Name: 親油性ドキソルビシンプロドラッグミセルの調製とキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学ぶ 親油性ドキソルビシンプロドラッグミセルの調製と特性評価法。DOX-PAの合成、薄膜分散法によるミセル形成、薬物封入効率と抗腫瘍活性の評価手順を含む。ナノ医薬品開発の基盤となる技術です。

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この作業は、NIH-SC3助成金、NSF-PREM助成金、ハンプトン大学教員研究助成金によって支援されました。粒子サイズ分析器の使用について、バージニア海洋科学研究所(VIMS)のMichele A. Cochran氏に感謝します。また、原稿を査読してくださったCorinne R. Ramaley夫人にも感謝いたします。

DOX-PAの1の合成<ol><li>ドキソルビシン390mgのパルミチン酸ヒドラジドの243ミリグラムを秤量し、丸底フラスコに移します。 </li><li>ガラスシリンジでフラスコに無水メタノール150mlを追加します。ピペットでトリフルオロ酢酸（TFA）の39μLを加えます。マグネチックスターラーを用いて、暗所で室温で18時間、反応混合物を攪拌します。 注：反応物質の量をスケールアップすることができ、またはダウンDOX-PAの異なる量を得ました。反応体の比率が同じ比率で維持されるべきです。 78 mgの1170ミリグラムの範囲でDOXの量を使用する反応は、通常の化学実験室で行うことができます。 </li><li>シリカゲルカラムを用いてDOX-PAの精製。17 <ol><li>ロータリーエバポレーターで反応混合物中の溶媒を除去します。混合物の体積を約20 mlまで低下した後、シリカゲルを3gを加えます。乾燥粉末を得るために回転蒸発を続行し、トンを可能にするために、シリカゲルへの製品の吸着彼。乾燥粉末が形成された後、さらに30分間真空下でサンプルを保管してください。 </li><li>溶媒としてジクロロメタンを用いてカラムにシリカゲル50gのパック。慎重にカラムに吸着した生成物を含有するシリカゲルのサンプルを追加します。 </li><li>徐々にそれによって溶媒極性（ 表1）を増加させる、メタノールの割合を増加させながら、ジクロロメタンおよびメタノールの混合物でカラムを溶出します。 </li><li>試験管（25ミリリットル/チューブ）における溶離液の画分を収集し、薄層クロマトグラフィー（TLC）によって進行状況を監視します。 </li><li>純粋なDOX-PAを含む全ての画分を合わせ、乾燥粉末が形成されるまで、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去します。さらに真空O / Nの下で生成物を乾燥。 </li></ol></li><li> TLCによるDOX-PAの分析。 <ol><li> TLCプレートの4センチメートル×8センチセクションをカット。スポット試料溶液TLCがMETを使用して毛細血管をスポッティングとプレートの底から0.5センチメートル溶媒としてhanol。 </li><li>ジクロロメタンおよびメタノールの混合物を含有する現像室にTLCプレートを置き（3/1、v / v）でした。溶剤の深さはわずか0.5未満cmでなければなりません。 </li><li>溶媒先端がプレートの上部に到達したときに現像室からプレートを取り外します。鉛筆で溶媒先端の​​位置をマークし、プレートを乾燥させます。サンプルを可視化するために、飽和ヨウ素蒸気を含む染色室にTLCプレートを置きます。 </li></ol></li><li> 1 H核磁気共鳴分光法（1 H-NMR）によるDOX-PAの分析。18 <ol><li>メチルスルホキシド-D6（DMSO）の1ミリリットル中にDOX-PAの15ミリグラムを溶解し、NMRチューブにサンプルを移します。 </li><li> NMR装置の磁石にNMR管を挿入します。溶媒としてDMSOを選択し、プロトンスペクトルを測定します。磁石からのNMRチューブを外します。 NMRの結果18を分析します。 </li></ol></li></ol> 2。フィルム分散法によるDOX-PAミセルの調製<ol><li> DSPE-PEG（40 mg）をDOX-PA（4 mg）を10mlのガラスバイアル中の2mlのメタノールで溶解します。 </li><li>バイアル中の薄膜が形成されるまで、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で有機溶媒を除去。 注：また、膜を形成し、さらに、残留溶媒を除去し、真空デシケーター中でバイアルを維持するために、不活性ガス（ 例えば 、アルゴンまたは窒素）下で有機溶媒を蒸発させます。 </li><li>転写ガラスバイアルにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4の、DPBS）2 mlです。 </li><li>ミセルを生成するために、室温で3分間、超音波浴中でバイアルを置きます。 注：超音波パワーは超音波風呂の異なるモデル間で変化します。薄いポリマー/薬物フィルムを分散させるのに十分な超音波パワーを発生させることができるユニットを選択します。このプロトコルで使用される超音波浴の出力電力は110 Wです。 </li><li>短期記憶のために4℃でミセルを維持し、-20長いため℃〜-termストレージ。 注：また、ミセルはまた、凍結乾燥し、使用前に水で再構成することができます。通常、何の凍結保護剤または凍結保護剤は、この製剤のために必要とされていません。 </li></ol> DOX-PAミセルの3キャラクタリゼーション<ol><li> ミセルおよび薬物封入効率のDOX-PA濃度の決意 <ol><li> 1μg/ mlで、5μgの/ mlで、20μgの/ mlで、50μgの/ mlの、および100μg/ mlの：DOX-PAは、5つの異なる濃度のDOX-PA溶液を調製するため、DMSO中に前の手順で合成し溶解します。 490nmでのUV-VIS分光計でDOX-PAソリューションの吸収を測定します。 DOX-PAの薬物濃度と490nmのそれらに対応する吸収に基づいて標準曲線を生成します。 </li><li> DMSOの500μlの薬物負荷ミセル25μlの希釈します。 UV-VIS分光光度計で490nmの吸収を測定します。 3.1.1で作成した標準曲線を用いて薬物濃度を計算します。 </li><li>以下の式を用いて封入効率を計算します。 薬物封入効率（％）=（ミセル中の薬物の量）/（添加薬剤の量）×100％ </li></ol></li><li> 動的光散乱と粒子サイズの特性（DLS） <ol><li> 1mg / mlの最終DSPE-PEG濃度にDPBS（pH7.4）中でミセルを希釈します。 Z平均寸法及び多分散性指数（PDI）を得るために、粒子サイズ分析器で2mLのサンプルを分析します。 </li></ol></li><li> インビトロでの抗癌活性の評価 注：適切な滅菌技術を使用し、バイオセーフティキャビネット内で動作します。 <ol><li> DU-145ヒト前立腺癌細胞を含む細胞培養フラスコ（ 例えば、T25）から細胞培養培地を除去し、DPBS 2mlの液（pH7.4）で細胞を洗浄します。 </li><li>吸引DPBSを、トリプシン溶液1ml（0.25％）を添加し、細胞を剥離するために、37℃で2分間インキュベートします。 </li><li> 10メートルを追加ほとんどの細胞をフラスコから剥離された細胞培養培地のリットル（RPMI1640培地+ 10％ウシ胎児血清+ 1％抗生物質 - 抗真菌）。 15-ml遠心チューブと遠心分離機5分間千×gで細胞に細胞を移します。 </li><li>細胞培養培地5mlで細胞ペレットを再懸濁し、血球計で細胞数をカウントするサンプルを除去します。 50,000細胞/ mlの濃度に細胞培養培地で細胞を希釈します。 96ウェル細胞培養プレート中に希釈された細胞懸濁液を加える（100μl/ウェル）。細胞接着を可能にするために18時間細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で細胞をインキュベートします。 </li><li>希釈DOXのジメチルスルホキシド、それぞれ0.1μM、0.5μMの最終薬物濃度を得るための（DMSO）溶液と細胞培養培地とDOX-PA DMSO溶液を、2μM、5μM、及び10μM、。 0.5％に上記のすべてのサンプルで最終DMSO濃度を保ちます。最終薬物COを得るために、細胞培養培地を用いてDOX-PAミセルを希釈それぞれ0.1μM、0.5μMのncentrations、2μM、5μM、及び10μM、。ブランクの細胞培養培地にコントロールを使用してください。 </li><li>インキュベーターから96ウェル細胞培養プレートを取り外して、ステップ3.3.5で調製した異なる治療剤を含む培地100μlの細胞培養培地を交換し（各群n = 4）。さらに72時間細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で細胞をインキュベートします。 </li><li>吸引培地、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）の0.5ミリグラム/ mlを含む培地100μlを加えます。 </li><li>さらに2時間、細胞培養インキュベーター中で細胞をインキュベートします。慎重に培地を除去し、ホルマザン結晶を溶解させるために100μlのDMSOを追加します。 </li><li>波長570nmと670nmでの参照波長でマイクロプレート分光光度計で吸光度を測定します。 </li><li>以下の式を用いて細胞生存率を計算します。 <stronグラム&gt;細胞の生存率（％）=（ 試験 / 対照 ）×100％ 注：一元配置分散分析（ANOVA）統計的検定を用いて異なるグループ間での細胞生存率を比較します。薬物濃度データ対細胞生存率に基づいて、IC 50を計算します。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

本研究では、ミセルの調製のための単純、迅速なフィルム分散法を説明します。この方法は、水性環境中でコアシェル構造のミセルを形成する両親媒性ポリマー（ 例えば 、DSPE-PEG）の自己集合特性を利用します。このミセルの調製方法は、いくつかの利点を有します。 1.これは、一般的に、リポソーム、ナノ粒子、およびナノエマルジ ​​ョンの調製に使用される（例えば、押出しまたは均質化のような）複雑なサイズ縮小工程の使用を回避する単純な処方プロセスを伴う。19 2。これは、良好な再現性を持っています。製剤を最適化し、確立された後、優れたバッチ間の一貫性を達成することができます。プロトコルは、超音波処理の強度及び時間のような製造プロセス変数の変動に耐性があります。 （このような透析アプローチまたはエマルジョン溶媒蒸発法など）他の方法は、フィルムの分散ミセルを調製するために利用可能であるが、この方法は、より便利で効率的です。従って、製薬産業におけるミセルの大規模製造における使用のために適合させる大きな可能性を秘めています。この方法の制限は、担体材料の自己組織化特性に依存するので、このような特性を有する材料に限定され...

化学療法は一般に、癌の種々の形態を治療するために使用されます。すべてではないが、ほとんどは、化学療法薬は、より多くの生命を脅かす条件に、このような吐き気や下痢などの管理がマイナー条件と異なる場合があり毒性の副作用を持っています。ほとんどの抗がん剤は毒性があるので、正常組織へのこれらの薬剤の非選択的露光は、必然的に毒性を引き起こします。したがって、選択的に癌細胞に薬物を送達することができる治療的アプローチのための大きい必要性があります。抗がん剤の投与と別の課題は、それらの難水溶性です。通常、可溶化剤は、これらの難溶性薬物を処方するために必要とされます。しかし、ほとんどの可溶化ジメチルスルホキシド（DMSO）、クレモフォールELなどの薬剤、およびポリソルベート80（ツイーン80）は、肝臓と腎臓毒性、溶血、急性過敏性反応や末梢神経障害を引き起こす可能性があります。1ので、安全で、生体適合性の製剤は、のために必要とされています貧しい人々の臨床使用LY可溶性抗癌剤。ナノキャリアは、上記の課題に対処するための薬物送達システムが期待されています。これらのナノキャリアは、リポソーム、2ナノ粒子、3ミセル、4-7ポリマー-薬物コンジュゲート、8および無機材料が挙げられる。9、いくつかのナノ医療製品は、（ 例えば 、ドキシル、アブラキサン、およびGenexol）は癌患者を治療するための規制当局によって承認されています。 10 高分子ミセルは、正常抗癌剤を送達するために使用されているナノスケール薬物送達キャリアを、期待されている。4-7,11,12典型的な高分子ミセルは、自己組織化プロセスを介して両親媒性ポリマーから調製されます。コア - シェル構造化された高分子ミセルは、親水性シェルと疎水性コアを含みます。親水性シェルは、立体的にミセルを安定化し、血流での循環を延長することができます。疎水性コアは、効果的に疎水性Dをカプセル化することができますラグ。そのため、小さなミセルのサイズ（一般的には200nm未満）および長期循環特性により、高分子ミセルは、強化された透過性および保持（EPR）効果（受動的腫瘍標的）を介して腫瘍ターゲッティングを達成すると考えられています。 薬物負荷の安定性は、ミセルの能力を腫瘍ターゲティングのために重要です。最適な腫瘍標的化を達成するために、ミセルは、腫瘍部位に到達する前に、最小限の薬物の漏出を有し、まだすぐにがん細胞を入力した後に薬物を放出すべきです。製剤の安定性は、製品開発の実現可能性、ならびに開発された製品の貯蔵寿命を決定するために加えて、製剤の安定性は、製品開発のための必須要件です。最近、多くの努力は、送達担体への薬物の負荷を改善するためになされています。親油性プロドラッグアプローチは、脂質ナノ粒子及び乳剤に薬物負荷を改善するために検討されている戦略である。13,14 CONJ薬物と脂質のugationは大幅に親油性を向上させ、ナノキャリアの親油性成分でロードと保持を高めることができます。 ここでは、親油性のドキソルビシンプロドラッグロードミセルを調製するためのプロトコルについて説明します。まず、親油性プロドラッグをドキソルビシンの合成手順を説明します。その後、膜分散法を用いてミセルを生成するためのプロトコルが導入されます。この方法は、正常に我々の以前の研究で使用されてきた。それは、正常ミセル薬物送達のために使用されているため、5 DSPE-PEGは、ミセルを調製するための担体材料として選択した。15,16最後に、我々は、ミセルを特徴付けるために使用されるいくつかのインビトロアッセイを記載抗癌活性を評価するための製剤および。

<table><tbody><tr><td>DSPE-PEG2K</td><td>Cordenpharm</td><td>LP-R4-039</td><td>>95%</td></tr><tr><td>ドキソルビシン</td><td>LCラボラトリーズ</td><td>D-4000</td><td>>99%</td></tr><tr><td>パルミチン酸ヒドラジド</td><td>TCIアメリカ&nbsp;&nbsp;</td><td>P000425G</td><td>>98.0%</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>ACROS有機物</td><td>610981000</td><td>無水</td></tr><tr><td>塩化メチレン&nbsp;</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>D151-4</td><td>99.90%</td></tr><tr><td>メチルスルホキシド-d6</td><td>ACROS Organics</td><td>AC320760075</td><td>NMR溶媒</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸&nbsp;</td><td>アクロスオーガニックス</td><td>AC293811000</td><td>99.50%</td></tr><tr><td>シリカゲル</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>L-7446</td><td>230-400メッシュ</td></tr><tr><td>ベイカーフレックスTLCプレート</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td></td><td></td>NC9990129</tr><tr><td>DPBS</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DU 145&nbsp;前立腺がん細胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-81</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>ACROS Organics</td><td>158990050</td><td>98%</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>MEDIATECH INC&nbsp;</td><td>10041CV</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー&nbsp;</td><td>15240062</td><td>100x ストック溶液</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>LIFE TECHNOLOGIES&nbsp;</td><td></td><td></td>10437077</tr><tr><td>核磁気共鳴分光</td>法 <td>Varian, Inc</td><td></td><td>300 NMR&nbsp;</td></tr><tr><td>B&uuml;chi R-3 ロタバポ</td>ブ<td>チ</td><td>1103022V1&nbsp;</td><td>ロータリーエバポレーター</td></tr><tr><td>超音波浴</td><td>ブランソン・ウルトラソニックス・コーポレーション&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CPX952318R 紫外可視分光器 Biomate 3</td><td>Thermo Spectronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS90&nbsp;</td><td>Malvern Instruments</td><td></td><td>Particle Size Analyer</td></tr><tr><td>Microplate Spectrophotometer&nbsp;</td><td>リオ・ラッド</td><td>・ベンチマーク・プラス&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>Napco</td><td>CO2 6000</td><td></td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot&nbsp;</td><td>Systatソフトウェア株式会社</td><td></td><td>分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレート</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&nbsp; 0.25%</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

親油性ドキソルビシンプロドラッグミセルの調製とキャラクタリゼーション

Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles

Micellesは、抗がん剤の送達に成功裏に使用されています。両親媒性ポリマーは、自己組織化により水性環境でコアシェル構造のミセルを形成します。ミセルの疎水性コアは、薬物の貯蔵庫として機能し、疎水性薬物をカプセル化します。親水性シェルは、ミセルの凝集を防ぎ、生体内でのミセルの全身循環を延長します。このプロトコルでは、ドキソルビシン親油性プロドラッグであるドキソルビシン-パルミチン酸(DOX-PA)を合成する方法について説明し、ミセルへの薬物負荷を強化します。pH感受性ヒドラゾンリンカーを使用して、ドキソルビシンを脂質と結合させ、がん細胞内での遊離ドキソルビシンの放出を促進しました。合成したDOX-PAをジクロロメタン/メタノールを溶離液としてシリカゲルカラムで精製しました。精製したDOX-PAを薄層クロマトグラフィー(TLC)および1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy(1H-NMR)で分析しました。DOX-PAを装填したDSPE-PEGミセルを作製するために、フィルム分散法を用いた。さらに、DOX-PA濃度およびカプセル化効率の決定、粒子サイズおよび分布の測定、ならびにin vitro抗癌活性の評価を含む、ミセル製剤を特徴付けるためのいくつかの方法について説明する。このプロトコルは、薬物負荷ミセルの調製と特性評価に関する有用な情報を提供し、したがって、新しいミセルベースのがんナノメディシンの研究開発を促進します。

図1は、DOX-PAの合成スキームを示します。 DOX-PAは、pH感受性ヒドラゾン結合を通してドキソルビシンとパルミチン酸の結合により合成しました。パルミチン酸ヒドラジドのわずかに過剰に反応の完了を促進するために使用されました。この反応方法は、非常に高い効率およびドキソルビシンの少量は18時間の反応（ 図2）の後に残っています。収率は約88％でした。反応の終わりに、DOX-PAは、シリカゲルカラムを用いて精製し、純粋な赤色の固体生成物を得ました。 DOX-PAは、精製されたDOX-PA（ 図2）のための単一のスポットを示したTLCで分析した。 図3は、DOX-PAの1 H-NMRスペクトルを示す図 。ドキソルビシンおよびパルミチン酸の両方の特性NMRピークは、さらに結合反応の成功が確認され、観察されました。 <p class="jove_content" fo:keep-...

親油性のドキソルビシンプロドラッグの調製および特徴付けのためのプロトコルは、1,2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- Nロード- [アミノ（ポリエチレングリコール）-2000]の（DSPE-PEG）ミセルが記載されています。

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous ...

本プロトコルの全体的な目的は、親油性ドキソルビシンプロドラッグを封入したミセル製剤の調製および特性解析の手順を記述することです。この手法は、ミセル製剤化のための簡便で信頼性の高いアプローチを提供します。ドキソルビシンの親油性プロドラッグを合成することで、薬物封入量と安定性を向上させることができ、これによりミセル製剤の開発における重要な課題を解決することが可能です。ミセル製剤は腫瘍への薬剤標的化能を高めることができ、その結果、がん治療における毒性を軽減させることが可能です。本プロジェクトで述べる応用に加え、この技術は他の薬剤のナノ医薬品を調製するためにも利用できます。親油性ドキソルビシン前駆薬DOX-PAを合成するには、ドキソルビシン390 mgとパルミチン酸ヒドラジド243 mgを量り取り、丸底フラスコに移します。ガラス製シリンジを用いて、フラスコに無水メタノール 150 milliliters を加えます。次に、ピペットを用いてトリフルオロ酢酸（TFA） 39 microliters を加えます。マグネチックスターラーを使用し、反応混合物を室温・遮光条件下で 18 hours 撹拌します。シリカゲルカラムを用いてDOX-PAを精製するには、まずエバポレーターで反応混合物中の溶媒を除去します。混合物の容量が約20 millilitersまで減少した後、3 gramsのシリカゲルを加えます。さらにエバポレーターでの濃縮を続け、製品をシリカゲルに吸着させ、乾燥粉末を得ます。乾燥粉末が形成された後、さらに30分間サンプルを真空下に保持します。ジクロロメタンを溶媒として、シリカゲル50 gramsをカラムに充填します。生成物が吸着したシリカゲルサンプルを注意深くカラムに添加します。ジクロロメタンとメタノールの混合液を用いてカラムを溶出し、メタノールの割合を徐々に高めることで溶媒の極性を上昇させます。溶出液を1本あたり25 millilitersずつ試験管に分取し、薄層クロマトグラフィー（TLC）で進行状況を確認します。純粋なDOX-PAを含むすべての分画を合わせ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、粉末状になるまで乾燥させます。製品を真空下で一晩さらに乾燥させる。ミセルを調製するには、10 mLのガラスバイアルに40 mgのDSPE-PEGと4 mgのDOX-PAを2 mLのメタノールで溶解させる。ロータリーエバポレーターを用いて真空下で有機溶媒を除去し、バイアル内に薄膜が形成されるまで乾燥させる。次に、pH 7.4のDulbecco's phosphate buffered salineを2 mL、ガラスバイアルに移します。薄いポリマー薬物フィルムを分散させるのに十分な超音波出力を生成できる超音波洗浄機を選択してください。本プロトコルで使用した超音波洗浄機の出力は110 wattsです。バイアルを室温で3分間超音波洗浄機にかけ、ミセルを生成させます。短期間の保存の場合は4 °Cで、長期間の保存の場合は-20 °Cでミセルを保持してください。ミセルの調製後、ミセル中の薬物濃度、粒子径、およびin vitroでの抗がん活性を決定するために、さまざまな特性評価を行います。DOX-PA濃度および薬剤封入効率を決定するために、薬剤封入ミセル 25 µLを500 µLのDMSOで希釈します。UV-VIS分光光度計を用いて490 nmにおける吸光度を測定し、テキストプロトコルに記載されている通りに薬剤濃度および封入効率を算出します。in vitro抗がん活性を評価するために、希釈した細胞懸濁液を96ウェル細胞培養プレートに1ウェルあたり100 µLずつ分注します。細胞を細胞培養インキュベーターで18時間インキュベートし、細胞を接着させます。次に、DOX DMSO溶液およびDOX-PA DMSO溶液を細胞培養培地で希釈し、最終的な薬剤濃度にします。すべてのサンプルにおいて、最終的なDMSO濃度を0.5%に維持してください。その後、DOX-PAミセルを細胞培養培地で希釈し、最終的な薬剤濃度にします。ブランクの細胞培養培地をコントロールとして使用します。96ウェル細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、細胞培養培地を、異なる処理剤を含む100 microlitersの培地と交換します。細胞を細胞培養インキュベーターでさらに72時間インキュベートします。次に、培地を吸引し、0.5 mg/mLのMTTを含む培地100 µLを加えます。細胞を細胞培養インキュベーターでさらに2時間インキュベートします。培地を慎重に除去し、フォルマザン結晶を溶解させるためにDMSO 100 µLを加えます。マイクロプレート分光光度計を用いて、波長570 nanometers、参照波長670 nanometersで吸光度を測定します。最後に、テキストプロトコルに記載されている方法で細胞生存率を算出します。DOX-PAの合成スキームをここに示します。パルミチン酸は、pH感受性ヒドラジンリンカーを介してドキソルビシンに結合されています。DOX-PAの構造は、プロトンNMRスペクトルによってさらに確認されました。ドキソルビシンとパルミチン酸の両方に由来する特徴的なNMRピークが観察されます。アルファベットはピークおよび構造内の対応する部分を示している。薬剤を含まない空のDSPE-PEGミセルは透明な液体として現れるが、DOX-PA DSPE-PEGミセルはミセルに封入されたDOX-PAに起因して赤色の液体として現れる。空のDSPE-PEGミセルの平均粒子径は約17.0 nanometersである。DOX-PAの封入によりミセルの粒子径はわずかに増加し、DOX-PA DSPE-PEGミセルの平均粒子径は約25.7 nanometersとなりました。DU145細胞を遊離ドキソルビシン、遊離DOX-PA、またはDOX-PAミセルで処理することにより、濃度依存的な細胞生存率の低下が認められました。低濃度では遊離ドキソルビシンの方が遊離DOX-PAやDOX-PAミセルよりも効果的でしたが、高濃度ではDOX-PA群の方が遊離ドキソルビシンよりも細胞生存率をより大きく低下させました。また、高濃度および低濃度のいずれにおいても、DOX-PAとDOX-PAミセルとの間に有意な差は見られないようです。このビデオを視聴することで、フィルム分散法を用いてミセル処方を調製する方法を十分に理解できたはずです。ここで説明した手法は、異なる薬剤やキャリア材料を用いたミセルの調製にも適用できることを覚えておいてください。製剤性能を向上させるには、キャリア材料の設計が極めて重要です。本手順に従い、ミセル製剤を動物腫瘍モデルを用いてin vivoでさらに評価し、抗がん活性を検証することができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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私たちは、自己組織化ナノ構造をコアに含む脂質粒子の速度論的安定化のためのカーボンナノチューブのスマートな応用について報告します。脂質粒子の調製には、かなり低濃度のカーボンナノチューブが必要であり、薬物送達などの生物医学的用途での使用が可能です。...

カーボンナノチューブにより安定化内部自己組織化脂質粒子の簡便な調製

メトキシポリエチレングリコール（MPEG-B -PPheGE）のフェニルグリシジルエーテル（PheGE）のリビングアニオン重合の重要なステップが記載されています。得られたブロック共重合体ミセル（のBCM）は、生理学的に関連する条件が得られた下で4日間にわたってドキソルビシン14％（重量％）と薬物の徐放を装填しました。...

π-πスタッキング相互作用によって安定化されたブロック共重合体ミセルの調製のための両親媒性共重合体のアニオン重合

高い特異性で副作用を軽減して腫瘍部位に抗がん剤を送達するためには、ナノ粒子に基づく新しい方法が必要です。ここでは、過酸化水素を介した酸化によって容易に調製でき、還元腫瘍環境下で効率的に解離してペイロードを放出できるジスルフィド架橋ミセルについて説明します。...

リバーシブルジスルフィド架橋ミセルの生産のための簡便かつ効率的なアプローチ

液晶ナノ粒子（LCNP）ナノキャリアは、生細胞の原形質膜に疎水性の貨物の制御送達のためのビヒクルとして利用されます。...

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

住セルイメージ投射はダイナミックなプロセスを可視化する強力なツールです。固定セルの検討プロセスについての混乱と誤解につながることができます、静的画像のみを提供します。この作業は、吸収、薬物放出と細胞内リポソーム型ナノ粒子の細胞内局在性を調査する手法を示します。...

体外配信生細胞イメージング化学療法を探求する脂質ナノ粒子によってを使用してください。

このプロトコルは、サンプル抽出の効率的かつ便利な分析プロセスと心肺毒性 DOX 代謝物、生物学的に doxorubicinol (DOXol)、マイトマイシン C (MMC)、ドキソルビシン (DOX)...

サンプル抽出、ドキソルビシン、マイトマイシン C 以下の組み合わせへのドラッグデリバリー ナノ粒子の担癌マウスの同時のガスクロマトグラフィーによる定量

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生体活性親水性球状タンパク質の捕捉に対するナノリポソームの調製と特性解析

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リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

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標的薬物送達のためのドキソルビシンを装填したアプタマー-PEI-G-PEG改変金ナノ粒子の合成

学ぶ 親油性ドキソルビシンプロドラッグミセルの調製と特性評価法。DOX-PAの合成、薄膜分散法によるミセル形成、薬物封入効率と抗腫瘍活性の評価手順を含む。ナノ医薬品開発の基盤となる技術です。

親油性ドキソルビシンプロドラッグミセルの調製とキャラクタリゼーション

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