のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動

このセットアップの全体的な目的は、提供された自動フライトラッキングソフトウェアスクリプトを用いて、4分画嗅覚計でのショウジョウバエの嗅覚行動を測定することです。この手法は、嗅覚神経系がいかにして外部世界を検知し、脳がどのように行動上の決定を解読し指示しているかという重要な課題の解明に役立ちます。この技術の主な利点は、汎用性と堅牢性にあり、広範な実験アリーナにおいて、ショウジョウバエの集団による嗅覚応答の繰り返し試験が可能であることです。

本プロトコルでは、プラスチック製の外容器、ガラス製の内容器、およびカスタムメイドのPTFE製蓋インサートで構成される、5つの臭気チャンバーを準備します。このインサートは、中央部分を取り除き、2つのワンウェイバルブを取り付けたオリジナルの容器蓋です。4つの臭気チャンバーを溶媒コントロールとして使用し、1つのチャンバーをテスト臭気用に使用します。

各チャンバーが清潔であることを確認し、1 mLの溶媒または希釈した臭気物質を臭気容器に入れます。次に、プラスチックチャンバー内の容器の位置を確認し、液漏れがないことを確認してください。漏れを防ぐため、スクリューキャップとPTFEインサート上のOリングを使用して蓋をしっかりと固定します。

ハエを標準的なコーンミール培地で飼育する。標準的なボトルにオス30匹とメス30匹を入れ、室温で5日間産卵させる。このようなボトルから、羽化したばかりのハエを回収する。

各実験群について、短時間の二酸化炭素麻酔下でオス25匹とメス25匹のハエを回収し、標準的なハエ培地で2〜4日間加齢させます。実験の40〜42時間前に、食餌のない状態で湿度を維持するため、約10 mLの1%アガロースゲルを入れたバイアルに群を移します。飢餓状態にすることで全身運動を増加させることができ、飢餓プロセスの生存率は90%以上である必要があります。

弱遺伝子型の場合に起こり得ますが、10%以上が死亡した場合は、実験に使用するすべてのショウジョウバエを1日間飢餓状態にすることを試みてください。少なくとも5分前に温度コントローラーの電源を入れ、25 °Cに設定します。その後、プラスチックチューブを用いて臭気チャンバーをアリーナに接続します。

電子流量計を使用して、アリーナの各クアドラントの空気流量を確認します。コントロール空気流と誘引物質空気流の両方が 100 milliliters per minute で流れていることを確認してください。ショウジョウバエは空気の流れに非常に敏感であるため、各実験の前に各クアドラントの空気流量を検証することが不可欠です。

次に、70% ethanolを用いてアリーナとガラスプレートを洗浄します。すべての部品を2〜3回拭き上げ、完全に自然乾燥させてから次の工程に進みます。続いて、ガラスプレートをアリーナに固定します。

次に、麻酔をかけずにハエをアリーナに移します。重力を利用して、ガラスプレートの片方にある穴からハエを進入させ、その後、穴を円形のメッシュで覆います。これで、ハエを入れたアリーナを遮光チャンバー内に配置します。

次に、4つのコントロール気流を各アリーナのコーナーに接続します。チャンバーのドアを閉め、ショウジョウバエを10～15分間、新しい環境に慣らします。順応期間の後、ショウジョウバエを4つのコントロール気流にさらすコントロール実験を5～10分間行います。

直ちにデータを分析することが不可欠です。ショウジョウバエがアリーナ内に均等に分布していない場合は、アリーナをリセットする必要があります。対照群のハエを用いて、きれいな空気に対する行動をテストすることが極めて重要です。

これにより、すべての背景条件が正常であることを迅速に確認できます。漏光、温度の不均衡、アリーナの傾き、または臭気による汚染はすべて問題の原因となります。必要に応じて、ハエを廃棄し、アリーナを再度洗浄してください。

臭気物質による汚染が疑われる場合は、すべてのチューブを交換してください。動物が4つの区画のいずれに対しても好性を示さなくなるまで、新しいコホートを用いてコントロールテストを繰り返します。その後、3方コックを使用してテスト臭気チャンバーを装置に接続するか、チューブを再接続し、5〜10分間のテスト実験を行ってください。

実験的な記録時間が長くなる場合は、データファイルが大きくなりすぎるのを防ぐため、20分ごとにトラッキングプログラムを迅速に停止し、再起動してください。テストの間は、ハエを廃棄し、アリーナとガラスプレートを70% ethanolで洗浄し、コネクタチューブを交換してください。システムを継続的にフラッシュさせるため、乾燥空気の流れを維持してください。

効率を高めるため、実験の合間に洗浄が行えるよう2つのアリーナを用意することが望ましい。同日に複数の実験で不具合が生じた場合は、前回のランによる臭気がシステム内に残っていないか細心の注意を払って確認すること。低濃度の臭気物質やCO2を用いる場合は通常問題にならないが、高濃度の刺激を用いる場合は、実験ランの間に最大24時間の間隔を空ける必要がある場合がある。

データ解析には、提供されている専用のMatlabルーチンを使用して、データをMatlab形式に変換してください。トラッキングソフトウェアによってリアルタイムで作成された生データファイルを読み込み、アリーナの輪郭に沿った空間マスクを作成します。このマスクを生データに適用し、ノイズとなるアリーナ外のデータポイントをすべて除外してください。

次に、3秒以上にわたって秒速0.163 cm未満で移動したすべてのデータポイントを除去します。これらのデータは、ノイズまたは移動していないハエである可能性が高いためです。これで、記録期間を通じてすべての残りのデータポイントをプロットし、可視化します。

データは単一のトラジェトリーとして表示することも可能です。ショウジョウバエの行動データに基づいて、臭気の境界を迅速に推定できます。その後、誘引指数を算出し、テキストプロトコルに記載されている統計検定を行ってください。

行動装置を用いて、オス25匹とメス25匹のショウジョウバエをテストした。乾燥した空気に反応し、ハエは特定の象限に偏ることなくアリーナ全体を探索した。線は1匹のハエの追跡軌跡を示している。

リンゴ酢を左上象限の気流に導入したところ、ほとんどのハエがその臭気象限に誘引された。忌避性臭気物質である10% ethyl propionateを左上象限に導入したところ、その象限は回避された。この象限の誘引指数は0.68であった。

誘引指数（attractive index）は、嗅覚応答測定において最も広く用いられている指数です。値がゼロより正であれば誘引を、負であれば忌避を示します。スクリプトによって、試行間でのアリーナ位置のわずかな変動が補正されました。

ノイズである可能性のあるデータポイントや、移動していないハエは除外しました。テストは任意の時間で実施可能ですが、10秒ごとのビンでコホートの移動の変化を観察することで、臭気への慣れやその他の現象を把握することができます。このビデオを視聴することで、4フィールドアッセイを用いて嗅覚行動を効果的に実施および分析する方法を十分に理解できたはずです。

習得後、各嗅覚実験は約1時間で完了でき、通常は1日に4回から6回の実験を行います。