肝組織工学のための三次元細胞培養プラットフォーム：逆コロイド結晶ポリ（エチレングリコール）足場の作製

本手順の全体的な目的は、肝組織工学への応用に向けて、細胞外マトリックスをコード化したPEGベースの逆コロイド結晶スキャフォールドを作製することです。肝組織工学は、組織工学および再生医療における非常に有望な分野です。我々は、肝細胞が長期的にその機能を維持できる3D工学スキャフォールドを構築しています。

この技術の意義は薬剤試験にまで及び、本システムで培養された肝細胞は機能をより長く維持し、薬剤に対してより適切な反応を示す可能性があります。また、この手法は組織工学への知見を提供するだけでなく、幹細胞を用いた系など、他のシステムにも応用可能です。本手順の実演は、私の研究室の大学院生である Hitomi が行います。

マイクロビーズ用モールドを準備するために、まず0.2 milliliterの耐熱マイクロ遠心チューブの先端を40 microliterのレベルで切断します。防水接着剤を使用して、切断したチューブの上部をガラス製顕微鏡カバーガラスに貼り付け、その後モールドの周囲を接着します。次に、ポリスチレンマイクロスフィアが入ったバイアル内の水を70% ethanolに置換します。

球体溶液を超音波洗浄機に入れ、30ワットで3分間超音波処理して、凝集した球体を分散させます。マイクロスフィアの調製が完了したら、各モールドにエタノールを100 µLずつピペッティングします。次に、200 µLピペットチップの上端から4 mmを切り取り、そのチップを用いてポリスチレンマイクロスフィアを25 µLずつ2回、モールドにピペッティングします。

モールドをロッキングシェーカーに載せ、120 RPMに設定します。サンプルをシェーカーに乗せたまま一晩静置します。翌日、モールドを顕微鏡下に置き、球体が六方格子状に配列していることを確認します。

エタノールを室温で2晩放置して蒸発させます。その後、型とビーズの複合体を130 °Cのオーブンに慎重に6時間入れ、ポリスチレンビーズをアニールさせて3Dスキャフォールドのネガティブを形成させます。まず、これら2つの参考文献に記載されている確立されたプロトコルを用いて、ポリエチレングリコールジアクリレートマクロマーを合成します。

次に、脱イオン水を用いてPEGDAの50%溶液を調製し、完全に溶解するまで混合物を遠心分離します。細胞外マトリックス結合スキャフォールドの場合は、50% PEGDA溶液にクリルオイルPEG NHSをさらに10%添加します。その後、70%エタノールを用いて光開始剤の20%ストック溶液を調製します。

PEGDA混合液1 mLにつき、光開始剤溶液を50 µL加えます。次に、混合液を1分間ボルテックスします。続いて、ガラススライドから型を剥がし、スパチュラを用いてラティスを慎重に取り出し、個別の1.5 mL遠心チューブに入れます。

各チューブにPEGDA溶液を300 µLずつピペットで分注し、遠心分離してPEGDA溶液をポリスチレンラティスに浸透させます。次に、ピンセットでラティスをチューブから取り出し、表面の余分なPEGDA溶液を注意深く吸い取ります。ラティスの平らな円形面を上にして、パラフィンフィルムを敷いたガラスの上に置きます。

次に、UVスポットランプを用いて、スキャフォールドを365 nanometerの紫外線に5分間照射します。約10個のPEGDA重合結晶格子を新しいバイアルに入れ、20 millilitersのTHFを加えます。バイアルをオービタルシェーカーで300 RPMにて6時間振盪します。

1〜2時間ごとにバイアルを取り出し、ポリマー含有溶媒を新鮮なTHFと交換します。最後の洗浄後、使用済みのTHF溶液に水を加え、PS球が完全に溶解したかを確認します。溶液が白濁している場合は、溶液が透明になるまで追加の洗浄を行ってください。

スキャフォールドを滅菌するために、50 mLマイクロ遠心チューブを用意し、スキャフォールド1つにつき2 mLの70%エタノールを入れ、スパチュラを用いてスキャフォールドをチューブに入れます。スキャフォールドをエタノールに1時間浸漬させます。1時間後、エタノールを慎重に捨て、同量の滅菌PBSと交換します。

次に、スキャフォールドを遠心分離し、気泡を除去します。遠心分離したスキャフォールドを4 °Cで保存し、1〜2時間ごとに取り出して溶液を新鮮なPBSに交換します。PBSを数回交換した後、コラーゲンでコーティングするスキャフォールドを取り出し、コーティングするスキャフォールド1つにつき1 mLのI型コラーゲンを含むチューブに入れます。

次に、前と同様にチューブを遠心分離し、その後、オービタルシェーカーを用いて400 RPMで30分間、スキャフォールドを振盪します。スキャフォールドを4 °Cで一晩保存します。肝細胞癌細胞を、10 mLの培地とともに100 mm細胞培養ディッシュで培養します。

細胞密度が培養表面の75～80%に達するまで、3日ごとに培地を交換します。細胞の準備が整ったら、スキャフォールドの平らな面を上に向け、注意深く24ウェルプレートに配置します。その後、各スキャフォールドを2 mLのPBSで洗浄します。

PBSを吸引し、スキャフォールドに2 mLの増殖培地を加えます。30分後、培地を除去し、スキャフォールドを1時間乾燥させます。次に、トリプシン消化法を用いて肝細胞癌細胞を回収します。

細胞をペレット化した後、上清を除去し、25 µLあたり100万個の細胞数になるようにペレットを再懸濁します。細胞懸濁液25 µLを、各スキャフォールドの上にゆっくりとピペッティングします。その後、プレートに蓋をして、一晩インキュベーター内で培養します。

次に、スキャフォールドを慎重に新しい24ウェルプレートに移し、各ウェルに2 mLの培地をピペッティングした後、プレートをインキュベーターに戻します。ここにスキャフォールドの走査電子顕微鏡写真を示します。これは、平均直径100〜105 µmの孔が六方最密充填構造で配列しており、それらが主に直径35〜40 µmの隣接する孔と相互接続して構成されています。

肝癌細胞を播種したところ、コラーゲンI型でプレコートされたスキャフォールド上では細胞が増殖したが、未処理のスキャフォールド上では細胞数は増加しなかった。さらに、コラーゲンコート済みスキャフォールド上の肝癌細胞は、濃度依存的に高い細胞機能を示した。14日目において、400 µg/mLでコートされたICCスキャフォールドで培養した肝癌細胞は、未処理のスキャフォールドで培養した場合よりも3倍以上のアルブミンを分泌した。

この手順を行う際は、ラティス内のポリスチレン粒子が適切に配列されていることを確認することが重要です。配列が不適切であると、相互接続性が低下し、細胞活性に悪影響を及ぼす可能性があります。このビデオを視聴することで、コーティングを施した細胞包含型PEGベース逆コロイド結晶スキャフォールドの作製方法について十分に理解できるはずです。

テトラヒドロフランの取り扱いは危険を伴う可能性があるため、本手順の実施中は、常にドラフトチャンバー内での操作、手袋およびゴーグルの着用などの予防策を講じてください。