Name: のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動ショウジョウバエ 4象限オルファクトメーターで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶ4象限オルファクトメーターを用いたショウジョウバエの嗅覚行動アッセイ法。自動追跡ソフトウェアで集団の応答を解析し、神経系の感覚情報処理と行動決定メカニズムを解明する。

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私たちは、フライアリーナと遮光エンクロージャーを製造してくれたTerry Shelley氏、フライストックのメンテナンスを手伝ってくれたLiz Marr氏、そしてデータ分析に使用したMatlabコードの助けを提供してくれたXiaojing Gao氏とJunjie Luo氏に感謝します。Monell Chemical Senses CenterのJohan Lundström氏に、臭気送達のセットアップを実演していただいたことに感謝します。この研究は、ホワイトホール財団(CJP)とNIH NIDCD(R01DC013070、CJP)からの助成金によって支援されました。

1.セットアップアセンブリ<ol><li>提供描画（補足資料、SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf）によれば、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）のうち星形アリーナ（0.7センチメートルにより19.5センチメートル19.5センチ）を製造。アリーナは、商用またはカスタム機能によって製造することができます。 </li><li> 2枚のガラス板（厚さ2mmの20.25 CMで20.25センチメートル）を取得し、正確にダイヤモンドコーティングされたドリルビットを用いてガラス板の一方の中心に（〜直径0.7センチ）の穴をドリル。 </li><li>行動アリーナのための光を通さない行動ボックスを製造しています。また、提供される図面（補足資料、SupplementalSketch_LightTightBox.pdf）によれば、赤外線CCDビデオカメラ用の光を通さないカメラボックスを製造しています。ボックスは、市販またはカスタム機能によって製造することができます。 </li><li>後壁と行動ボックスの側壁にLEDアレイ上に空調ユニットをマウントします。温度プローブを配置リアルタイムの温度フィードバック及び調整のための側孔を介して動作ボックスで（詳細は図1及び図 2を参照）。 </li><li>カメラにIRフィルタと円偏光板を取り付け、カメラボックスにアセンブリをマウントします。動作ボックスとカメラボックスは動作ボックス（詳細は図1及び図 2を参照）のより良好な温度制御のためのガラス窓によって分離されています。 </li><li>カメラアダプタに赤外線CCDカメラを接続します。 USBコンバータにカメラアダプターを接続します。データ収集のためのコンピュータのUSBポートにUSBコンバータを接続します。 </li><li>製造元の指示に従って、コンピュータ上のビデオコンバータ用のドライバをインストールします。必要に応じて、カメラの設定と取得パラメータの広い範囲にアクセスするためのUSBビデオコンバータの製造業者によって提供される画像処理ソフトウェアをインストールします。 </li><li>出力「を通して空調ユニット（接続）温度コントローラの背面にある熱電対 &quot;&quot;温度コントローラの背面にある）と温度プローブ（スルー」温度コントローラへ。行動ボックス内にプローブを配置します。 注：私たちのレイアウトの温度制御システムは、18°Cと30°Cの間のボックス温度を維持することができます。より高いまたはより低い周囲温度が神経活動を操作したり、シナプス伝達を阻害する実験熱発生を起こす（dTrpA1、TRPM8またはshibire TS）のために有用である可能性があります。ほとんどの実験のために、温度を25℃に維持されます。 </li><li> （詳細な回路図と接続金具については、 図1Bを参照してください）以下の手順で臭気デリバリーシステムを組み立て： <ol><li>中央空気システムからの空気の入力を制御するためのエア圧力調整器を使用してください。中央Aからの空気を浄化するために圧力調整器に（炭を充填した）カーボンエアフィルタを接続IRシステム。 </li><li>高解像度の流量計チューブによって規制複数のチャンネルからなる流量制御システムを組み立てます。 </li><li> 図1Bおよび図2Fに示すように、マニホールドを介して流量計チューブにカーボンエアフィルタからの出力を接続します。流量計を出る清浄な空気が部屋中に排出またはカスタムメイドの匂い室24に入力された場合に調整するために電子制御式3方電磁弁を介して流量計管の出力を指示します。 </li><li>製造元のマニュアルに従って電磁弁コントローラをインストールします。 </li></ol></li><li>製造者のマニュアルに従ってデータ収集装置（DAQ）と電源に接続して電子エアフローメータを取り付けます。すべての実験の前に競技場の各象限に同じ流量を確認するために、DAQインタフェースソフトウェアをインストールします。 </li></ol> 2.嗅覚刺激の準備<ol><li> 5臭気を準備プラスチック外容器から構成アリ室24は 、中央部とガラス内側容器、カスタムメイドのPTFE蓋挿入、元の容器の蓋を除去し、2一方向弁。 注：PTFE蓋の周りにOリングが臭気灌流中臭気室からの空気漏れを防止するために使用することができます。回路図とチャンバーの写真については、 図2は図1を参照してください。 </li><li>溶媒対照のための4つの付臭剤のチャンバ、およびテストの付臭剤のための1つのチャンバを使用してください。 、（徹底的に実験前にミックス、試験臭気物質+適切な溶剤）溶剤や匂い物質希釈1,000μlのガラス容器を記入し、対応するプラスチック室内のガラス容器を配置（プラスチック容器に液体をこぼさないでください）​​、蓋を締め。常にテストの付臭剤と溶媒対照のためのクリーン室を使用してください。 注：嗅覚の魅力は、ワットでリンゴ酢（5％酸度）の1/16希釈することによってトリガされてもよいですATER。対照的に、嗅覚反発動作は、鉱油中のエチルプロピオネートの10％希釈液を用いて研究することができます。これらの場合のコントロール刺激は、純粋な鉱物油と匂い室です。 </li></ol> 3.フライの準備<ol><li>リアは、標準的なコーンミール培地上に飛びます。 30男性と標準ボトル内の30女性の親のハエを置き、それらを25℃または室温で5日間卵を産むしましょう​​。 </li><li>各実験について、女性は簡単にCO 2麻酔下で飛ぶ新しくeclosed（&lt;1日齢）25の男性と25を収集します。 </li><li> 2-4日のための標準的なフライ媒体とバイアルにハエをしてください。 </li><li>実験前40-42時間、CO 2麻酔なしでハエを転送&#160;約10 ML 1％アガロースゲルでバイアルに。これは彼らの運動活性を増加させることに貢献する食品、なしで加湿ハエを維持します。 注：ハエの90％以上が飢餓に耐えなければなりません。いくつかの遺伝子型は癒す少ないですあなたは、40時間の飢餓を介して、それをすることができません。これらの例では、このような24から28時間のような短い期間は許容されるが、すべての実験条件と繰り返しのために同じことを保つべきです。 </li></ol>魅力と撥着臭剤4.行動応答<ol><li>温度コントローラに切り替え、25℃に設定してください。 </li><li>付臭剤室の出口にし、プッシュ・ツー・コネクト行動ボックスのフィッティングにチューブを挿入することにより、付臭剤室（対照および試験臭気物質）を接続します。 </li><li>制御付臭剤空気流は100ミリリットル/分に等しいことを確認するために、エアフローメータを使用して、各象限に流量を確認してください。 </li><li> 70％エタノールで2-3回PTFEフライアリーナとガラス板をきれいにし、それらが完全に空気乾燥（〜3-4分間）することができます。 </li><li>クランプでアリーナにガラス板を貼り付けます。 </li><li>転送は、ガラス板の1の穴から場にCO 2麻酔なしで飛びます。アフトえー転送は、エスケープからハエを防ぐために、穴の円形メッシュを配置します。 注：CO 2麻酔は、 ショウジョウバエの挙動25に影響を与えることが示されており、行動実験の24時間以内に使用すべきではありません。 </li><li>光を通さない室にハエでアリーナを置き、プッシュツー接続し、アリーナの隅に行動ボックスのフィッティング室のドアを閉じて待つに取り付けられたチューブを接続することにより、4つの制御空気流を接続10-ハエが新しい環境に順応させるために15分。可能な場合は、バイアス実験結果を得る可能性のある最小の光漏れを回避するために、実験が行われている部屋の照明をオフに切り替えます。 </li><li>ハエは4制御空気の流れにさらされている5〜10分の対照実験を、実行します。 </li><li>ハエがアリーナ内に均一に分布していることを確認する（下記データ分析の項を参照）すぐにデータを分析し、インデックスが近くにあり名所それはアリーナ内の好みや回避の制御不能源（ 例えば光外から漏れ、不均一な温度分布、不均一アリーナ、臭気汚染など）が存在しないことが確認されたよう0にこのステップは、必須です。ハエが不均等に分布しているか、その運動活性が低い場合は、ハエを破棄し、再び舞台をきれいに（4.4ステップ）と実験を繰り返してハエの新しいバッチを使用します。 </li><li> 3方弁または再差し込むコネクタチューブに切り替えることにより、セットアップにテスト付臭剤室を接続します。 </li><li> 5〜10分間のテスト実験を実行し、以下のセクション5で説明したようにデータを分析（も参照14および図3を参照）。 20分以上の記録は、計算処理が困難であり得るデータファイルをもたらすことができます。長い実験の記録が必要な場合は、速やかに停止し、追跡プログラムを再起動してください。これは実験的な記録間〜10秒のギャップが生じます。 </li><li> DiscarDハエ。 </li><li> 70％エタノール（ステップ4.4）で清掃アリーナとガラス板と、遮光性のエンクロージャ内のコネクタチューブを交換してください。実験を円滑に行うために、新しいクリーンな競技場を使用することができ、実験ランを行いながら汚れたアリーナは、掃除しました。 </li><li>必要に応じて、ハエの新しいバッチと別の実験を実行します。いくつかの実験を同じ日に実行された場合、付臭剤は、前回のテスト実行からシステムに残されていないことを確認するために細心の注意を取ります。これは、通常、臭気物質の濃度が低いまたはCO 2の問題ではありませんが、実験ラン間の24時間のギャップまでの高度に濃縮された刺激のために必要とすることができます。付臭剤汚染が対照実験中に疑われる場合に加えて、フローチューブの後に全てのチューブを交換することができます。常に継続的にシステムをフラッシュするために、実験の間に乾燥空気を残します</li></ol> 5.データ解析注：提案したフライ追跡取得softwar（材料で詳述）eは、取得時にリアルタイムでハエを追跡し、タイムスタンプと*​​ .datの形式で検出されたすべてのハエの座標を保存します。我々は、Matlabのフォーマットにデータを変換するためのカスタムメイドのMatlabのルーチンを開発し、そしてデータを分析します。コー​​ド例は、補足資料に提供されるが、実装の詳細は、データ収集のために使用されるソフトウェアに依存するであろう。 <ol><li>生データをロードします。アリーナの輪郭を次の空間マスクを作成し、それらがノイズ（ 図4A、 補助コード MaskSpatialFiltering.m、Score.m、DrawCircularMaskを表すように、アリーナの外にあるすべてのデータポイントを削除するには、生データにマスクを適用します。 M）。 </li><li>このデータがノイズや非移動ハエによって生成された（ 図4B、補足コードTemporalFiltering.m）である可能性があるように、3秒より長く0.163センチメートル/秒以下の速度で移動するすべてのデータポイントを削除します。 </li><li>残りのデータを視覚化一度にすべてまたは単一の軌跡（ 図3、 補足コード SingleTrajectoryViewer.m）としてそれらをプロットすることによってポイント。 注：4-フィールドの匂い境界の位置は、おそらく、このような各付臭剤の特性などの要因、および使用されている空気流量の数に依存します。例えば、揮発性の高い臭気物質は、おそらくより完全に揮発性の低い臭気物質より臭気の象限を記入します。したがって、各付臭剤は、わずかに異なる臭気境界を示すことができる可能性があります。それは特定の場所から空気をサンプリングするために真空を使用し、その結果、スポットにおける臭気物質の濃度を破壊として臭気境界を測定するための光イオン化検出器を使用することは問題となり得ます。それにもかかわらず、臭気の境界を迅速にその場行動データに基づいて推定することができます。例えば、異なる匂いに応答して累積フライトラックに基づいて、臭気の境界が明確に、図3Cおよび3Dで観察することができます。 </li><li>カル対照実験は、プリファレンスの応答を生成していないかどうかを判断するために、また、付臭剤（または光遺伝学9）刺激に応答にアクセスするための吸引インデックスをculate。アトラクション指数（AI）を計算するには、コントロールまたはテスト記録の最後の5分を使用します。 1（絶対引力）と-1（絶対反発力）の間にあるアトラクションの測定値を取得するには、以下の式がAIを計算するために使用されます。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54346/54346eq1.jpg" /> N 試験は、試験象限におけるデータ点の数であり、N個の制御は、3つの対照四分円内のデータポイントの平均数です。プリファレンスは、ゼロに近い値によって示されないであろう、この尺度は、直感的です。しかし、それは正しく、付臭剤象限に位置しているハエの合計数の割合を示すものではありません。この測定値を得るために、割合指数（PI）を使用することができます。 <img alt="式（2）" src=「/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg &quot;/&gt; N 試験は、試験象限におけるデータ点の数であり、N totalは全4つの象限内のデータポイントの合計数です。この式は、0.25が無い行動嗜好（ 図3Eと4C、 補足コード AttractionIndex.m）に対応して、0と1の間に入る尺度を提供します。 </li><li>各繰り返しのためのハエの新しいグループを使用して、各実験条件の5-10繰り返しを実行します。コルモゴロフ-スミルノフノンパラメトリック検定（ 図3F、MATLABでkstest2機能）を使用して、コントロールの状態の間、またはに対する吸引インデックスを比較。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで説明した4つのフィールドの嗅覚計は、野生型および変異体ショウジョウバエハエの大集団の嗅覚応答を研究するための汎用性の高い行動システムです。各実験は、（セットアップ、実験ラン、および洗浄を含む）〜1時間かかり、4-6実験は、日常的に毎日行うことができます。 5分間40~50ハエを使用する典型的なアッセイは、約45万を分析のためにデータポイントを追跡生成します。上記構成はまた、分から日の範囲の期間にわたって嗅覚に対する応答、または他の感覚刺激で他の昆虫または昆虫の幼虫の動きを監視するために、軽微な変更を加えて使用することができます。 4象限アッセイは、魅力と反発の両方の刺激の効果に敏感です。ほとんどの臭気物質は-0.9と0.9（式1）との間の吸引指数（AI）を生成します。 -1 -0.5の範囲内のAIがあるのに対し、1から0.5の範囲内のAIは、刺激に対するハエの強力な吸引動作を意味します強い忌避剤によってトリガ。一般的に言えば、制御匂いによって中立応答（乾燥空気、加湿空気、鉱物油）は0.1と-0.1の間に入る必要があります。 AIは、多くの場合、ハエは、臭気物質のプルーム、初期の魅力と新たな刺激に向けた自発運動の増...

外部環境に適応し、対応する能力は、すべての動物の生存のために重要です。動物は、危険を避けるため、食品を模索し、仲間を見つけ、以前の経験から学ぶ必要があります。感覚系では、そのような視覚的、化学的および機械刺激のような刺激の多様を受信し、解釈し、復号することが中枢神経系にこれらの信号を送信するように機能します。脳はそのような食品用の餌や捕食者から逃げるよう認知された環境に基づいて適切なモータ動作を、指示します。外界を検出し、どのように脳がデコードし、意思決定を指示し、神経生物学における大きな課題であるかの感覚系を理解します。 キイロショウジョウバエは、どのように神経回路ガイド行動を調査するための強力なモデル系です。維持が簡単で安価であることに加え、 ショウジョウバエは多くの多様で複雑 ​​なステレオタイプの行動を示す、まだCOMPACでそう約100,000ニューロンの神経系をtは。強力な遺伝学的技術は、 ショウジョウバエのゲノムを操作するために存在し、トランスジェニック系統の数千人を選択的かつ再現性のニューロン10-13の同じサブセットを標識することが生成されています。これらのトランスジェニック系統を選択的に標識された神経細胞（活性化または阻害する）の活性を操作するために使用することができ、これらの操作は、どのように神経機能ガイド挙動を調査するために使用することができます。 複数の行動アッセイは、様々なショウジョウバエの行動を研究するために開発されてきた。 ショウジョウバエ 、多くの動物のように、このような、食べ物を見つけるの仲間を見つけて、危険を回避するなど、多くの行動の選択肢を、案内する臭いの感覚を使用しています。嗅覚は、したがって、外部刺激が検出され、適切な選択を導くために、動物の神経系によってどのように解釈されるか調査するための良い感覚システムです。このように、多数のアッセイがinvestigaのために開発されていますティンの幼虫と大人の嗅覚行動。伝統的に、 ショウジョウバエの嗅覚行動は、先天性アッセイするために使用され、嗅覚行動3を学習することができる2つの選択肢のT-迷路パラダイムによってアッセイしました。このアッセイでは、約50ハエは、2つの管の間の選択肢を与えている：1のチューブは、問題の臭気が含まれており、他の制御付臭剤（通常、臭気溶剤）が含まれています。ハエは選択をする時間の設定期間を与えられているし、別の部屋にいるハエの数がカウントされます。 T-迷路は、多くの実験のためのシンプルなアッセイであるが、いくつかの制限があります。例えば、嗅覚行動は、ただ1つの時点で測定され、この時点の前に作られた別の選択は破棄されます。同様に、集団内のハエの個々の行動は無視されます。また、T-迷路はエラーをもたらす可能性があるハエの手動カウントを、必要とします。最後に、2つだけの測定の選択肢があるので、この多くの場合、微妙な行動の変化を検出するのに必要な統計的検出力を低下させます。 2択T-迷路の代わりに、4象限（4フィールド）オルファクト14-18です。このアッセイでは、動物はアリーナの四隅が着臭空気の潜在的な供給源が充填された競技場を探ります。アリーナは4実験的に定義された臭気象限の形成を最大化するためにひだ星形状を有しています。臭いがコーナーの1に供給されている場合、それはそれだけで1象限に含まれています。動物の行動は、彼らが入ると臭いの象限を残すとして追跡し、簡単に3つの制御象限におけるそれらの挙動と比較することができます。 4象限嗅覚計アッセイは、このように大規模な実験的な舞台の上に匂い刺激に対する空間的・時間的行動応答を記録します。 4象限嗅覚計は、最初ペターソンら 15及び獣医らによって開発された。17オールを調査します個々の寄生ハチ目の工場行動反応。フォーシェら 18とSemmelhackと王16は、個々のショウジョウバエの嗅覚応答をモニターするためのセットアップを適応しました。 4象限嗅覚計は、試験臭気物質および条件の広い範囲を可能にする、魅力と反発応答にも同様に敏感です。カスタム書かれたフライ追跡ソフトウェア、アレックスKatsov 19によって開発され、現在ジュリアン・ブラウン（材料で詳述）によって維持されるが、4象限嗅覚計14,20-23のより最近の実装に追加の利点を導入しました。高い空間（27.5ピクセル/ cm）で、そのような任意の時点でのハエの位置、速度、加速度などの各種パラメータを抽出できます一時的な（毎秒30フレーム）の解像度、同時に100ハエまでアッセイすることが可能になりました。これは臭い〜20ハエ」行動反応のダイナミクスの調査を可能にします</s&gt;アップ。全体の追跡期間中、集団内の個々のハエの同一性が維持されないことに留意すべきです。その代わりに、各フライトラックが交差しない限り2としてフライトラックのために記録されています。ハエが発散した後、その時点で、新しいトラックが割り当てられています。 （ 材料表に詳述する）は、他のビデオキャプチャソフトウェアを組み込むことにより、同様の構成は、柔軟な追跡期間を可能にし、より低いフレームレートで画像を撮影することによって、最大24時間のハエを追跡するために使用することができます。このオプションは、ハエの産卵行動を研究し、産卵選好14で自分の体の位置を比較しました。 4フィールド嗅覚計はまた、（ 例えば 、嗅覚と視覚）マルチモーダル刺激に対する応答を研究するために使用することができる、または感覚刺激のプレゼンテーションと光遺伝学9または熱発生を起こす21刺激を組み合わせること。さらに、高い時間分解能がfoの軌跡の抽出を可能にしますアンサンブルデータセット内のrの各個別のフライ。したがって、この方法は、嗅覚ガイド下人口の行動や、個々の社会的相互作用の調査を可能にします。このアッセイによって生成されたデータは、行動画面の4フィールド嗅覚計の使用を可能にする、堅牢かつ再現性の高いです。 我々は、4象限嗅覚計のためにここにセットアップアセンブリを説明します。我々はさらに高度に濃縮されたプロピオン酸エチルに応じて、リンゴ酢と反発力に応じて、嗅覚の魅力をアッセイでの使用を実証します。最後に、我々は説明し、記録されたフライ追跡データの分析のためのサンプル・コードを提供します。

<table><tbody><tr><td><ストロング>エアデリバリーシステム&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(必要な数量)</td></tr><tr><td>チューブとコネクタ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>熱可塑性プラスチック NPT(F) マニホールド</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-31522-31</td><td>1</td></tr><tr><td>Hex reducing&nbsp; nipple (1/4MNPT->1/8MNPT)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5232T314</td><td>1</td></tr><tr><td>チューブ (ID:1/8)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5108K43</td><td>50 Ft</td></tr><tr><td>Tubing (ID:1/16)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>52355K41</td><td>100 Ft</td></tr><tr><td>Barbed tube fittings</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5117K71</td><td>1パック</td></tr><tr><td>Push-to-connect tube fittings</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5779K102</td><td>4</td></tr><tr><td>Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K439</td><td>1パック (10)</td></tr><tr><td>有刺鉄線チューブ継手 (1/8MNPT->1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K438</td><td>2パック (10)&nbsp;</td></tr><tr><td>有刺鉄線チューブ継手(1 / 8MNPT->1 / 16BF)</td><td>McMaster-Carr、IL、USA</td><td>5463K4</td><td>2パック(10)&nbsp;</td></tr><tr><td>有刺鉄線管継手(1 / 4MNPT->1 / 4BF)</td><td>McMaster-Carr、IL、USA&</td><td>nbsp; 5670K84</td><td>1</td></tr><tr><td>六角ヘッドプラグ</td><td>McMaster-Carr、IL、</td><td>USA48335K152</td><td>1</td></tr><tr><td>空気圧レギュレーター、エアフィルターおよび流量計</td><td></td><td></td><td>(必要な数量)</td></tr><tr><td>Labatoryガス乾燥ユニット</td><td>W A HAMMOND DRIERITE CO LTD、 オハイオ州、米国</td><td>モデル: L68-NP-303; stock #26840</td><td>1</td></tr><tr><td>150 mm フローチューブ用マルチチューブ フレーム</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R03215-30</td><td>1</td></tr><tr><td>150 mm フローチューブ用マルチチューブ</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R03215-76</td><td>1</td></tr><tr><td>150 mm フローチューブ</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-03217-15</td><td>9</td></tr><tr><td>バルブカートリッジ</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-03218-72</td><td>9</td></tr><tr><td>精密エアレギュレータ</td><td>ーMcMaster-Carr、IL、米国</td><td>6162K13</td><td>1</td></tr><tr><td>ソレノイドバルブ</td><td>Automate Scientific、バークレー、CA</td><td>02-10i</td><td>4</td></tr><tr><td>ソレノイドバルブ</td><td>コントローラーValveLink 8.2、Automate Scientific、バークレー、CA</td><td>01-18</td><td>1</td></tr>電子<tr><td>流量計</td><td>Honeywell</td><td>AWM3100V</td><td>1</td></tr><tr><td>DAQ(NI USB-6009、National Instruments)およびa&nbsp;</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>NI USB-6009</td><td>1</td></tr><tr><td>電源</td><td>Extech Instruments</td><td>382200</td><td>1</td></tr><tr><td>臭気チャンバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン 広口ジャー 2 オンス 60 ml</td><td>Nalgene</td><td>562118-0002</td><td>実験ごとに少なくとも 5 つ必要ですが、各臭気物質のディリューションごとに個別のチャンバーが必要です。コンテナストアで入手可能、パート#635114)</td></tr><tr><td>ガラス臭気チャンバー、0.25オン</td>ス<td>サンバーストボトル</td><td>LB4B</td><td>実験ごとに少なくとも5つが必要です&nbsp;</td></tr><tr><td>臭気室用「イン」バルブ</td><td>Smart Products, Inc., CA, USA</td><td>214224PB-0011S000-4074</td><td>これらの部品のうち1つは臭気室ごとに使用されますが、頻繁に交換する必要があります</td></tr><tr><td>「アウト」バルブ 臭気室</td><td>用バルブ Smart Products, Inc., CA, USA</td><td>224214PB-0011S000-4074</td><td>これらの部品の1つは、臭気室ごとに使用されますが、頻繁に交換する必要があります</td></tr><tr><td>Oリング</td><td>RT Dygert International, ミネソタ州、米国</td><td>AS568-029 Buna-N O-R</td><td>1 パック (100)</td></tr><tr><td>Fly アリーナ、カメラ、ビヘイビア ボックス</td><td></td><td></td><td>(必要な数量)</td></tr><tr><td>Behavior and camera box material</td><td>Interstate plastics, CA, USA ABS</td><td>black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)</td><td>1803 sq inch</td></tr><tr><td>フライアリーナおよび臭気チャンバーインサート用テフロン、厚さ3/8インチ、12インチ x 12インチ</td><td>McMaster-Carr、イリノイ州、米国</td><td>8545K27&nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>ガラス板、1/8 "厚さ、9 "x 9"</td> <td>McMaster-Carr、IL、USA</td><td>8476K191&nbsp;</td><td>2</td></tr><tr><td>デュアルアクション熱電コントローラー</td><td>WAtronix Inc, CA, USA</td><td>DA12V-K-0</td><td>1</td></tr><tr><td>IR LEDアレイ</td><td>Advanced Illumination, Rochester, VT, USA</td><td>AL4554-88024, PS24-TL</td><td>2 LEDアレイと1つの電源</td></tr><tr><td>エアコンユニット</td><td>Melcor Store</td><td>&nbsp;MAA280T-12</td><td>1</td></tr><tr><td>イメージングシステム</td><td></td><td></td><td>(必要な数量)</td></tr><tr><td>Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) Cマウントレンズ</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td> PEC21211 <td>KP</td><td>1</td></tr><tr><td>CCXC-12P05N 相互接続ケーブル</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>SOCCXC12P05N</td><td>1</td></tr><tr><td>DC-700 カメラ アダプター</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td></td><td></td></tr> SODC700 <tr><td>1 B+W 40,5 093 IR filter</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>65-072442</td><td>1</td></tr><tr><td>TiFFEN 40.5 mm 円偏光子</td><td>Amazon</td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>IR ビデオカメラ</td><td>産業用 ビジョン ソース, FL, USA</td><td>ソニー XC-EI50 (SY-XC-E150)</td><td>1</td></tr><tr><td>USBビデオコンバータ</td><td>The Imagingsource, NC, USA</td><td>dfg/USB2-It</td><td>1</td></tr><tr><td>iFlySpy2 (fly tracking software)</td><td>Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com</td><td>iFlySpy2</td><td>1</td></tr><tr><td>IC Capture 2.2 software</td><td>The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miscellaneous</td><td></td><td></td><td>(必要な数量)</td></tr><tr><td>ドレメル回転工具</td><td>Dremel, Racine, WI, USA</td><td>Dremel 8000-03&nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>ガラス切断用のダイヤモンドコーティングドリルビット</td><td>さまざまなサプライヤーから入手可能です。MSCインダストリアルサプライ株式会社、メルビル、ニューヨーク</td><td>90606328</td><td>1</td></tr></tbody></table>

のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; 4象限オルファクトメーターで

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

神経生物学における重要な課題は、適切な動物の行動を導くためにどのように機能するかを神経回路を理解することです。 キイロショウジョウバエは、その複雑な動作、強力な遺伝学的手法、およびコンパクトな神経系に起因する、このような調査のための優れたモデル系です。研究所行動アッセイは、長い自然環境の特性をシミュレートし、対応する行動（ 例えば走光性、走化性、感覚学習と記憶）1-3の基礎となる神経機構を研究するためにショウジョウバエで使用されています。特定の神経のサブセットを標識するトランスジェニックショウジョウバエ系統の大規模なコレクションの最近の可用性により、行動アッセイは、行動4-11でニューロンをリンクするために顕著な役割を担ってきました。一緒にデータ分析のための基本となる計算ルーチンと汎用性と再現性のパラダイムは、様々なgenotypと候補フライラインの迅速検査のために不可欠ですエス。特に有用な試験した動物、実験の期間および提示刺激の自然数で柔軟性がある設定がされています。選択肢のアッセイはまた、取得し、分析することが容易である再生可能なデータを生成する必要があります。ここでは、 ショウジョウバエが大きい4フィールドアリーナでハエの行動反応をアッセイするためのシステムおよびプロトコルの詳細な説明を提示します。セットアップは、単一の嗅覚刺激に対するハエの応答をアッセイするためにここで使用されます。しかしながら、同じ設定を複数の嗅覚、視覚的または光遺伝学の刺激、またはこれらの組み合わせを試験するために修飾することができます。嗅覚計の設定は匂いに応答するハエ集団の活動を記録し、計算の分析方法は、フライ行動を定量化するために適用されます。収集されたデータは、効率的なデータ収集および実験条件の最適化に不可欠であるの実験の迅速な読み出しを得るために分析されます。

4象限嗅覚計アッセイの記録と大規模な行動空間上に多くのハエの歩行活動を分析します。臭気物質は、1つ、2つ、3つ、または4つのすべての象限に入る空気流に導入することができます。臭いの非存在下では、ハエが自由にすべての4つの象限の間を移動します。この動作は、それが非意図的なバイアスがアッセイに導入されていないことを示しているように観察することが重要です。これらのバイアスは、光、温度変化、空気流の差、又は臭気の汚染物質を含むことができる。 図3Bは、25男性の4象限オルファクトメーターにおける行動応答を示し、25女性は、空気を乾燥させるために飛びます。収集したデータから単一のフライトラックはまた、 図3Bに強調表示され、このハエは全体の行動アリーナを模索していることを実証されています。 5分の試験期間にわたって分析した全てのトラックの魅力インデックススコア（AI）はindicati、0に近いです臭気象限に魅力の欠如をngの。同様に、実験の割合指数（PI）は、ハエが5分間の試験期間中にすべての4つの象限にかなり...

ここでは、最大100匹のビネガーフライ（Drosophila melanogaster）の嗅覚反応をアッセイするための行動設定とデータ分析方法を記述します。このシステムは、単一または複数の嗅覚刺激で使用でき、ニューロンサブセットの光遺伝学的活性化またはサイレンシングに適応できます。

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

このセットアップの全体的な目的は、提供された自動フライトラッキングソフトウェアスクリプトを用いて、4分画嗅覚計でのショウジョウバエの嗅覚行動を測定することです。この手法は、嗅覚神経系がいかにして外部世界を検知し、脳がどのように行動上の決定を解読し指示しているかという重要な課題の解明に役立ちます。この技術の主な利点は、汎用性と堅牢性にあり、広範な実験アリーナにおいて、ショウジョウバエの集団による嗅覚応答の繰り返し試験が可能であることです。本プロトコルでは、プラスチック製の外容器、ガラス製の内容器、およびカスタムメイドのPTFE製蓋インサートで構成される、5つの臭気チャンバーを準備します。このインサートは、中央部分を取り除き、2つのワンウェイバルブを取り付けたオリジナルの容器蓋です。4つの臭気チャンバーを溶媒コントロールとして使用し、1つのチャンバーをテスト臭気用に使用します。各チャンバーが清潔であることを確認し、1 mLの溶媒または希釈した臭気物質を臭気容器に入れます。次に、プラスチックチャンバー内の容器の位置を確認し、液漏れがないことを確認してください。漏れを防ぐため、スクリューキャップとPTFEインサート上のOリングを使用して蓋をしっかりと固定します。ハエを標準的なコーンミール培地で飼育する。標準的なボトルにオス30匹とメス30匹を入れ、室温で5日間産卵させる。このようなボトルから、羽化したばかりのハエを回収する。各実験群について、短時間の二酸化炭素麻酔下でオス25匹とメス25匹のハエを回収し、標準的なハエ培地で2〜4日間加齢させます。実験の40〜42時間前に、食餌のない状態で湿度を維持するため、約10 mLの1%アガロースゲルを入れたバイアルに群を移します。飢餓状態にすることで全身運動を増加させることができ、飢餓プロセスの生存率は90%以上である必要があります。弱遺伝子型の場合に起こり得ますが、10%以上が死亡した場合は、実験に使用するすべてのショウジョウバエを1日間飢餓状態にすることを試みてください。少なくとも5分前に温度コントローラーの電源を入れ、25 °Cに設定します。その後、プラスチックチューブを用いて臭気チャンバーをアリーナに接続します。電子流量計を使用して、アリーナの各クアドラントの空気流量を確認します。コントロール空気流と誘引物質空気流の両方が 100 milliliters per minute で流れていることを確認してください。ショウジョウバエは空気の流れに非常に敏感であるため、各実験の前に各クアドラントの空気流量を検証することが不可欠です。次に、70% ethanolを用いてアリーナとガラスプレートを洗浄します。すべての部品を2〜3回拭き上げ、完全に自然乾燥させてから次の工程に進みます。続いて、ガラスプレートをアリーナに固定します。次に、麻酔をかけずにハエをアリーナに移します。重力を利用して、ガラスプレートの片方にある穴からハエを進入させ、その後、穴を円形のメッシュで覆います。これで、ハエを入れたアリーナを遮光チャンバー内に配置します。次に、4つのコントロール気流を各アリーナのコーナーに接続します。チャンバーのドアを閉め、ショウジョウバエを10～15分間、新しい環境に慣らします。順応期間の後、ショウジョウバエを4つのコントロール気流にさらすコントロール実験を5～10分間行います。直ちにデータを分析することが不可欠です。ショウジョウバエがアリーナ内に均等に分布していない場合は、アリーナをリセットする必要があります。対照群のハエを用いて、きれいな空気に対する行動をテストすることが極めて重要です。これにより、すべての背景条件が正常であることを迅速に確認できます。漏光、温度の不均衡、アリーナの傾き、または臭気による汚染はすべて問題の原因となります。必要に応じて、ハエを廃棄し、アリーナを再度洗浄してください。臭気物質による汚染が疑われる場合は、すべてのチューブを交換してください。動物が4つの区画のいずれに対しても好性を示さなくなるまで、新しいコホートを用いてコントロールテストを繰り返します。その後、3方コックを使用してテスト臭気チャンバーを装置に接続するか、チューブを再接続し、5〜10分間のテスト実験を行ってください。実験的な記録時間が長くなる場合は、データファイルが大きくなりすぎるのを防ぐため、20分ごとにトラッキングプログラムを迅速に停止し、再起動してください。テストの間は、ハエを廃棄し、アリーナとガラスプレートを70% ethanolで洗浄し、コネクタチューブを交換してください。システムを継続的にフラッシュさせるため、乾燥空気の流れを維持してください。効率を高めるため、実験の合間に洗浄が行えるよう2つのアリーナを用意することが望ましい。同日に複数の実験で不具合が生じた場合は、前回のランによる臭気がシステム内に残っていないか細心の注意を払って確認すること。低濃度の臭気物質やCO2を用いる場合は通常問題にならないが、高濃度の刺激を用いる場合は、実験ランの間に最大24時間の間隔を空ける必要がある場合がある。データ解析には、提供されている専用のMatlabルーチンを使用して、データをMatlab形式に変換してください。トラッキングソフトウェアによってリアルタイムで作成された生データファイルを読み込み、アリーナの輪郭に沿った空間マスクを作成します。このマスクを生データに適用し、ノイズとなるアリーナ外のデータポイントをすべて除外してください。次に、3秒以上にわたって秒速0.163 cm未満で移動したすべてのデータポイントを除去します。これらのデータは、ノイズまたは移動していないハエである可能性が高いためです。これで、記録期間を通じてすべての残りのデータポイントをプロットし、可視化します。データは単一のトラジェトリーとして表示することも可能です。ショウジョウバエの行動データに基づいて、臭気の境界を迅速に推定できます。その後、誘引指数を算出し、テキストプロトコルに記載されている統計検定を行ってください。行動装置を用いて、オス25匹とメス25匹のショウジョウバエをテストした。乾燥した空気に反応し、ハエは特定の象限に偏ることなくアリーナ全体を探索した。線は1匹のハエの追跡軌跡を示している。リンゴ酢を左上象限の気流に導入したところ、ほとんどのハエがその臭気象限に誘引された。忌避性臭気物質である10% ethyl propionateを左上象限に導入したところ、その象限は回避された。この象限の誘引指数は0.68であった。誘引指数（attractive index）は、嗅覚応答測定において最も広く用いられている指数です。値がゼロより正であれば誘引を、負であれば忌避を示します。スクリプトによって、試行間でのアリーナ位置のわずかな変動が補正されました。ノイズである可能性のあるデータポイントや、移動していないハエは除外しました。テストは任意の時間で実施可能ですが、10秒ごとのビンでコホートの移動の変化を観察することで、臭気への慣れやその他の現象を把握することができます。このビデオを視聴することで、4フィールドアッセイを用いて嗅覚行動を効果的に実施および分析する方法を十分に理解できたはずです。習得後、各嗅覚実験は約1時間で完了でき、通常は1日に4回から6回の実験を行います。

olfactory-behaviors-assayed-computer-tracking-drosophila-four

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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組み合わせてコンピュータゲームベースの高密度脳波や赤外線視線追跡と行動実験

学ぶ4象限オルファクトメーターを用いたショウジョウバエの嗅覚行動アッセイ法。自動追跡ソフトウェアで集団の応答を解析し、神経系の感覚情報処理と行動決定メカニズムを解明する。

のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動

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