ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活Microbiomeの共培養
2016年8月30日
私たちは、人間の腸オンチップmicrophysiologicalシステムを使用して長期間のためのin vitroプロトコルへの共培養腸microbiomeと腸絨毛を説明します。
このプロトコルの全体的な目標は、腸内チップマイクロ流体デバイス内で蠕動運動のような動きと流れの下でヒト腸細胞の絨毛成長を実証すること、およびこれらの細胞を生きた腸内細菌叢と共培養する方法を示すことです。したがって、この方法は、消化器病学、臨床微生物学、および薬学の分野における重要な問題に取り組み、疾患メカニズムを特定し、新薬化合物の有効性と毒性を検証するのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者がマイクロ生理学的システムを使用して、in vitroでヒトの生体腸の生存可能で機能的なポストマイクロバイオームエコシステムを確立できることです。
この技術の意味は、潰瘍性大腸炎やクローン病などの疾患にまで及ぶ可能性があり、宿主細胞とマイクロバイオームの安定した共培養は、これらの疾患の複雑さを模倣することができるためです。この方法は、腸内細菌叢と腸内の免疫系との間の複雑な相互作用についての洞察を提供することができますが、皮膚、生殖管、口腔など、宿主微生物の相互作用がある他の臓器系にも適用できます。まず、付属のテキストプロトコルで説明されているように、Gut-on-a-Chipマイクロ流体デバイスを準備します。
このデバイスは、2つの平行なマイクロチャネルを含む透明なガス透過性シリコンポリマーで構成され、柔軟な多孔質PDMSメンブレンによって分離されています。チャネルの両側には真空チャンバーがあり、これを使用して周期的な機械的ひずみを加えることができます。1ミリリットルのシリンジを使用してデバイスを滅菌し、チャネルに70%エタノールを流します。
次に、デバイスを摂氏60度のドライオーブンで一晩乾燥させます。翌日、Gut-on-a-Chipマイクロシステムとそれに接続されているチューブを、UV光とオゾンに同時に40分間さらします。バイオセーフティキャビネットの紫外線の下に15分間留まりながら、デバイスを冷却します。
次に、100マイクロリットルの細胞外マトリックスコーディング溶液を1ミリリットルの注射器に装填し、デバイスの上部マイクロチャネルに分注します。このプロセスを繰り返して、下部のマイクロチャネルもコーティングします。セットアップ全体を摂氏37度加湿5%CO2インキュベーターに1時間置きます。
インキュベーション中、脱ガスにより、50ミリリットルのろ過システム内の0.45ミクロンフィルターに1分間通すことにより、全培地を予熱しました。ろ過した媒体を1分間軽くたたいて、媒体内の気泡や溶存ガスを取り除きます。次に、脱気した完全な培地を2つの3ミリリットルの使い捨て注射器に移し、注射器を1時間インキュベー
トします。次に、シリンジをGut-on-a-chipの上部と下部のマイクロチャネルに接続し、完全な培地を上部と下部のマイクロチャネルに穏やかなパルスで流すことでコーディング溶液を洗い流します。次に、シリンジポンプを使用して、脱ガスした完全細胞培養培地を装置の上部マイクロチャネルに流し、チップを摂氏 37 度、CO2 5% で一晩インキュベートします。まず、Caco-2 腸上皮細胞を含む完全にコンフルエントな T75 フラスコを採取します。まず、10 ミリリットルのカルシウムおよびマグネシウムを含まない PBS で細胞をすすぎます。
次に、PBSを吸引し、すすぎをさらに2回繰り返します。次に、0.05%トリプシン-EDTA溶液を1ミリリットル加え、フラスコを摂氏37度で5分間インキュベートします。分離したら、10ミリリットルの予熱した全細胞培養培地を加え、細胞懸濁液を3〜5回上下にピペットで動かしてから、遠心チューブに移します。
細胞懸濁液をスピンダウンします。次に、上清を取り除き、予め温めた完全な培地で150, 000細胞/センチメートルの二乗で細胞を再懸濁します。500マイクロリットルの細胞懸濁液を、25ゲージ、5/8インチの針を備えた1ミリリットルの使い捨て注射器に引き出します。
次に、100マイクロリットルの細胞懸濁液を出口チューブを介して上部マイクロチャネルに分注します。次に、バインダークリップを使用して、上部と下部のマイクロチャネルに接続されているすべての入口と出口をクランプします。全セットアップを1時間インキュベートして、腸上皮細胞が多孔質膜の表面に付着できるようにします。
次に、クランプを取り外し、上部チャネルチューブをシリンジポンプにセットされた培地充填シリンジに接続します。無傷の単層からの細胞まで、毎時30マイクロリットルで上部マイクロチャネルへの培地の流れを再開します。細胞が単層を形成したら、下部チャネルを2番目のシリンジに接続し、培養培地を上部内腔と下部毛細管の両方のマイクロチャネルに毎時30マイクロリットルの同じ流量で灌流します。
チップに蠕動運動のような動きを作り出すには、まず真空ポンプをオンにします。デバイスの真空チャンバーをステンレス鋼コネクタ付きのチューブを介して真空コントローラーに接続します。次に、0.15 ヘルツの周波数で平均細胞ひずみの 10% の周期符号伸張運動を提供するようにコントローラーを設定し、[開始] をクリックします。
機械的変形の存在下で、培地を上部と下部の両方のマイクロチャネルに流し続け、絨毛の成長を誘発します。オートクレーブ滅菌乳酸桿菌MRSブロスと強化クロストリジウム培地の50/50混合物を準備します。次に、凍結乾燥したプロバイオティクス細菌混合物を10ミリリットルの混合物に再懸濁します。
混合物の光学密度を600ナノメートルで測定し、最終的なセル密度を約0.2光学密度単位に調整します。調整した微生物細胞懸濁液の3ミリリットルを使い捨ての10ミリリットルの滅菌チューブに分注します。アリコートを嫌気性容器に入れ、嫌気性ガス発生小袋を2パック容器に入れます。
容器の蓋をしっかりと閉め、インキュベーターで一晩振とうせずに容器のセットアップをインキュベートします。次に、脱ガスした抗生物質を含まない細胞培養培地を調製し、3ミリリットルの使い捨てシリンジにロードします。マイクロエンジニアリングされた絨毛を含む腸チップデバイスをバイオセーフティキャビネットに移します。
デバイスの上部と下部のマイクロチャネルに接続されているシリンジを取り外し、脱ガスされた抗生物質を含まない細胞培養培地を含むシリンジと交換します。終了したら、デバイスをCO2インキュベーターに戻します。次に、抗生物質を含まない培地をデバイスに12時間流し込み、マイクロバイオームを装着します。
次に、培養済みのプロバイオティクス細菌細胞混合物をスピンダウンします。上清を吸引し、抗生物質を含まないDMEMに細菌を再懸濁します。.この細胞懸濁液の約100マイクロリットルを、25ゲージ、5/8インチの針に取り付けられた1ミリリットルの注射器にロードします。
以前は無菌だった腸絨毛を含むマイクロチャネルの内腔側に細菌を注入します。チューブをクランプして、微生物細胞が腸絨毛の頂端表面に1時間半流れなく付着するのを待ちます。次に、予め加温した抗生物質を含まない培地を、毎時40マイクロリットルで上部と下部の両方のマイクロチャネルに灌流し、周期的なリズミカルな変形を伴います。
この共培養プロトコルにより、絨毛間空間における複数種のプロバイオティクス細菌の安定したコロニー形成が可能になります。生存可能な細菌マイクロコロニーは、共培養で最大2週間維持できます。ここに示されているのは、GFP標識大腸菌と腸絨毛の両方からなる異なる共培養物です。
高倍率の倍率は、72時間の時点での細菌のマイクロコロニーの位置を明確に示しています。この手順を試みる際には、培養の初期段階で上皮細胞単層を損傷しないように、培地をマイクロ流体チャネルに穏やかかつゆっくりと注入することを覚えておくことが重要です。この方法に基づいて、ヒト免疫細胞との共培養法は、マイクロバイオームが免疫系とどのようにクロストークし、腸の最適な健康状態の恒常性に影響を与えるかという点で、いくつかの手がかりを与えることもできます。
このビデオを見れば、ヒトの腸の微小環境を再構成する方法と、マイクロバイオームとヒト腸絨毛の間の共培養をin vitroで実証する方法について十分に理解できるはずです。病原菌やヒト細胞を扱う作業は非常に危険ですので、バイオセーフティキャビネット内での作業もお忘れなく。
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概要
本プロトコルでは、ヒト腸管チップ（gut-on-a-chip）微小生理学的システムを用いて、腸内細菌叢と腸絨毛を共培養する方法について解説します。本手法は、蠕動様運動と流れの下で絨毛が成長することを実証することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 消化器病学
- 臨床微生物学
- 薬学
背景
- 腸管における疾患メカニズムの解明。
- 新薬化合物の有効性および毒性の検討。
- 潰瘍性大腸炎やクローン病などの疾患の複雑性の模倣。
- さまざまな器官系における宿主・微生物相互作用の探索。
研究目的
- in vitroで生存可能かつ機能的なポストマイクロバイオームエコシステムを構築すること。
- 腸内マイクロバイオームと免疫系の相互作用に関する知見を提供すること。
- 胃腸疾患の研究を促進すること。
使用した方法
- 腸管オンアチップ（gut-on-a-chip）マイクロ流体デバイスの作製。
- ヒト腸管細胞と生きた腸内細菌叢の共培養。
- 蠕動運動様の動きおよび流れのシミュレーション。
- 絨毛の成長および細菌叢の相互作用のモニタリング。
主な結果
- 共培養システムの構築に成功したこと。
- 模擬条件下での絨毛成長を実証したこと。
- 腸内細菌叢と宿主細胞との相互作用に関する知見を得たこと。
- 胃腸疾患の研究における潜在的な応用可能性。
結論
- ガット・オン・チップ（腸管チップ）システムは、腸内微生物叢の相互作用を効果的にモデル化します。
- この手法は、消化器病学および創薬研究を前進させることができます。
- 今後の研究では、他の臓器系におけるより幅広い応用を検討することが可能です。
よくある質問
産業界への実用的意義
この腸管オンチップ共培養プラットフォームにより、製薬R&Dにおいて、生理的に適切な機械的条件および流動条件下でヒトの宿主・マイクロバイオーム相互作用をモデル化することが可能となり、初期探索段階におけるメカニズム的なリスク低減を支援します。微生物および上皮細胞の生存能を長期間維持することで、本システムは胃腸疾患領域におけるターゲットバリデーションおよびアッセイ開発に予測的な信頼性を提供します。また、従来の細胞培養では再現できなかった動的な管腔・毛細血管界面という、創薬における極めて重要な転換点に対処し、これによりIBD（炎症性腸疾患）およびマイクロバイオーム標的治療薬のポートフォリオの妥当性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 蠕動様条件下での宿主とマイクロバイオームの動的なクロストークをモデル化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 腸絨毛と多種マイクロバイオームの安定した共培養を最大2週間維持することで、生物学的リスク低減を支援する。
- 予測的価値： バリア機能および微生物定着に対する化合物の影響を評価するための疾患関連システムを提供し、リード化合物の同定を促進する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値：絨毛間に位置する安定したマイクロコロニーから、定量的で再現性のある読み取り値を生成し、信頼性の高い化合物スクリーニングを可能にする。
- 運用の価値：制御された流体剪断力と周期的な機械的歪みを用いてホスト・マイクロバイオーム界面の調製を標準化し、アッセイの再現性を高める。
- プラットフォームの価値：他の臓器特異的なホスト・マイクロバイオーム生態系（皮膚、口腔など）に適応可能な、拡張性と再利用性のあるマイクロ流体システムを構築する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：機能的な上皮細胞と生存可能な微生物細胞を長期間の共培養で維持することにより、発見から前臨床研究への橋渡しを行い、トランスレーショナルなバイオマーカーの整合性をサポートします。
- 運用の価値：フローと変形条件下でヒト腸管腔-毛細血管組織界面をシミュレートすることで、リスク調整後の進展判断を可能にします。
- 予測の信頼性：潰瘍性大腸炎およびクローン病に関連するホスト-微生物相互作用をin vitroでモデル化することで、後期の生物学的リスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、標的バリデーションからリード化合物の同定、そして前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれ、特にマイクロバイオームが介在する薬物反応のメカニズム研究を可能にします。
- 探索生物学：生理的フロー下での腸内マイクロバイオームと腸上皮の動的な相互作用をモデル化することで、仮説検証とパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：制御された灌流下での標準的な絨毛形成と絨毛間隙における安定した微生物定着により、アッセイへの即応性を実現します。
- 分析：フローおよびストレッチ条件下での微生物マイクロコロニー形成、上皮の生存能、バリア機能の完全性などの定量的従属変数の測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：IBDモデルなどの疾患関連条件を模倣することで、前臨床への連続性を確保し、バイオマーカーに基づいた検証を支援します。
- 企業内での再利用：腸管以外の多様なホスト・マイクロバイオーム生態系の研究に適応可能なマイクロ生理学的プラットフォームを構築し、クロスプログラムでの有用性を高めます。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ホストとマイクロバイオームの病態生理におけるメカニズム的な曖昧さを低減することで、標的バリデーションにおける予測信頼性を向上させる。
- 運用上の価値：定義された流速（30–40 µL/h）、周期的な伸展刺激（0.15 Hzで10%）、および無菌的な嫌気性接種により、標準化と再現性を確保する。
- 戦略的価値：ヒトに関連したマイクロバイオームのコンテキストにおいて、薬物化合物の早期の有効性および毒性スクリーニングを可能にすることで、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：疾患に関連したモデルの忠実度を通じて、マイクロバイオーム標的薬および胃腸管治療薬候補のリスク調整後の優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- マイクロ流体デバイスの操作、嫌気性細菌の培養、およびフロー条件下での上皮細胞培養に関する専門知識が必要です。
- シリンジポンプ、周期的なストレイン（伸展）用の真空コントローラー、およびマイクロバイオーム調製用の嫌気性ワークステーションなどの装置に依存します。
- 細胞生物学チームと微生物学チームの間で、培地灌流、ストレインパラメータ、および接種タイミングのクロスチーム標準化が必要です。
- 他の臓器系へ拡張する場合、皮膚や口腔粘膜に合わせて上皮細胞の種類やマトリックスコーティングを調整するなどの適応上の検討が含まれます。
- 汚染を防ぐための無菌操作の徹底や、セットアップ時の上皮単層への損傷を避けるための慎重な培地注入など、実用上の制限があります。
バイオファーマに関するよくあるご質問（FAQ）
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Growth of Microengineered Intestinal Villi in the Gut-on-a-Chip Device
3:45
Formation of Microengineered Caco-2 Villi in the Gut-on-a-Chip
5:55
Application of Mechanical Deformations Mimicking Peristalsis-like Motions
6:37
Host-gut Microbiome Co-culture in a Gut-on-a-chip Microdevice
9:07
Results: Emulating the Human Intestinal Host-microbiome Ecosystem
9:44
Conclusion
