急速にすべての、再生、維持、または薬物を、疾患を研究開発、臓器置換の適用のための組織を修復するために必要な物理的および生化学的手がかり、および他の多くの57を提供するように進化しています。肝組織工学では、初代ヒト肝細胞は急速にエンジニアリング足場と肝機能を維持するための開発プラットフォームのための大きい必要性を作成し、一度本体から分離され、それらの代謝機能を失います。 試験管肝細胞培養プラットフォームの電流は異なる生体材料を利用してきました。この分野の研究は、このようなECMタンパク質構成58,59、共培養60,61、および62を微細としてin vivoでの肝微小環境のさまざまな機能を、模倣に集中してきました。しかし、制御された多孔性と高い空間組織と足場の欠如がありました。この点において、記載I​​CC細胞培養platfORM、その等方性の特性と高い組織と、このボイドに対処しています。我々は、ICC PEGDA足場は肝細胞を培養するのに適したプラットフォーム、肝細胞のモデル細胞型であ...

肝臓は、血液の解毒、生体異物の代謝、および血清タンパク質の産生を含む多数の機能を有する高度に血管器官です。肝臓組織は、複数の細胞型、毛細胆管、正弦波、及び異なるバイオマトリックス組成物と異なる酸素濃度のゾーンを含む、複雑な3次元（3D）微細構造を有します。この精巧な構造を考えると、 インビトロ 1 における適切な肝臓モデルを作成することは困難でした。しかし、薬物毒性2をテストし、肝臓3に関連する疾患を研究するためのプラットフォームとして、ヒト肝細胞をホスティングしているin vitroモデルにおける機能の需要があります。 現在の肝臓組織工学プラットフォームは、肝臓のパラメータ、セル4の、すなわち共培養、透明帯の生化学的組成の、1を単離し、または数に着目して、肝臓の複雑さを単純化していますリットルの微小環境5、流体力学6,7およびバイオマトリックス8の構成。バイオマトリックスの構成は、このような足場材料、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の組成は、マトリックス剛性だけでなく、足場の設計や構造などのパラメータに分けることができます。曲ヒドロゲルの機械的性質、生物活性、および分解速度の能力を考えると、合成ヒドロゲル、特にポリ（エチレングリコール）（PEG）9ヒドロゲルを用いた組織工学研究の上昇がありました。肝臓に関連する研究については、生体適合性ヒドロゲルは、肝疾患3のウイルス感染の研究のために適用しました。肝細胞プラットフォームの設計としては、多くの研究は、in vivo微小環境に模倣するために必須である3D環境および細胞- ECMおよび細胞-細胞相互作用を提供するために、ヒドロゲル12,13内の肝細胞サンドイッチ培養10,11及びセルカプセル化を利用してきました。ハウ版、これらのプラットフォームは、足場14を介して不均一な特性につながる、制御および空間的構成の高度を持っていません。 反転結晶コロイド（ICC）は14足場は、最初の2000年代初頭に導入された細胞培養のための高度に組織化された3次元の足場です。足場のユニークな構造は、コロイド結晶、可変直径のコロイド粒子の規則正しい格子を使用した簡単な製造プロセスに起因し得ます。簡潔には、プロセスを要約するために、粒子が整然と配置され、格子を形成するために熱を使用してアニールされます。高表面積をもつ六角形パックされた球状の空洞15中の重合ヒドロゲル結果の有機溶剤によって、この格子の浸出、、。この高度に秩序足場は、以前含む、合成および天然両方の材料で作られたが、ポリ（アクリルアミド）、16-21に限定されるものではなく、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）、15,22-30されています、ポリ（エチレングリコール）31,32、ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）、21,33-35、およびキトサン36-39。非ファウリングの素材で作られたICC足場は、空洞14,23,40内の細胞スフェロイドを促進する傾向があります。複数の細胞型は、骨髄間質細胞が42、軟骨細胞41を含め、正常にこの構成の中に、増殖分化および機能することが示され、細胞43,44幹されています。肝細胞について、研究がICC用のNa 2にSiO 3及びポリ（アクリルアミド）からなる骨格ではなく、PEGを用いて実施されてきました。単純なバイオコンジュゲーション戦略を有する（ すなわち 、EDC / NHSを介して、アミンカップリング）、ECMタンパク質共役PEGベースの足場が環境など、in vivoでの詳細あると肝機能を向上させるために多くの細胞結合部位を証明することができ、製造することができます。 この原稿と関連するビデオでは、我々の詳細ICC足場の製作肝細胞癌（ホ-7.5）の培養のために最適化されたポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（PEGDA）ヒドロゲル、ポリスチレン微小球格子を使用。私たちは、足場のトポロジと電池性能の点で、一般的に非粘着性の裸のPEGDAのICC足場とコラーゲンコーティングPEGDAのICC足場との違いを示しています。細胞の生存および機能ホ-7.5細胞の挙動を評価するために、定性的および定量的に測定されます。

<table><tbody><tr><td>0.2 ml PCR tube</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-02D-C</td><td>耐沸騰</td></tr><tr><td>性ゴリラ接着剤</td><td>Gorilla Glue, Inc.</td><td>ベンダーによって異なります。これは地元の店から購入しました。</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラスVWR</td><td></td><td>631-1575</td><td>寸法:24回;60 mm2</sup</td></tr><tr><td>>ポリスチレン球</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSS#4314A</td><td>直径 = 140 &micro;m;3x104粒子/ミリリットルおよび1.4%サイズ分布</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td>1.00983.1011</td><td>分析EMSUREのための絶対。Milli-Q 水で 70% に希釈</td></tr><tr>超音波<td>浴</td><td>Elma</td><td>S10H</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Furnace</td><td>Nabertherm</td><td>N7/H</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>200 & micro;l ピペットチップ</td><td>Axygen Scientific</td><td>T-210-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>ロッキングシェーカー</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール (PEG)</td><td>Merck</td><td>1.09727.0100</td><td>Mw= 4 kDa; PEG モノマーのアクリル化と得られた沈殿物の精製により、Mw = 4.6&nbsp;kDa</td></tr><tr><td>の遠心分離機</td><td>のベックマン・コールター</td><td>392932</td><td>装置</td></tr><tr><td>アクリル酸塩ポリ(エチレングリコール) - スクシンイミジルの吉草酸</td><td>レイサン生物</td><td>ACR-PEG-SVA-3400-1g</td><td>Mw = 3.4 kDa</td></tr><tr><td>2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td>装置</td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5404 000.413</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Film</td><td>Parafilm M&nbsp;</td><td>#PM996</td><td>9インチに保たれ、強度は10.84&nbsp;mW/cm2</sup</td></tr><tr><td>>Bluewave 200 UVスポットライト</td><td>ブレイズテクノロジー&nbsp;</td><td>120008, 122300</td><td></td></tr><tr><td>テトラヒドロフラン (THF)</td><td>メルク</td><td>107025</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>ハイドルフ</td><td>543-123120-00-5</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン I 型</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>ラット 1x, CaCl<サブなし>2</サブ> &MgCl<サブ>2</サブ>;pH = 7.2</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>16% W/V AQ. 10 x 10&nbsp;ml</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>VWR</td><td>43368.9M</td><td>機器</td></tr><tr><td>Freezone 4.5凍結乾燥機</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td>機器</td></tr><tr><td>スパッタコー</td><td>ターJeol Ltd.</td><td>JFC-1600</td><td>装置</td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>(株)</td><td>JSM 5310</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I Abcam</td><td></td><td>ab6308</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon)&nbsp;</td><td>Bio-Rev PTE LTD</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L グルコース w/ L-Gln</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S)</td><td>Life Tchnologies</td><td>15140-122 E</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Corning non-treated culture dishes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430591</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>機器; 37&nbsp;&deg;C、5%湿度</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>371</td><td></td></tr><tr><td>ハウサーブライトライン相血球計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>哺乳類細胞用生/死生存能力/細胞毒性キット</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ L3224&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 Assay</td><td>同人堂研究所</td><td>CK04-11</td><td>Monosodium-salt reagent (MSR)</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO microplate reader&nbsp;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin Human ELISA kit</td><td>Abcam</td><td>ab108788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610407</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス一次抗体 (CYP3A4, アルブミンに対して)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53850; sc-271605</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 ラベル付き Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>VWR</td><td>22706.326</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>DPEC 水</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ2000c 分光光度計</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SYBR は、CFX</td><td>Life Technology</td><td>4472937</td><td></td>Primers のマスターミックスを選択します</tr><tr><td>CFX96</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>リアルタイムシステム、C-1000 タッチサーマルサイクラー</td><td>Bio Rad</td><td>Laboratories SOFT-CFX-31-PATCH&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

肝組織工学のための三次元細胞培養プラットフォーム：逆コロイド結晶ポリ（エチレングリコール）足場の作製

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

インビトロでの肝細胞の機能を維持する能力は 、生体異物「細胞毒性を試験ウイルス感染を研究し、肝臓での標的薬の開発のために、細胞は、適切な生化学的および機械的な合図を受信するプラットフォームを必要とします。最近の肝組織工学システムは、その高い保水性、細胞によって必要とされる機械的な刺激を提供する能力を与えられた、合成または天然のハイドロゲルからなる三次元（3D）スキャフォールドを採用しています。反転コロイド結晶（ICC）足場、高い空間組織、同型および異細胞の相互作用、ならびに細胞外マトリックス（ECM）の相互作用を可能にする最近の開発、への関心が高まってきました。ここで、我々は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（PEGDA）と粒子浸出法を用いてICC足場を製造するためのプロトコルを説明します。簡潔には、格子は、後のプリpolyme微小球粒子から形成されていますRの溶液は適切に重合し、添加し、次いで、粒子を有機溶媒（ 例えば、テトラヒドロフラン）を使用して、除去し、または浸出されます。メディアをより簡単に細胞に到達することを可能にする制御された細孔サイズとinterconnectivitiesを有する高度に多孔質足場の格子結果の解散。このユニークな構造は、細胞が同様に簡単に毛穴の間の通信、およびタンパク質とPEGDAのICC足場はまた、電池性能に顕著な効果を示してコートする能力のことを遵守するための高い表面積を可能にします。私たちは、生存能力の点で足場の形態と同様に肝細胞癌細胞（ホ-7.5）行動を分析し、ICCの構造およびECMコーティングの効果を調査するために機能します。全体的に、この論文は、組織工学における幅広い用途を持つ新興足場、特に肝組織工学の詳細なプロトコルを提供します。

ICC足場の構造的特徴と肝細胞を培養することで、各ICC足場条件の有効性を比較するための代表的な結果が示され、以下に説明されています。これらの結果に使用されるICC足場条件は、0μgの/ mlの（ベア）のコラーゲンコーティングを20μg/ mlの（コラーゲン20）を200μg/ mlの（コラーゲン200）、及び400μgの/ mlの（コラーゲン400）と初期あります許-7.5細胞播種数は1×10 6です。 ICCの細孔の相互接続と足場トポロジのキャラクタリゼーション。 SEMイメージングは​​、ICC足場の固定及び凍結乾燥後、最初のICCの細孔との間の適切な相互接続を形成したかどうかを判断するために足場トポロジ上の様々なコラーゲン濃度のコンジュゲーションの効果を確認するために使用されました。二次元の定量分...

この原稿は、新たな三次元肝細胞培養プラットフォーム、逆コロイド結晶足場、および肝細胞の振る舞いを評価するための付随する技術の製造のための詳細なプロトコルを提示します。サイズ制御可能な細孔、相互接続性、および細胞外マトリックスタンパク質をポリ(エチレングリコール)(PEG)足場に結合する能力により、Huh-7.5細胞の性能が向上します。

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

本手順の全体的な目的は、肝組織工学への応用に向けて、細胞外マトリックスをコード化したPEGベースの逆コロイド結晶スキャフォールドを作製することです。肝組織工学は、組織工学および再生医療における非常に有望な分野です。我々は、肝細胞が長期的にその機能を維持できる3D工学スキャフォールドを構築しています。この技術の意義は薬剤試験にまで及び、本システムで培養された肝細胞は機能をより長く維持し、薬剤に対してより適切な反応を示す可能性があります。また、この手法は組織工学への知見を提供するだけでなく、幹細胞を用いた系など、他のシステムにも応用可能です。本手順の実演は、私の研究室の大学院生である Hitomi が行います。マイクロビーズ用モールドを準備するために、まず0.2 milliliterの耐熱マイクロ遠心チューブの先端を40 microliterのレベルで切断します。防水接着剤を使用して、切断したチューブの上部をガラス製顕微鏡カバーガラスに貼り付け、その後モールドの周囲を接着します。次に、ポリスチレンマイクロスフィアが入ったバイアル内の水を70% ethanolに置換します。球体溶液を超音波洗浄機に入れ、30ワットで3分間超音波処理して、凝集した球体を分散させます。マイクロスフィアの調製が完了したら、各モールドにエタノールを100 µLずつピペッティングします。次に、200 µLピペットチップの上端から4 mmを切り取り、そのチップを用いてポリスチレンマイクロスフィアを25 µLずつ2回、モールドにピペッティングします。モールドをロッキングシェーカーに載せ、120 RPMに設定します。サンプルをシェーカーに乗せたまま一晩静置します。翌日、モールドを顕微鏡下に置き、球体が六方格子状に配列していることを確認します。エタノールを室温で2晩放置して蒸発させます。その後、型とビーズの複合体を130 °Cのオーブンに慎重に6時間入れ、ポリスチレンビーズをアニールさせて3Dスキャフォールドのネガティブを形成させます。まず、これら2つの参考文献に記載されている確立されたプロトコルを用いて、ポリエチレングリコールジアクリレートマクロマーを合成します。次に、脱イオン水を用いてPEGDAの50%溶液を調製し、完全に溶解するまで混合物を遠心分離します。細胞外マトリックス結合スキャフォールドの場合は、50% PEGDA溶液にクリルオイルPEG NHSをさらに10%添加します。その後、70%エタノールを用いて光開始剤の20%ストック溶液を調製します。PEGDA混合液1 mLにつき、光開始剤溶液を50 µL加えます。次に、混合液を1分間ボルテックスします。続いて、ガラススライドから型を剥がし、スパチュラを用いてラティスを慎重に取り出し、個別の1.5 mL遠心チューブに入れます。各チューブにPEG

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バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、マイクロバイオリアクターにおける細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォームについて説明します。一つのチップは10ミオまで収容することができる。流体の流れに関しては正確に定義された条件下で培養することができる細胞、滅菌、閉鎖循環ループ内の酸素分圧など。...

灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養

複雑な組織の高度に組織化された構造を作成するためには、複数の材料と細胞タイプを統合された複合材料に組み立てる必要があります。...

組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

組織特異的細胞外マトリックス（ECM）は、細胞機能の重要なメディエーターです。この記事では、in vitro細胞培養モデルにおけるまたはプロ再生bioscaffoldsなどの高度な3Dでのアプリケーションのための化学的架橋を必要とせずに培養液中で安定している純粋なECM由来フォーム及びマイクロキャリアを合成するための方法を説明します。...

組織特異的細胞培養および配信プラットフォームとして、細胞外マトリックス由来のフォームおよびマイクロキャリアの作製

このプロトコルは、cryogelation の技術で微細加工を統合することにより弾性三次元多孔体 microcryogels の作製をについて説明します。セルの読み込み、時に、容易に注入の生体内再生治療を容易にすることができますまたは高スループット薬剤スクリーニングの in vitroの配列に組み立てに 3 D...

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

ここでは、自己組織化ペプチドのひと関節軟骨細胞の脱分化型軟骨への分化を促進する足場の 3 D 培養システムを取得するためのプロトコルを提案する.

三次元ペプチド足場で哺乳動物の細胞を培養

このプロトコルは、繊維質間質コンパートメントを伴う3Dバイオミメティックモデルを提示する。細胞間相互作用、腫瘍増殖および転移の活性メディケーターである細胞外基質の生物物性を模倣した比率で生理学的に関連するヒドロゲルを調製した。...

神経癌の生物模倣モデルが、調整可能な生体特性を有する3D環境における腫瘍-ストロマ相互作用を研究する

肝疾患は、線維症や肝硬変を促進する多くの原因によって誘発される。移植は健康回復のための唯一の選択肢です。しかし、移植可能な臓器の不足を考えると、代替案を検討する必要があります。我々の研究は、動物モデルからの肝臓組織におけるコラーゲン足場の移植を提案する。...

肝再生戦略としての三次元コラーゲンマトリックス足場移植

本プロトコルは、肝臓 のin situ...

非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスにおける肝臓細胞外マトリックスの3Dイメージング

オルガノイドは、臓器開発、創薬、疾患研究のための個別化組織モデリングに革命をもたらします。オルガノイド工学は、複雑な合成組織の作成へと進歩しています。その目的は、形態形成、アッサンブロイド技術、およびバイオマトリックスを統合して、組織工学を進歩させることです。このプロトコルは、肝臓の器官形成をモデル化し、合成組織構築のガイドラインを確立するのに役立ちます。...

ヒト細胞株を用いた肝臓器官形成のモデリング、アッサンブロイドの構築、合成組織の設計のためのin vitro培養技術

このプロトコールでは、ラットモデルにおける最適化された2ステップコラゲナーゼ肝灌流技術を示し、3Dオルガノイドの in vitro...

ラットの肝臓灌流と初代肝細胞の単離:最先端の3Dオルガノイド培養に不可欠な古い手順(英語)

学ぶPEGベースの逆コロイド結晶足場の作製法。肝細胞の長期的機能維持を可能にする三次元培養プラットフォームで、創薬スクリーニングや再生医療への応用が期待されます。Huh-7.5細胞を用いた評価手法も解説します。

肝組織工学のための三次元細胞培養プラットフォーム：逆コロイド結晶ポリ（エチレングリコール）足場の作製

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