Name: 膵臓がんの蛍光同所性マウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学ぶ蛍光同所性膵がんマウスモデルの構築法。GFP発現PANC-1細胞をBalb-c Ola Hsd-Fox1nuマウスの膵臓に移植し、侵襲を伴わない生体内イメージングで腫瘍進行と転移をリアルタイムに観察する手法を解説します。

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私たちは、学内助成金を提供してくださったウェスタン健康科学大学に感謝します。

以下で説明するプロトコルは、指導とウェスタン大学の動物実験委員会の承認の下に実行されます。すべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規則および規制当局に準拠して行われています。 1.細胞培養<ol><li> 完全培地の調製 <ol><li>クラスII生物学的安全キャビネットを使用して、無菌的にRPMI培地、500mlのボトルにウシ胎児血清（FBS）及びペニシリンストレプトマイシン（P / S）を添加することによって、完全培地を調製します。旋回により穏やかに混合します。各サプリメントの最終濃度は、10％FBSおよび1％P / S（v / v）です。例えば、56ミリリットルFBSおよび6ミリリットルP / Sとメディアの500ミリリットルを補足します。 </li><li> 37℃の水浴中で完全培地に置きます。 </li></ol></li><li> 細胞を解凍し、伝播 <ol><li>液体窒素からPANC-1 GFP細胞を取得します。 37℃の水浴中で穏やかに撹拌することによって、バイアルを解凍します。 注意：（ - 3分約2）融解は迅速であるべきです。 </li><li> （a）細胞ライン名で使用するラベルT-75フラスコ、（b）は、継代数、（c）は、日付、および（d）研究者のイニシャル。 </li><li>安全キャビネットに70％エタノールおよび転送バイアルとバイアルを拭いてください。 </li><li>細胞を増殖させるために、15ミリリットルコニカルチューブに完全培地の9.0ミリリットルを追加します。 1.0ミリリットルピペットを使用して、慎重に細胞懸濁液を転送し、完全培地9mlにそれを一時停止。 </li><li>室温で8分間、125×gで遠心分離します。安全キャビネットに円錐バイアルを移し、ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。 </li><li>優しく上下サスペンションをピペッティングすることによって、新鮮な完全培地10mlにペレットを一時停止します。 </li><li>血球計数器を用いて細胞をカウントし、2.1×10 6細胞/フラスコの密度でT-75フラスコでそれらをプレート。 37℃のインキュベーターにフラスコを置き、5％のCO 2。 </li><li>目で、顕微鏡下で毎日の細胞を監視します。インフルエンザの場合更新が必要とされているIDは、無菌的にフラスコから完全増殖培地を吸引し、廃棄します。新鮮な完全培地を等量加えます。 </li></ol></li><li> 細胞を増殖させます <ol><li>無菌的にフラスコから培地を除去します。細胞を洗浄し、破棄するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）の5ミリリットルを追加します。 </li><li> 0.25％トリプシンを3mlを添加することによってフラスコから細胞を剥離。 5〜10分間、37℃でトリプシンおよび5％CO 2を含有するフラスコをインキュベートします。 </li><li>顕微鏡（倍率10倍）で細胞を観察し、彼らはラウンドと外れていることを確認します。 </li><li>完全培地を等量加えることによって、トリプシンを中和し、穏やかにピペッティングにより塊を壊します。 </li><li>血球計数器を用いて細胞をカウントし、1.2.7で述べた細胞密度で新しいフラスコに適当な細胞懸濁液の体積を移します。最終容量は、フラスコ当たり10ミリリットルであるように、十分な新鮮な培地を追加します。 </li></ol></li><li> 細胞Suspens注射用イオン調製 注意：基底膜マトリックス、高濃度は、室温で固化するので、氷の上にすべての材料を保ちます。一晩冷凍庫内のすべての滅菌ピペットチップおよびバイアルを置き、サスペンションの作業をしながら氷上に保ちます。 <ol><li>氷の上の任意の添加剤を含まないRPMI培地のボトルを保管してください。製造業者の指示に従って、基底膜マトリックス、高濃度を解凍。好ましくは、複数の凍結融解サイクル10を回避するために小さいバイアルにアリコート。 </li><li>吸引すべてのフラスコからメディア、およびDPBSの5ミリリットルですすいでください。 1.3.4ステップまで、前のセクションのすべての手順を繰り返します。 </li><li>室温で8分間、125×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にコンテンツを転送します。安全キャビネットに円錐バイアルを移し、DPBSの10ミリリットルを使用してペレットを再懸濁。 </li><li>静かにペレットを分割するには、上下サスペンションをピペット。血球計数器を用いて細胞を数えます。 </li><li>秒で概説し、再び遠心分離してくださいTEP 1.4.3。上清を吸引し、細胞の数に応じて、50μlの容量に3×10 6個の細胞を得るために適切な希釈剤を追加します。 1（v / v）の比：希釈剤は1で無血清培地と高濃度基底マトリックス膜の混合物です。 </li><li>優しくサスペンションをボルテックスし、すべての回で氷上に保ちます。サスペンションは今、注射の準備ができています。 </li></ol></li><li> 外科的移植 注：すべての外科手術用材料や器具が滅菌されていることを確認してください。すべての回で無菌技術を練習。 <ol><li>テーブルの上に加熱パッドを配置し、滅菌ドレープでカバー。麻酔マシンをセットアップすると、すべての電源が手の届く範囲内にあることを確認します。 </li><li>麻酔マスクに動物の鼻を配置し、酸素の1リットル/分、2.5％イソフルランに麻酔を設定します。 </li><li>静かにヨウ素と動物の脇腹をスクラブし、70％エタノールですすいでください。 3回繰り返します。 </li><li>確認します動物は完全に後足をつまんで麻酔されています。応答が観察されない場合、動物は完全に麻酔をかけ、手術の準備ができています。しかし、動物がフリンチ行動場合、気化器で十分な麻酔があることを確認し、動物を麻酔下で完全に行くために多くの時間を可能にします。 </li><li>負荷は約18 G針で1.0ミリリットルのTBシリンジに200μlの細胞懸濁液は、（以前に冷却します）。 27 G針で針を交換して使用する準備まで氷上に戻ります。 </li><li>脾臓（腹部の左上の象限）の一般的な領域を見つけ、鉗子は、その領域の上に皮膚をつまんで使用して。手術用はさみを使用すると、ポケットを作成するためには約1.0センチ切開を行います。同様に、脾臓の上に平滑筋をピンチし、腹腔にアクセスするために、カットスルー。 </li><li>ゆっくり脾臓の尾の端をつかみ、体から引き出します。膵臓、脾臓に添付されます。濡れた目を使用して膵臓を広めますerile Qティップは、膵臓の尾を見つけて。 </li><li>膵臓の尾に50μlの注入を提供し、10秒間の内側の針を離れ、ゆっくりと膵臓の外に針を回転させます。移植の成功は、任意の漏れのない表面的な泡のようになります。 </li><li>腹膜腔に膵臓と脾臓を返します。まず筋肉を囲み、その後別々肌を囲みます。切開部を閉じるために、6-0縫合またはステープルを使用してください。管理ケトプロフェン皮下（SC）（5ミリグラム/ kg）を24時間かけて、動物に苦痛を避けるために。 （ - 0.1ミリグラム/キログラム0.05）36時間にわたり12時間ごとあるいは、ブプレノルフィンの皮下投与します。 </li><li>麻酔から動物を回復し、そのケージに戻します。また、痛みのために監視します。手術 - 動物は（先制あるいは前）の時点で疼痛緩和が提供されなければなりません。追加の疼痛緩和がでで規定されIACCUC-プロトコルに従って、または痛みを経験する動物に提供されなければなりません獣医師または指名を傾向。 </li></ol></li><li> in vivoイメージングで 注：画像キャプチャ暗室およびGFPイメージングのための適切なフィルターを備えた商業イメージングシステムを用いて行きました。 （ - ;放出495 nmの455：513 - 557 nmで励起）画像取得は、CCDカメラと互換励起/発光レンズからなる光学系を用いて達成しました。明視野画像は、各時点で、1×1ビニングでフィルタなしで捕捉しました。 GFPの励起は、キセノンマルチスペクトル光源を利用しました。動物は、撮像システムの暗い室内に組み込まガス麻酔マニホールドに麻酔機を接続することにより、画像形成プロセスを通して麻酔下に維持しました。 <ol><li> 1.5.2で概説されるように動物を麻酔。麻酔マスクは、画像中に麻酔下で動物を維持するために商業的イメージングシステムの暗室の内部にありますプロセス。 </li><li>正しい励起および発光フィルタを設定します。 </li><li>白色光だけを使用して初期画像を取得することから始めます。イメージングセッションを通じて動物の同じ位置を維持し、第二の画像を取るために、GFPフィルターに切り替えます。 </li><li>最良の結果を得るために両方の画像を重ね合わせます。蛍光面積と強度のための画像を分析します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Siegel, R. Pancreatic Cancer Stats: American Cancer Society: Cancer Facts & Figures. , Available from:
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

そこで我々は、 生体内蛍光イメージング（ 図1） に全身を使用して、腫瘍増殖の非侵襲的なモニタリングを可能にする、GFPを発現する膵臓癌の同所性マウスモデルを記載します。この技術は、リアルタイムで腫瘍の発生を監視するために私たちをことができます（ 図3）。それは膵臓癌に対する新規薬剤の治療効果を研究する研究者のための重要なツールとなります。このモデルのもう一つの重要な側面は、GFP蛍光が成功した着床および膵臓癌の増殖を示す視覚的な手がかりを提供することです。そうでなければ生きた動物で測定することは困難であろう。臨床的設定と一致して、このモデルは、転移に対する洞察を提供します。脾臓、腸間膜リンパ節、肝臓、および胃腸管（ 図4）：これは、周囲の臓器への転移を示します。我々は、早ければ7週間後の移植などの転移を観察しました。 PANC-1転移が担当者となっています18週11から10までの範囲でorted。転移が観察される時間は、移植細胞、移植及び可視化技術の数に依存し得ます。現在の研究...

膵がんは他のがんに比べて増加した頻度と診断され、米国における癌関連死の4 番目の主要な原因です。診断時からは、患者の90％以上が5年1,2以内に死亡します。現在、外科的腫瘍摘出は、膵臓癌のための唯一の治療法ですが、診断時に病気が進行した段階にあり、3,4が転移しているので、患者の20％未満は、主に手術を受ける資格があります。特定の症状の欠如は、膵臓癌にサイレント病気になります。症状のいくつかは、腹痛、背部痛、食欲不振、黄疸や吐き気の損失が含まれます。これは、簡単に一般的な消化器の病気4と解釈することができます。このため、膵臓癌の診断及び治療を支援するために、新たな薬理学的ツールを開発することが重要です。 動物モデルの使用は、私たちはpancreの生物学を理解することができます癌ATICと人間にこの知識を適用することへの洞察を提供します。腫瘍が起源5の臓器に成長するため、膵臓癌の異種移植同所性モデルは、現実的です。細胞株または腫瘍断片を皮下移植された異機種とは対照的に、同所性モデルは、腫瘍の微小環境と模倣その周辺6による腫瘍細胞の相互作用を再現することを可能にします。ここで説明する異種移植モデルは、遺伝子、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するように操作されたヒト膵臓癌細胞株PANC-1 GFPから腫瘍を導出します。 GFPの検出は、腫瘍の増殖および転移7の非侵襲的画像化およびモニタリングのために可能にします。腫瘍の発生は、自発的に、急速に発生し、密接にヒト膵臓癌患者の原発性腫瘍8のそれに似ています。同所性モデルは、一方で、治療薬に応答して、薬効のより正確な予測を提供します腫瘍微小環境を模倣します。 上記のように、この動物モデルは、リアルタイムで腫瘍増殖および転移の蛍光検出を可能にします。蛍光検出は、発光に比べて、より直接的/ライブイメージングを可能にします。蛍光で放出された光は、より短い波長の別の光による励起の結果です。発光のに対し、放射された光は、化学反応の結果であり、強い発光9を有していなくてもよいです。また、 生体内蛍光イメージングにおける全身が動物に有害ではないと研究者は治療的処置に応答して、時間をかけて腫瘍の成長を監視することができます。

<table><tbody><tr><td>RPMI media 1640</td><td>Caisson Labs</td><td>RPL03-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo Ficher Sci</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲルHC基底膜、高濃度</td><td>コーニング</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>SutureVet PGA 6-0 PGA</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>39010</td><td></td></tr><tr><td>アルケアまたは発泡消毒剤 ハンドラブ</td><td>ステリス</td><td>639680</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (デュベルコのリン酸緩衝生理食塩水)&nbsp;</td><td>Thermo Ficher Sci</td><td>21300025</td><td></td></tr><tr><td>TB シリンジ 27 G 1/2</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Blutler Schein</td><td>50562</td><td></td></tr><tr><td>ケトプロフェン</td><td>フォート ダッジ アニマル ヘルス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サージカル ハサミ、5.5 インチ ストレート マヨネーズ&nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>22-1600</td><td></td></tr><tr><td>PANC-1 GFP細胞株&nbsp;</td><td>Anticancer, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Animal Imaging System: iBox Scientia</td><td>UVP, LLC. カリフォルニア州アップランド</td><td></td><td>生きた動物の蛍光腫瘍を観察するための小動物イメージングシステム</td></tr></tbody></table>

膵臓がんの蛍光同所性マウスモデル



Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

膵臓癌は生存率は過去数十年で大幅に改善されなかったために癌の一つです。のみで診断された患者の7％が5年以上生存するであろう。理解し、膵臓腫瘍の微小環境を模倣するために、我々は、リアルタイムで腫瘍進行の非侵襲的イメージングを可能にする、膵臓癌のマウス同所性モデルを利用しました。緑色蛍光タンパク質（PANC-1 GFP）を発現する膵臓癌細胞を、無血清培地を用いて基底膜マトリックス、高濃度（ 例えば 、マトリゲルHC）中に懸濁させ、次いで、開腹を介して膵臓の尾部に注射しました。それが室温に達すると、高濃度の基底膜マトリックス中の細胞懸濁液は、ゲル状物質になります。それは注射部位にシールを作成し、任意のセルの漏れを防止、膵臓と接触すると、したがって、それはゲル化します。他の臓器への腫瘍の増殖および転移をライブで監視されています蛍光を使用して動物。 GFPの励起および発光のための適切なフィルターを使用することが重要です。研究者が簡単にヌードマウスでの手順を再現できるように同所移植のための手順は、この記事で詳しく説明しています。このプロトコルの主なステップは、細胞懸濁液の調製、外科的移植、およびin vivoイメージングにおける全身蛍光です。この同所性モデルは、原発性および転移性腫瘍に対する新規治療薬の有効性を調査するために設計されています。

この方法は、注射、げっ歯類のための適切な麻酔、開腹術を介して細胞懸濁液を送達するための細胞懸濁液の調製に焦点を当て、蛍光ヒト膵臓癌細胞の外科的同所移植を記載し、そして蛍光インビボ小動物イメージングの使用。 2と3週間の間に緑色蛍光シグナル（GFP信号）の検出移植後、研究者に開発膵臓癌腫瘍（ 図1）の存在を確認するための視覚的な手がかりを提供する。 図1は、とマウスの三つの画像で構成されていPANC-1 GFP蛍光腫瘍。最初は白色光（ 図1A）下で撮影されます。第2の画像が青色蛍光灯の下で撮影された（励起：455から495 nmのを;発光：513から557 nm）の画像へPANC-1膵臓腫瘍（ 図1B）から放出された緑色蛍光。第三は、の複合体であります第2およびマウス（ 図1C）の本体内腫瘍の位置を示しています。 GFPシグナルを示さない腫瘍を発症しない動物（ 図2）。</...

ここでは、緑色蛍光タンパク質発現膵臓がん細胞（PANC-1 GFP)をBalb-c Ola Hsd-Fox1nuマウスの膵臓に同所的に移植し、腫瘍の進行と転移を評価する手順を紹介します。

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

この手順の全体的な目的は、生体内で非侵襲的にモニタリング可能な蛍光膵がんのマウス正位移植モデルを構築することです。このモデルを用いることで、特定の薬剤が原発腫瘍およびその転移に及ぼす影響を、生体内で非侵襲的に研究することが可能になります。本手法の主な利点は、治療の効果をin situで容易に観察できることです。まず、メーカーの指示に従って、高濃度Matrigelのアリコートを融解させます。次に、各細胞フラスコを5 mLのDPBSで洗浄し、トリプシンを用いて培養細胞を回収します。RPMI培地を添加した後、得られた細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、遠心分離して細胞を回収します。遠心分離後、細胞をバイオセーフティキャビネットに移し、新鮮なDPBS 10 millilitersを加え、緩やかにピペッティングしてペレットを再懸濁します。細胞数をカウントした後、再度遠心分離を行い、氷冷した無血清培地および高濃度基底膜マトリックスであるMatrigelを用いて、細胞懸濁液を50 microlitersあたり3 × 10⁶ cellsの濃度に希釈します。その後、サンプルを緩やかにボルテックスし、氷上に置きます。細胞を移植するために、まず麻酔をかけたマウスの眼に軟膏を塗布し、滅菌ドレープで覆ったヒーティングパッド上に動物を配置します。次に、動物の側腹部をヨウ素で3回洗浄して慎重に消毒し、続いて70% ethanolで3回リンスします。足指へのピンチ刺激に反応がないことを確認後、あらかじめ冷却した18ゲージ針付きの1 mL TBシリンジに、調製した細胞を約200 µL充填します。18ゲージの針を27ゲージの針に交換し、細胞を再び氷上に置きます。次に、腹部の左上腹部にある脾臓の概ねの位置を確認します。ピンセットで脾臓上の皮膚をつまみ、約1 cmの切開を加えてポケットを作成します。次に、脾臓上の平滑筋をつまみ、組織を切断して腹腔内にアクセスします。続いて、脾臓の尾端をそっと掴み、体腔内から引き出します。濡らした滅菌綿棒を用いて、脾臓の端に付着している膵臓を広げ、膵尾を特定します。50 µLの細胞を膵尾部に注入し、その後、ゆっくりと針を膵臓から引き抜きます。移植が成功すると、漏出のない浅い気泡のように見えます。臓器を腹腔内に戻し、筋肉と皮膚で全てを閉じます。次に、6-0縫合糸を用いて切開部を閉鎖します。その後、動物にケトプロフェンを注射し、完全に回復するまで観察します。適切な実験的タイムポイントにおいて、市販の小動物イメージングシステムを用い、麻酔下で生体内の腫瘍増殖をイメージングし、適切な励起および蛍光フィルターを選択します。次に、白色光のみを用いて初期画像を取得します。動物を同じ位置に保持したまま、GFPフィルターに切り替えて2枚目の画像を撮影します。腫瘍の成長を解析するため

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、膵臓がんの発症のために、がん性ドナーから非がん性レシピエントマウスの膵臓に腫瘍断片を同所性に移植するための段階的な外科的方法を説明しています。同所性に移植されたPDACは、従来の皮下(SC)モデルよりも正確にヒトの膵臓がんの組織微小環境を再捕捉できます。...

同所性ホモグラフト腫瘍移植:膵臓腫瘍マウスモデル作製技術

このビデオは、緑色蛍光タンパク質発現膵臓癌細胞をマウスの膵臓に同所的に移植するためのプロトコルを示しています。同所性マウスモデルは、原発性および転移性腫瘍に対する新規治療薬の有効性を調査するのに役立ちます。...

蛍光同所性マウスモデル:がん細胞を発現するGFPをマウスに移植し、腫瘍の進行をin vivoで評価する

このビデオは、局所的な細胞送達のためのマトリゲルと腫瘍進行の非侵襲的モニタリングのためのin...

生物発光性同所性膵臓癌モデルマウス:マウスの癌進行をモニターするための非侵襲的技術

膵臓癌生物学の理解の向上は非常に重要膵臓癌を治療するための良好な治療選択肢の開発を可能にするために必要とされる。このニーズに対応するために、我々は使用して癌の進行の非侵襲的なモニタリングを可能に膵臓癌の同所性モデルを示す...

膵臓癌の進行の生物発光同所性モデル

このプロトコルの目標は、マウスの同所性膵臓腫瘍異種移植片に対して動的コントラスト増強磁気共鳴画像法(DCE-MRI)を適用することです。DCE-MRIは、標的組織の微小血管系を非侵襲的に解析する方法であり、新規治療後の腫瘍の血管反応を評価するのに役立ちます。...

同所膵臓癌マウスモデルのダイナミックコントラスト強化磁気共鳴画像

本研究は、緑色蛍光タンパク質および生物発光シグナルの検出と定量的分子検出技術の統合によって腫瘍負荷を正確に評価するための高度なプロトコルをプリセットする。...

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

マウス由来膵管腺癌細胞株の超音波誘導移植のためのプロトコルを原在腫瘍部位に直接記載する。このアプローチは、注射の2〜4週間以内に超音波スキャンによって検出可能な膵臓腫瘍をもたらし、外科的整形トピック移植と比較して腹壁の腫瘍細胞播種の割合を有意に減少させた。...

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臨床文脈では、局所性膵臓癌の患者は汎膵切除術を受け、続いてアジュバント治療を受ける。ここで報告されるこのプロトコルは、膵臓癌の正体性移植を経て、遠位汎化切欠切術および脾臓摘出術を通じて、ヌードマウスでこの臨床シナリオをモデル化する安全で効果的な方法を確立することを目的としている。...

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膵管腺癌(PDAC)の同系マウス同所性同種移植片は、疾患サブタイプの生物学、表現型、および治療反応を再現します。迅速で再現性のある腫瘍進行により、前臨床試験で広く使用されています。ここでは、これらのモデルを生成するための一般的な方法を示し、同系マウスPDAC培養物を膵臓に注入します。...

膵臓癌モデルへの同系マウス同所性同種移植片

マウスの腫瘍浸潤リンパ球(TIL)をフローサイトメトリーを通じて養子細胞移植に利用する方法について説明します。このプロトコルは、同系膵臓がんマウスモデルにおける腫瘍に対するTILの特異的細胞毒性を検証することを目的としており、膵臓がんの養子細胞療法の開発に関する洞察を提供します。...

膵臓癌マウスモデルにおける腫瘍浸潤リンパ球のフローサイトメトリーに基づく単離と治療的評価

学ぶ蛍光同所性膵がんマウスモデルの構築法。GFP発現PANC-1細胞をBalb-c Ola Hsd-Fox1nuマウスの膵臓に移植し、侵襲を伴わない生体内イメージングで腫瘍進行と転移をリアルタイムに観察する手法を解説します。

膵臓がんの蛍光同所性マウスモデル

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