ハイスループット遺伝子タギングで

この手法の全体的な目的は、Trypanosoma bruceiのタンパク質を高スループットにタグ付けすることです。この手法は、キネトプラスト類の研究分野において、大量のタンパク質の局在や潜在的な機能に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、多数のタンパク質を迅速かつ容易に並行してタグ付けできることです。

この手法で局在化に関する知見を得ることができますが、他のタグを用いることで、大規模なタンパク質群の相互作用を調べることも可能です。例えば、Bio-ID近接標識実験のためのBirAタグなどが挙げられます。ここからは、当研究室のリサーチアシスタントであるRoss Maddenが、その手順を実演します。

本手順を開始する前に、96ウェルPCRクーラーを-80°Cのフリーザーで予冷しておきます。10mLチューブに、蒸留脱イオン水 100µL、PCRグレードDMSO 105µL、10mM dNTPs 105µL、およびpPOTテンプレート 105µLを合わせて、マスターミックスAを調製します。

Master Mix Aを試薬リザーバーに注ぎ、96ウェルPCRプレートの各ウェルにMaster Mix Aを23 µLずつ分注します。P20 12チャンネルマルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに100 µMのプール済みプライマーを2 µLずつ加えます。プレートをフィルムで密封します。

あらかじめ冷却したPCRクーラーに置き、-80 °Cで最低20分間凍結させます。PCR Master Mix Aを凍結させることは、特定のホットスタートポリメラーゼを使用する場合であっても、効率的なホットスタート反応を確実にするために不可欠です。これにより、再現性の高い高収量の増幅が可能になります。

PCRプレートをフリーザーに入れている間に、マスターミックスBを調製します。10 mLチューブに、蒸留脱イオン水 2,048 µL、10Xバッファー 525 µL、およびポリメラーゼ 52.5 µLを混合し、1プレートあたり合計 2,626 µLにします。-80 °CフリーザーからPCRプレートとPCRクーラーを取り出します。

プレートをPCRクーラーに置いたまま、各ウェルの凍結したMaster Mix Aの上にMaster Mix Bを25 µLずつ迅速に加え、総反応量を50 µLにします。この操作は時間が重要であり、Master Mix Aが融解する前に完了させる必要があります。その後、フィルムでプレートを密封します。

サーマルサイクラーを次のように設定します。94 °Cで10分間、続いて94 °Cで15秒、65 °Cで30秒、72 °Cで2分間のサイクルを30回繰り返し、最後に72 °Cで7分間の最終伸長反応を行います。ブロックが94 °Cに達した後、PCRプレートをサーマルサイクラーにセットし、増幅プログラムを開始します。

まず、Tris-酢酸 EDTAまたはTAE電気泳動バッファーを用いて、4列のウェルを持つ大きな1%アガロースゲルを調製します。各列の1番目と28番目のウェルに、1 kb DNAラダーをロードしてください。次に、ここに示すパターンに従い、PCR産物2 µLを、DNAロードバッファーを添加せずに各レーンに直接ロードします。

例えば、PCRプレートのA列およびB列のPCR産物を、ゲルの1行目の奇数番目と偶数番目のレーンにそれぞれロードします。アンプリコンのコンタミネーションの可能性を低減するため、迅速に作業を行い、PCRプレートのA列のPCR産物をゲルの1行目の奇数番目のレーンにロードします。次に、PCRプレートのB列のPCR産物をゲルの1行目の偶数番目のレーンにロードします。

同様のパターンを用いて、PCRプレートのC行およびD行のPCR産物をロードします。ゲルの2行目において、C行を奇数番目のレーンに、D行を偶数番目のレーンにロードしてください。PCRプレートのすべてのウェルがゲルにロードされるまで、このロードパターンを繰り返します。ゲルを電気泳動槽に入れ、ゲルが浸るまでTAE泳動バッファーを注いでください。

100 Vで30分間電気泳動を行います。UVトランスイルミネーターを用いて可視化します。ここでは代表的な96ウェルPCRバリデーションアガロースゲルを示しており、96個のPCRのうち95個が成功しています。

PCRに失敗したのはH11でした。この手順では、Trypanosoma bruceiのプロサイクリック型細胞株SMOXP9を使用します。プロトコルの本文に従い、細胞を適切な密度まで増殖させ、800 ×gで10分間の遠心分離により必要な数の細胞を回収します。

細胞を遠心分離している間に、エレクトロポレーションの準備を開始します。プレートハンドラーをエレクトロポレーターに接続します。エレクトロポレーター本体で、電圧を1,500 voltsに、パルス幅を100 microsecondsに、パルス数を12回に、パルス間隔を500 millisecondsに設定します。

プレートハンドラーで、パルス数を1に設定します。P200 12チャンネルマルチチャンネルピペットを使用して、PCR反応液をPCRプレートから96ウェル使い捨てエレクトロポレーションプレートに転移させます。細胞を10 mLの修飾cytomixで洗浄し、再度800 ×gで10分間遠心分離します。

細胞を 23 mL の修飾 cytomix に再懸濁し、最終濃度を 5 × 10⁷ cells/mL に調整します。細胞懸濁液を試薬リザーバーに移します。エレクトロポレーションプレートの各ウェルに細胞溶液を 200 µL ずつ分注し、ピペッティングにより PCR 産物と混合します。

ショート回路を防ぐため、ティッシュを使用してプレート上部の水滴を取り除きます。エレクトロポレーションプレートの上部にシーリングフィルムを貼り付けます。この際、各列の上下にある電極用の穴が開いたままになるように配置してください。フィルムのガイドとして使用される凸部分は覆わないようにしてください。

エレクトロポレーションプレートをプレートハンドラーにセットし、蓋を閉じます。エレクトロポレーターユニットの「pulse」ボタンを押します。エレクトロポレーション後、細胞を回復させるため、1ウェルあたり1 mLのSDM-79培地を含む4枚の24ウェル組織培養プレートに速やかに移してください。

P200 12チャンネルマルチチャンネルピペットを使用し、チップを1本おきに外して、残りの6本のチップが24ウェル組織培養プレートの6行と一致するようにします。細胞を96ウェルプレートから24ウェルプレートへ移したあと、24ウェルプレートの対応するウェルの培地を用いて、96ウェルプレートのウェルを洗浄します。その後、洗浄液を24ウェルプレートのウェルに戻します。

エレクトロポレーション済みの細胞を、96ウェルエレクトロポレーションプレートから、ここに示す所定のパターンに従って24ウェル組織培養プレートへ移します。例えば、96ウェルプレートの行Aの奇数番目のウェルの細胞はプレートAの行Aへ、行Aの偶数番目のウェルの細胞はプレートCの行Aへと移します。96ウェルプレートから24ウェルプレートへ細胞を移した後は、対応する24ウェルプレートの行の培地を用いて96ウェルプレートのウェルを洗浄し、その洗浄液を24ウェルプレートに戻します。

細胞を24ウェルプレートに分注する作業は煩雑ですが、得られた細胞株を正しい遺伝子IDと正確に照合できるようにしなければなりません。細胞の健全性を維持するため、この工程は迅速に行うことが極めて重要です。エレクトロポレーション後のすべての細胞を4枚の24ウェルプレートに分注した後、プレートを密閉可能な蓋付きの清潔なプラスチック製ボックスに入れます。そのボックスを28 °Cのインキュベーターに入れます。

6〜8時間後、選択的抗生物質を含む10% FCS添加SDM-79を各ウェルに1 mLずつ加えます。形質転換細胞株が視認できるようになるまで、28 °Cで9〜10日間インキュベートします。96種類の異なるタンパク質の末端をタグ付けするための96ウェル・トランスフェクション後、細胞を回復および選択のために24ウェル組織培養プレートに移行させます。

その後、各ウェルを評価し、薬剤耐性を持つ健康な細胞が含まれているかを確認します。健康なウェルには、位相差顕微鏡で明るく見える活性の高い細胞が主に含まれています。この例示的な概略図では、緑色はトランスフェクションが成功したウェルを、灰色は死細胞のみが含まれるウェルを表しています。

15日間の選抜後、96ウェルのうち88ウェル（92%）で寄生虫の導入成功が確認されました。習熟すれば、細胞のカウントからエレクトロポレーション後の播種まで、約1時間で完了します。この手順を行う際は、導入から6〜8時間後に選択薬剤を添加することを忘れないようにしてください。

このビデオを視聴することで、Trypanosoma bruceiにおける大規模なタンパク質コホートのタグ付け方法について十分に理解することができます。