Name: ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活Microbiomeの共培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶガットオンチップマイクロ流体デバイスを用いたヒト腸絨毛とマイクロバイオームの共培養法。蠕動運動と流れ下での絨毛成長を再現し、潰瘍性大腸炎やクローン病などの消化器疾患メカニズム解明と薬物開発に貢献します。

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GFP標識大腸菌株を提供してくださったSri Kosuri氏(ハーバード大学Wyss Institute)に感謝します。この研究は、協力協定番号W911NF-12-2-0036に基づく国防高等研究計画局、契約 #HHSF223201310079C に基づく食品医薬品局、およびハーバード大学のWyss Institute for Biologically Inspired Engineeringによって支援されました。この文書に含まれる見解と結論は著者のものであり、陸軍研究所、陸軍研究所、食品医薬品局、または米国政府の公式政策を明示または黙示的に表すものと解釈されるべきではありません。米国政府は、本書の著作権表記にかかわらず、政府の目的で転載物を複製および配布する権限を与えられています。

ガット・オン・チップデバイスの1微細加工注：ガット・オン・チップは、透明、ガス透過性シリコーンポリマー（ポリジ​​メチルシロキサン、PDMS）製のマイクロ流体デバイスである、二つの平行なマイクロチャネルを含む（1ミリメートル幅×150μmの高さ×1センチ長さ）柔軟で区切ら多孔性（細孔径が10μm、気孔する細孔間隔で25ミクロン）PDMS膜5,9。提供の手順以下の腸・オン・チップ（左図1A）を製造します。 <ol><li>ガット・オン・チップ5,9の微細加工手順。 <ol><li> PDMSプレポリマーと硬化剤と混合することにより、未硬化、脱気したPDMSを準備します（15：w / wの1）を、30分間真空デシケーターに入れてください。 </li><li> 30グラムと未硬化の3グラムを注ぎ、SU-8、上部のベースマイクロパターンおよび腸・オン・チップ、それぞれの低いマイクロチャネルを持つ各シリコン型にPDMSを脱気しました。次にlのドライオーブン中で60℃で硬化東4時間。 </li><li>外科用メスを用いてエッジの周りに切断することにより、各シリコン鋳型から上下のPDMS層をデモールド。生検パンチャー（穴の直径2.0ミリメートル）を使用して、6穴（2つの入口、二つの出口、および2つの真空チャンバー）をパンチ。 </li><li>未硬化の10グラムを注ぐことにより、多孔質膜を準備し、円形の柱と柱の配列を含むシラン化シリコンウェハ上にPDMSを脱気（直径が10μm、高さ25μmの）フラットで重ね、PDMS支持層（15シラン化：ワット1を、 /ワット;厚さ1cm）。セットアップに3キロの重量押えを置き、12時間以上60℃でポリマーを硬化させます。 </li><li>慎重にウエハからスラブの隅を持ち上げて、シリコンウエハからPDMS支持スラブに付着した多孔質PDMS膜のセットアップを脱型し、多孔質PDMS膜が完全にウェハから切り離されるまで剥離。 </li><li> PLに多孔質膜側：上位層（1、w / wのPDMS、15）のチャネル側を公開asmaがそれぞれ1分、3秒、のために携帯型コロナ処理機によって生成されます。 </li><li>気泡なしで並列に各ピースを配置することによって多孔質PDMS膜と共形接触の上位マイクロチャネル層のプラズマ処理表面を置きます。 </li><li> 2 PDMS層の不可逆的な結合のために80℃のCO / Nで全体のセットアップをインキュベートします。 </li><li>慎重支持層の隅を持ち上げて、支持層が完全に膜と上層から取り外されるまで剥離することにより、多孔質膜と上層のアセンブリからPDMS支持層をはがし。 </li><li>中空真空チャンバを作るために、微細先端ピンセットを用いて真空チャンバ（メインチャンネルのいずれかの側に位置する2つの室）の上に配置この膜の部分を切り取り。 </li><li>私が説明したように、トップピースと同じように、プラズマに下片に刻まれたチャンネルの側に取り付けられた膜と側面を公開nは1分間1.1.6ステップ。 </li><li>ステレオスコープの下で気泡なしで並列に各ピースを配置することにより、共形接触を有する多孔質膜を有する上部マイクロチャネル層と下層を合わせます。 </li><li>マイクロ流体セルチャネルの横に2つの中空の真空チャンバを含む完全なスケール腸オンチップマイクロ流体デバイスを製造するために80℃のCO / Nで乾燥オーブンで全体のセットアップを治します。 </li></ol></li><li> 90°曲がったステンレス鋼の平滑末端針を介して腸オンチップで下限またはマイクロチャンネルにリンクされている各ポートの入口と出口にチューブを接続します。 </li><li> 90°曲がったステンレス鋼平滑末端針を用いて真空チャンバに連結された穴にチューブを接続します。 </li><li>使い捨て注射器を滅菌を1ml用いて70％（v / v）エタノールを流すことによってマイクロチャネルおよびチューブを滅菌します。 </li><li> 60℃のドライオーブンO / Nでのマイクロチャネルおよびチューブを乾かします。 </li></ol>マイクロエンジンの2.成長ガット・オン・チップデバイスでered腸絨毛<ol><li>ガット・オン・チップマイクロデバイスの5,9上にシード腸上皮細胞（ 例えばのCaco-2BBE）。 <ol><li>前の表面活性化を60℃の乾燥オーブンO / N（ステップ1.5参照）で乾燥した1 mlの滅菌使い捨て注射器を使用して（ステップ1.4参照）、70％（v / v）エタノールを用いて装置を滅菌します。 </li><li>腸オンチップマイクロシステムの完全なセットアップを公開（ すなわち、本体腸オンチップチューブに接続されている）を同時に40分間UV光（波長253.7nm）及びオゾンへ。 </li><li>安全キャビネット（BSC）にUV光の下で15分間、RTでデバイスをクールダウン。 </li><li>使い捨てを使用して、上下のマイクロチャネルの両方に - 私はコラーゲンを50μg/ mlのタイプ、無血清ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中に希釈した300 / mlの細胞外マトリックス混合物の混合溶液 - ECMコーティングの100μLを紹介滅菌1mlシリンジ。 </li><li> Incuba37°Cで全体のセットアップTE 1時間、5％CO 2インキュベーターを加湿。 </li><li>ドガ予め温めた（37℃）の完全培地（DMEM、20％v / vウシ胎児血清（FBS）、100単位/ mlペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシンを50ml、3mlに等分1分間BSCで50mLのろ過装置（孔径0.45μm）を用いて、使い捨て注射器）。 <ol><li>ろ過システムを介して予め温めた培地をパスし、培地中の気泡や溶存ガスを除去するために、1分間のろ過媒体に軽くタップします。 </li></ol></li><li> 3ミリリットル使い捨て注射器に脱気した完全培地のアリコートを置き、37℃でインキュベート1時間、5％CO 2インキュベーターを加湿。 </li><li> 2 3ミリリットルを上下のマイクロチャネルに脱気し、予め温めておいた完全培養培地を含む使い捨て注射器を接続します。 </li><li>容積で、シリンジポンプを使用して、上部マイクロチャネルに脱気し、完全な細胞培養液を流します37°Cで（0.02ダイン/ cm 2での剪断応力に相当）を30μl/ hrの流量は、5％CO 2インキュベータO / Nを加湿しました。 </li></ol></li><li>ガット・オン・チップにおけるマイクロ加工のCaco-2絨毛の形成。 <ol><li> 50と65の間の通路番号でのCaco-2BBE細胞を使用してください。 </li><li> 37°Cで完全培養培地を含むT75フラスコ中で成長したCaco-2細胞は、完全にコンフルエントな細胞を得るために4-5日間、5％CO 2インキュベーターを加湿しました。 </li><li>完全にT75フラスコ中で増殖させたコンフルエントたCaco-2細胞は、その後、細胞を洗浄PBSを吸引するためにPBSフリー2+ の Ca 2+およびMgの10ミリリットルを追加します。二回、この手順を繰り返します。 </li><li> 37°Cで0.05％トリプシン/ EDTA溶液1mlを加え、インキュベートを5分間、5％CO 2インキュベーターを加湿しました。 </li><li>ピペッティングによって、および3〜5回上下（FBS付き）予め温めておいた完全な細胞培養培地10ミリリットルで解離した細胞を再懸濁します。 </li><li> cで細胞懸濁液をスピンダウン5分間、500×gでentrifugation、その後、上清を除去します。 </li><li>デバイスで〜1.5×10 5細胞/ cm 2で細胞密度を調整するために、再び1ミリリットルで予め温めておいた再懸濁完全培地。細胞密度を推定するために、血球計数器を使用してください。 </li><li>上部のマイクロチャネルに接続されたチューブの出口に25 G5 / 8針に取り付けられた1ミリリットルの使い捨て注射器を配置することにより、上部マイクロチャネル（管腔側）に再懸濁させたCaco-2細胞100μlを注入。 </li><li>バインダークリップを使用して、上下のマイクロチャネルに接続されたチューブのすべての入口と出口をクランプ。 </li><li> 1時間37℃で、加湿した5％CO 2インキュベーターで全設定をインキュベートし、多孔質膜の表面に付着したCaco-2細胞を解離可能にします。 </li><li>クランプを外し、細胞は24-36時間、無傷の単層を形成するまで、シリンジポンプを用いて30μlの/ hrでのみ上位マイクロチャネルに培養液の流れを再開します。位相コントラを使用します細胞単層において細胞間結合を確認するため、Tまたは微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡。 </li><li>細胞は単層を形成する場合、30μL/時の同じ流速で両方の上部（ルーメン）と下部（毛細管）マイクロチャネルに培地を灌流。 </li><li>蠕動運動のような動き5,9を模倣する機械的変形の応用。 <ol><li>テンション装置を搭載した真空ポンプの電源を入れます。 </li><li>ステンレス製のコネクタとチューブを介して真空コントローラに真空チャンバーを接続します。 </li><li>真空制御ソフトウェア上の巡回正弦関数モードで0.15ヘルツの周波数で10％、平均細胞株の伸縮運動を設定し、「スタート」をクリックします。 </li></ol></li><li> 〜100時間のための機械的変形の下でコンフルエントのCaco-2単層に上下マイクロチャネルにおける培地の一定流量（30μL/時）（10％、0.15 Hz）を維持します。 注：たCaco-2細胞はSPONtaneously上皮マイクロチャネル5,8-10の内腔に向かって延長起伏3Dの突起と絨毛の形態形成を受けます。 </li></ol></li><li>記載されているように腸オンチップ10におけるルーメン毛細血管組織界面で生きている人間の腸の器官レベルの機能をエミュレートするには、手順に従ってください。 <ol><li> 2.1から2.2までの手順を繰り返して、マイクロ加工のCaco-2絨毛を成長させます。 </li><li>予熱した共培養培地フロー（完全なCaco-2細胞培養培地と完全HMVECを培地の混合物、1：1 v / v）を30μL/時間で上下マイクロチャネルへ。 </li><li>解離した正常なヒト毛細血管の微小血管内皮細胞の100μlの紹介（HMVECを、最終細胞密度を、〜5.0×10 5細胞/ cm 2）2.2.3から2.2.9までの手順で説明する同一の方法により、低いマイクロチャネルへ。 </li><li>硬化した長方形のPDMSピースを置きます（0.5センチメートルのx 1センチメートルのx 1センチメートル;幅×長さ×高さ; 15：1、ワット/ワットエラストマー：硬化剤））腸オンチップデバイスの上に、その後、逆さま全体のデバイスのセットアップを反転（ すなわち、上側のマイクロチャネルは、マイナス面に面しており、下側のマイクロチャネルは、上方に向いています。 </li><li>解離したHMVECをが低いマイクロチャンネル内での多孔質膜の表面に付着することを可能にするために1時間、37℃、加湿5％CO 2インキュベーターでセットアップをインキュベートします。 </li><li> CO 2インキュベーターから全体のセットアップを取り出し、再び上でセットアップを反転させます。 </li><li>予熱共培養培地フロー（完全なCaco-2細胞培養培地と完全HMVECを培地の混合物、1：1 v / v）の機械的伸張運動と30μL/時間（時上側と下側のマイクロチャネルの両方に10％、0.15 Hz）で内皮単層の細胞間接合を形成するために、少なくとも3日間。 </li></ol></li></ol>ガット・オン・チップマイクロデバイス3.ホスト腸Microbiome共培養<ol><li>前培養Oを実行F細菌細胞をマイクロ加工腸絨毛上に同時培養共生腸microbiomeを次のように。 <ol><li>オートクレーブラクトバチルスMRSブロス及び強化クロストリジウム培地（v / v、1：1）混合液10mlに凍結乾燥されたプロバイオティクス細菌の粉末混合物を再懸濁します。 </li><li> 10 mlの使い捨ての滅菌チューブにアリコートその後、菌体懸濁液を3mlの培地を適量添加することにより（600nmで）約0.2の光学密度単位の最終細胞密度を調整します。 </li><li>嫌気性容器中に再懸濁させた微生物細胞を含む場所チューブ。コンテナ内の嫌気性ガス発生サシェの2つのパックを追加します。しっかりと容器の蓋を閉め、37℃で振盪せずにコンテナの設定をインキュベート、5％CO 2インキュベーターO / Nを加湿。 </li></ol></li><li>腸上皮細胞5,10とMicrobiomeとの共培養の接種。 <ol><li>脱気antibiotiを含む3ミリリットル使い捨て注射器を準備しますC無細胞培養培地（ すなわち、20％FBSを含むDMEM）。培養液の脱気手順については2.1.6を参照してください。 </li><li>バイオセーフティキャビネットに移動した後、CO 2インキュベーターからマイクロ加工絨毛を含む腸オンチップデバイスの全体的なセットアップを行ってください。 </li><li>上下のマイクロチャンネルにリンクされているチューブに接続された注射器を取り外します。その後、前microbiomeの播種に12時間、この抗生物質を含まない培地を流れ、CO 2インキュベーターに戻す、デバイスに3.2.1で調製した注射器を接続します。 </li><li> 5分間万×gで（3.1の手順を参照してください）​​前培養したプロバイオティクス細菌の混合細胞をスピンダウン。真空を用いて上清て吸引し、次いで（〜、最終細胞密度1.0×10 7 CFU / ml）を、抗生物質を含まないDMEM培地中に再懸濁します。 </li><li> 25に取り付けられた1ミリリットル使い捨て注射器を使用して、「無菌」腸絨毛を含むマイクロチャネルの内腔側に細胞懸濁液を注入G5 / 8針。すべてのチューブ端にクランプすることにより、流れずに〜1.5時間腸絨毛の頂端表面に微生物細胞の接着を可能にします。 </li><li>巡回リズミカルな変形（10％、0.15ヘルツ）と40μlの/時間で、上下のマイクロチャネルの両方に予熱した抗生物質を含まない培地を灌流。 </li><li>緑色蛍光タンパク質（GFP）の共培養のためにEを標識大腸菌 （GFP 大腸菌 ;非病原性DH5アルファ大腸菌宿主）マイクロ加工絨毛と10,11細胞、プレ育成GFP E. 12時間の条件（200 rpm）し振とうしながら37℃でオートクレーブしたLB培地中の大腸菌細胞。 GFP Eの共培養を行うために3.2.5から3.2.6への手順を繰り返しますマイクロ加工絨毛とcoli細胞。 </li></ol></li><li>画像セル5,8-10 <ol><li> DIC、エピ蛍光、または微生物と上皮形態の5,8,10を記録するためのレーザー走査型共焦点顕微鏡を実行します。 <ol><li> DICイメージングのために、CO 2インキュベーターから腸オンチップマイクロシステムのセットアップを取り出し、その後、細胞形態を記録し、顕微鏡のステージ上でのデバイスのセットアップを配置します。 </li><li>絨毛上皮の蛍光イメージングのために、10分間、100μL/時間で細胞を洗浄するためにPBSを流します。 <ol><li> 15分間、4％（w / v）のパラホルムアルデヒドで絨毛を修正しました。その後10分間、100μL/時間で細胞を洗浄するためにPBSを流します。 </li><li> 0.3％と絨毛を透過（v / v）のトリトンX-100で10分間、2％（w / v）のウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSで希釈しました。その後10分間、100μL/時間で細胞を洗浄するためにPBSを流します。 </li><li> 1時間PBS中の2％のブロック細胞（w / v）のBSA溶液。その後10分間、100μL/時間で細胞を洗浄するためにPBSを流します。 </li><li> 4の300 nMの「光保護下で核染色のためにPBSで希釈し、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸（DAPI）溶液を加えます。 </li><li>蛍光ファロイジンの25単位/ mlを追加します。光の保護の下でF-アクチン染色にPBSに溶解（ファロイジン-CF647複合体）です。 </li><li>レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて蛍光染色した細胞の記録画像。 注：25Xの目的は、共焦点顕微鏡の間に適切な光学ズームで塗布しました。 図3Bにおいて、約525Xの倍率を使用しました。 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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ドナルド・E・イングバーは、Emulate Inc.の創設者であり、同社の株式を保有し、科学諮問委員会の議長を務めています。他の著者には財務情報は開示されていません。

ホストmicrobiomeの相互作用を理解することは、医療を進めるために重要です。微生物細胞は、主にin vitroで哺乳動物細胞を過増殖しているためしかし、プラスチック皿または静的ウェルプレートで行われる伝統的な細胞培養モデルは、以上1-2日のために生き腸内微生物とヒト腸細胞の安定な共培養をサポートしていません。過剰成長微生物集団は急速に続いて深刻な腸のバリア機能を損なうおよび腸上皮細胞死を引き起こす代謝性廃棄物（ 例えば、有機酸）の過剰量を生成する、酸素と栄養素を消費します。したがって、栄養素の枯渇を引き起こす微生物の異常増殖および微生物の廃棄物の蓄積を防止することが共培養微小環境に（数日から数週間から）長期間実行可能なホストmicrobiome共存を維持するために重要です。 、microphysiologicalをこれらの課題を克服するために、腸オンチップ装置5,8は、完全に分化したヒト腸絨毛を形成し、 インビトロでの腸管腔の定常状態の微小環境を維持するために開発されました。腸オンチップマイクロ流体...

ヒトの腸は、微生物種の驚くほど多様な配列（&lt;千種）と驚異的な微生物細胞の数（ヒト宿主細胞よりも10倍以上）と遺伝子（ヒトゲノムよりも100倍以上）の1を保有します。これらのヒトmicrobiomesは、栄養素および生体異物を代謝免疫応答を調節し、腸のホメオスタシス2を維持する上で重要な役割を果たしています。驚くべきことではないが、これらの多様な機能を考えると、共生腸microbiomeは広く健康と病気3を変調します 。したがって、腸のmicrobiomeとホスト微生物の相互作用の役割を理解することは、胃腸（GI）の健康を促進し、腸の障害4のための新しい治療法を探求するために非常に重要です。しかし、 インビトロでの腸モデル（ 例えば、静置培養） 中に存在するのは時間の短い期間（&lt;1日）微生物細胞が過剰に増殖し、腸の障壁を損なうためにホストmicrobiome共培養を制限します機能5。植民地と人間の腸microbiomeの安定維持が困難であるため、代理動物モデル（ 例えば、無菌6または遺伝子操作マウス7）はまた、一般的にホスト腸microbiomeのクロストークを研究するために使用されていません。 これらの課題を克服するために、我々は最近、生きているヒトの腸5,8で発生したホスト腸microbiome相互作用をエミュレートする「ガット・オン・チップ」microphysiologicalシステム（左図1A）バイオミメティック人間を開発しました。腸オンチップマイクロデバイスは、柔軟な、多孔質、細胞外マトリックス（ECM）は、ヒトの腸上皮のCaco-2細胞が並んでコーティングされた膜、腸管腔毛細血管組織界面（ 図1Aを模倣することによって分離された2つの並列マイクロ流体チャネルが含まれています、右）9。真空駆動型の環状リズミカルな変形は通常induc変更を模倣する生理学的な機械的変形を誘発します（右図1A）蠕動運動によって編。興味深いことに、のCaco-2細胞は、100以上の時間のための腸オンチップで栽培されたとき、彼らは自然にタイトジャンクショ​​ン、頂端ブラシの境界線、基底陰窩に限定増殖性細胞と3次元（3D）腸絨毛を形成し、粘液産生は、薬物代謝活性（ 例えば、シトクロムP450 3A4、CYP3A4）、および強化されたグルコースの再取り込み8を増加させました 。この「無菌」微小環境では、プロバイオティクスラクトバチルス・ラムノサス GGまたは2週間まで5,10のための宿主上皮細胞とプロバイオティクス細菌の混合物の治療上の形成がする共培養が可能でした。 本研究では、長期間腸オンチップデバイスでホスト腸microbiome共培養を実行するための詳細なプロトコルを記述します。加えて、我々はこのホスト-microbiome共培養Pの広範なアプリケーションのために考慮すべき重要な問題と潜在的な課題を議論しますrotocol。

<table><tbody><tr><td>25 mM グルコースと 25 mM HEPES を含む Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td>37 °C でウォームアップします。水浴の中のC。</td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS broth</td><td>BD</td><td>288120</td><td>121 °でオートクレーブを実行します。Cで15分間。</td></tr><tr><td>ポリ(ジメチルシロキサン)</td><td>ダウコーニング</td><td>3097358-1004</td><td>15:1(w / w)、PDMS:硬化剤</td></tr><tr><td>Caco-2BBEヒト結腸直腸癌ライン</td><td>ハーバード消化器疾患センター</td><td></td><td>ヒト結腸直腸腺癌&nbsp;</td></tr><tr><td>熱不活化 FBS</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>20% (v/v) in DMEM</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>1/100 希釈液 DMEM</td></tr><tr><td>4&prime;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩</td><td>分子プローブ</td><td>D1306</td><td>核染色</td></tr><tr><td>ファロイジン-CF647 コンジュゲート (25 units/ml)</td><td>Biotium</td><td>00041</td><td>F-actin 染色</td></tr><tr><td>Flexcell FX-5000 テンションシステム</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX5K</td><td>蠕動運動 (細胞ひずみ 10%、周波数 0.15 Hz)</td></tr><tr><td>倒立落射蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Imaging、DIC</td></tr><tr><td>走査型共焦点顕微鏡</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td>Imaging、蛍光</td></tr><tr><td>UVO Cleaner</td><td>Jelight Company</td><td>Inc 342</td><td>腸チップ</td></tr><tr><td>I型コラーゲンの表面活性化&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td>チップへの細胞培養用細胞外マトリックスコンポーネント</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BD</td><td>354234</td><td>チップへの細胞培養用細胞外マトリックスコンポーネント</td></tr><tr><td>1 ml 使い捨てシリンジ</td><td>BD</td><td>309628</td><td>細胞および培地注入剤</td></tr><tr><td>25 G 5/8 ニードル</td><td>BD</td><td>329651</td><td>細胞および培地注入剤</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Braintree Scientific株式 会社。</td><td>BS-8000</td>チップ<td>への注入装置</td></tr><tr><td>VSL#3</td><td>シグマタウファーマシューティカルズ</td><td>7-45749-01782-6</td><td>8種類の共生腸内微生物の製剤</td></tr><tr><td>強化クロストリジウム培</td>地 <td>BD</td><td>218081</td><td>嫌気性細菌培養培地</td></tr><tr><td>GasPak EZ アナエロビー容器システム インジケーター付き</td><td>BD</td><td>260001</td><td>嫌気性ガス発生小袋&nbsp;</td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>157-4-100</td><td>染色用細胞の固定</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>細胞の透過化</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>細胞の染色用ブロッキング剤</td></tr><tr><td>コロナ処理器</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-20AC</td><td>チップ製造用プラズマ発生器</td></tr><tr><td>ステリフリップ&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>SE1M003M00</td><td>全培養液の脱気</td></tr><tr><td>ディスポーザブル血球計算盤</td><td>iNCYTO</td><td>DHC-N01</td><td>手動細胞計数用</td></tr></tbody></table>

ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活microbiomeの共培養

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

ここでは、人間の腸オンチップmicrophysiologicalデバイスにおけるマイクロ加工腸絨毛を有する多種のヒト腸microbiomeの長期共培養を行うためのプロトコルを記述します。私たちは、生理的機械的変形と流体せん断流れは絶えず蠕動運動を模倣するために適用されるマイクロ流体デバイス、内腸管腔毛細血管組織界面を再現します。ルーメンマイクロチャネルにおいて、ヒト腸上皮のCaco-2細胞は、「無菌」絨毛上皮を形成し、小腸絨毛を再生する培養されます。前培養した微生物細胞は、宿主微生物の生態系を確立するために、ルーメン側に接種します。微生物細胞は、絨毛の先端面に付着した後、流体の流れ及び機械的変形は、新鮮な培養培地を常時供給して未結合細菌（ならびに細菌性廃棄物）である定常状態の微小環境を生成するために再開される連続的に除去されます。拡張された共培養Fの後ROM日週に、複数の微小コロニーを無作為に絨毛の間に位置することが見出されており、両方の微生物および上皮細胞は、培養中で少なくとも1週間生存し、機能しています。私たちの共培養プロトコルは、健康と病気を組織内の人間microbiomeの役割のin vitroでの研究に容易にすることができる様々なヒトの臓器、中に見出すことができる他のホストmicrobiome生態系のための汎用プラットフォームを提供するように適合させることができます。

in vitroでのヒトの腸ホストmicrobiomeのエコシステムをエミュレートするために、それはあります このような蠕動運動のような力学や流体の流れのような生理的条件下で腸内細菌とヒト腸上皮細胞の安定した長期の共培養を再構成するための実験プロトコルを開発するために必要。ここでは、生体模倣腸オンチップマイクロデバイスを利用します （ 図1A）共培養in vitroでの週間以上の期間に、人間の絨毛を生きていると直接接触して微生物細胞を生きます。腸上皮細胞は自発的に高分化絨毛を形成する場合に生理学的に関連する流体の流れおよび環状機械的変形5の存在下で2チャンネルのマイクロ流体デバイスの1チャネルにおける多孔質のECMコーティングされた膜の一方の側に培養しました。マイクロ加工絨毛はformati含むヒトの小腸絨毛の構造と機能を複製します頂端刷子縁が並ん円柱上皮細胞、移行および絨毛先端、粘液産生、強化された薬物代謝活性、および増加したグルコースの再...

私たちは、人間の腸オンチップmicrophysiologicalシステムを使用して長期間のためのin vitroプロトコルへの共培養腸microbiomeと腸絨毛を説明します。

ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活Microbiomeの共培養

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

このプロトコルの全体的な目標は、腸内チップマイクロ流体デバイス内で蠕動運動のような動きと流れの下でヒト腸細胞の絨毛成長を実証すること、およびこれらの細胞を生きた腸内細菌叢と共培養する方法を示すことです。したがって、この方法は、消化器病学、臨床微生物学、および薬学の分野における重要な問題に取り組み、疾患メカニズムを特定し、新薬化合物の有効性と毒性を検証するのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者がマイクロ生理学的システムを使用して、in vitroでヒトの生体腸の生存可能で機能的なポストマイクロバイオームエコシステムを確立できることです。この技術の意味は、潰瘍性大腸炎やクローン病などの疾患にまで及ぶ可能性があり、宿主細胞とマイクロバイオームの安定した共培養は、これらの疾患の複雑さを模倣することができるためです。この方法は、腸内細菌叢と腸内の免疫系との間の複雑な相互作用についての洞察を提供することができますが、皮膚、生殖管、口腔など、宿主微生物の相互作用がある他の臓器系にも適用できます。まず、付属のテキストプロトコルで説明されているように、Gut-on-a-Chipマイクロ流体デバイスを準備します。このデバイスは、2つの平行なマイクロチャネルを含む透明なガス透過性シリコンポリマーで構成され、柔軟な多孔質PDMSメンブレンによって分離されています。チャネルの両側には真空チャンバーがあり、これを使用して周期的な機械的ひずみを加えることができます。1ミリリットルのシリンジを使用してデバイスを滅菌し、チャネルに70%エタノールを流します。次に、デバイスを摂氏60度のドライオーブンで一晩乾燥させます。翌日、Gut-on-a-Chipマイクロシステムとそれに接続されているチューブを、UV光とオゾンに同時に40分間さらします。バイオセーフティキャビネットの紫外線の下に15分間留まりながら、デバイスを冷却します。次に、100マイクロリットルの細胞外マトリックスコーディング溶液を1ミリリットルの注射器に装填し、デバイスの上部マイクロチャネルに分注します。このプロセスを繰り返して、下部のマイクロチャネルもコーティングします。セットアップ全体を摂氏37度加湿5%CO2インキュベーターに1時間置きます。インキュベーション中、脱ガスにより、50ミリリットルのろ過システム内の0.45ミクロンフィルターに1分間通すことにより、全培地を予熱しました。ろ過した媒体を1分間軽くたたいて、媒体内の気泡や溶存ガスを取り除きます。次に、脱気した完全な培地を2つの3ミリリットルの使い捨て注射器に移し、注射器を1時間インキュベートします。次に、シリンジをGut-on-a-chipの上部と下部のマイクロチャネルに接続し、完全な培地を上部と下部のマイクロチャネルに穏やかなパルスで流すことでコーディング溶液を洗い流します。次に、シリンジポンプを使用して、脱ガスした完全細胞培養培地を装置の上部マイクロチャネルに流し、チップを摂氏 37 度、CO2 5% で一晩インキュベートします。まず、Caco-2 腸上皮細胞を含む完全にコンフルエントな T75 フラスコを採取します。まず、10 ミリリットルのカルシウムおよびマグネシウムを含まない PBS で細胞をすすぎます。次に、PBSを吸引し、すすぎをさらに2回繰り返します。次に、0.05%トリプシン-EDTA溶液を1ミリリットル加え、フラスコを摂氏37度で5分間インキュベートします。分離したら、10ミリリットルの予熱した全細胞培養培地を加え、細胞懸濁液を3〜5回上下にピペットで動かしてから、遠心チューブに移します。細胞懸濁液をスピンダウンします。次に、上清を取り除き、予め温めた完全な培地で150, 000細胞/センチメートルの二乗で細胞を再懸濁します。500マイクロリットルの細胞懸濁液を、25ゲージ、5/8インチの針を備えた1ミリリットルの使い捨て注射器に引き出します。次に、100マイクロリットルの細胞懸濁液を出口チューブを介して上部マイクロチャネルに分注します。次に、バインダークリップを使用して、上部と下部のマイクロチャネルに接続されているすべての入口と出口をクランプします。全セットアップを1時間インキュベートして、腸上皮細胞が多孔質膜の表面に付着できるようにします。次に、クランプを取り外し、上部チャネルチューブをシリンジポンプにセットされた培地充填シリンジに接続します。無傷の単層からの細胞まで、毎時30マイクロリットルで上部マイクロチャネルへの培地の流れを再開します。細胞が単層を形成したら、下部チャネルを2番目のシリンジに接続し、培養培地を上部内腔と下部毛細管の両方のマイクロチャネルに毎時30マイクロリットルの同じ流量で灌流します。チップに蠕動運動のような動きを作り出すには、まず真空ポンプをオンにします。デバイスの真空チャンバーをステンレス鋼コネクタ付きのチューブを介して真空コントローラーに接続します。次に、0.15 ヘルツの周波数で平均細胞ひずみの 10% の周期符号伸張運動を提供するようにコントローラーを設定し、[開始] をクリックします。機械的変形の存在下で、培地を上部と下部の両方のマイクロチャネルに流し続け、絨毛の成長を誘発します。オートクレーブ滅菌乳酸桿菌MRSブロスと強化クロストリジウム培地の50/50混合物を準備します。次に、凍結乾燥したプロバイオティクス細菌混合物を10ミリリットルの混合物に再懸濁します。混合物の光学密度を600ナノメートルで測定し、最終的なセル密度を約0.2光学密度単位に調整します。調整した微生物細胞懸濁液の3ミリリットルを使い捨ての10ミリリットルの滅菌チューブに分注します。アリコートを嫌気性容器に入れ、嫌気性ガス発生小袋を2パック容器に入れます。容器の蓋をしっかりと閉め、インキュベーターで一晩振とうせずに容器のセットアップをインキュベートします。次に、脱ガスした抗生物質を含まない細胞培養培地を調製し、3ミリリットルの使い捨てシリンジにロードします。マイクロエンジニアリングされた絨毛を含む腸チップデバイスをバイオセーフティキャビネットに移します。デバイスの上部と下部のマイクロチャネルに接続されているシリンジを取り外し、脱ガスされた抗生物質を含まない細胞培養培地を含むシリンジと交換します。終了したら、デバイスをCO2インキュベーターに戻します。次に、抗生物質を含まない培地をデバイスに12時間流し込み、マイクロバイオームを装着します。次に、培養済みのプロバイオティクス細菌細胞混合物をスピンダウンします。上清を吸引し、抗生物質を含まないDMEMに細菌を再懸濁します。.この細胞懸濁液の約100マイクロリットルを、25ゲージ、5/8インチの針に取り付けられた1ミリリットルの注射器にロードします。以前は無菌だった腸絨毛を含むマイクロチャネルの内腔側に細菌を注入します。チューブをクランプして、微生物細胞が腸絨毛の頂端表面に1時間半流れなく付着するのを待ちます。次に、予め加温した抗生物質を含まない培地を、毎時40マイクロリットルで上部と下部の両方のマイクロチャネルに灌流し、周期的なリズミカルな変形を伴います。この共培養プロトコルにより、絨毛間空間における複数種のプロバイオティクス細菌の安定したコロニー形成が可能になります。生存可能な細菌マイクロコロニーは、共培養で最大2週間維持できます。ここに示されているのは、GFP標識大腸菌と腸絨毛の両方からなる異なる共培養物です。高倍率の倍率は、72時間の時点での細菌のマイクロコロニーの位置を明確に示しています。この手順を試みる際には、培養の初期段階で上皮細胞単層を損傷しないように、培地をマイクロ流体チャネルに穏やかかつゆっくりと注入することを覚えておくことが重要です。この方法に基づいて、ヒト免疫細胞との共培養法は、マイクロバイオームが免疫系とどのようにクロストークし、腸の最適な健康状態の恒常性に影響を与えるかという点で、いくつかの手がかりを与えることもできます。このビデオを見れば、ヒトの腸の微小環境を再構成する方法と、マイクロバイオームとヒト腸絨毛の間の共培養をin vitroで実証する方法について十分に理解できるはずです。病原菌やヒト細胞を扱う作業は非常に危険ですので、バイオセーフティキャビネット内での作業もお忘れなく。

co-culture-living-microbiome-with-microengineered-human-intestinal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活Microbiomeの共培養

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