のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動ショウジョウバエ 4象限オルファクトメーターで
2016年8月20日
ここでは、最大100匹のビネガーフライ（Drosophila melanogaster）の嗅覚反応をアッセイするための行動設定とデータ分析方法を記述します。このシステムは、単一または複数の嗅覚刺激で使用でき、ニューロンサブセットの光遺伝学的活性化またはサイレンシングに適応できます。
このセットアップの全体的な目標は、付属の自動フライ追跡ソフトウェアスクリプトを使用して、4象限嗅覚計でハエの嗅覚行動をアッセイすることです。この方法は、嗅覚神経系がどのように外界を検出するか、および脳がどのように行動決定を解読し指示するかに関する重要な問題に対処するのに役立ちます。この手法の主な利点は、汎用性と堅牢性があり、大規模な実験場でハエの個体群による嗅覚反応の繰り返しテストを可能にすることです。
このプロトコルでは、プラスチック製の外部容器、ガラスの内部の容器、およびカスタムメイドのPTFE蓋インサートで構成される5つの臭気チャンバーを準備します。インサートは中央部を取り外したオリジナルの容器蓋で、2つのワンウェイバルブが取り付けられています。溶媒制御には4つの臭気チャンバーを使用し、テスト臭気物質には1つのチャンバーを使用します。
各チャンバーが清潔であることを確認してから、1ミリリットルの溶剤または臭気剤希釈液を臭気容器にセットします。次に、プラスチックチャンバー内の容器の位置を確認し、液体がこぼれていないことを確認します。漏れを防ぐために、PTFEインサートのスクリュートップとOリングを使用して蓋を固定します。
フライを標準的なコーンミール培地で飼育します。標準的なボトルにオス30匹、メス30匹を入れ、室温で5日間卵を産みます。そのようなボトルから、新しく閉じたハエを集めます。
各実験コホートについて、25匹のオスと25匹のメスのハエを短時間の二酸化炭素麻酔下で収集し、コホートを標準的なフライ培地で2〜4日間熟成させます。実験の40〜42時間前に、コホートを約10ミリリットルの1パーセントアガロースゲルを含むバイアルに移し、食物なしで湿度を確保します。飢餓は全体の動きを増やすのに役立ち、ハエの90%以上が飢餓プロセスを生き残るはずです。
10%以上が死亡する場合は、これは遺伝子型が弱い場合に起こり得ますので、実験に参加したすべてのハエに1日の飢餓状態を使用してみてください。少なくとも5分前に、温度コントローラーのスイッチを入れ、摂氏25度に設定します。次に、臭気チャンバーをプラスチックチューブを介してアリーナに接続します。
電子流量計を使用して、アリーナの各象限の空気流量を確認します。制御空気流と臭気空気流の両方が毎分100ミリリットルで流れていることを確認してください。ハエは気流に非常に敏感であり、各実験の前に各象限の気流を確認することが重要です。
次に、70%エタノールを使用してアリーナとガラスプレートを清掃します。すべての部品を2〜3回拭き取り、完全に風乾させてから作業を進めます。次に、ガラス板をアリーナに固定します。
次に、麻酔なしでハエをアリーナに移します。重力を使用して、ガラス板の1つの穴から入り、穴を円形のメッシュで覆います。次に、フライロードされたアリーナを光のないチャンバーに配置します。
次に、4つのコントロールエアストリームを各アリーナコーナーに接続します。チャンバーのドアを閉め、ハエが新しい環境に10〜15分間順応するのを待ちます。順応期間の後、ハエを4つの制御空気流にさらす5〜10分間の制御実験を実行します。
ここで、データをすぐに分析することが不可欠です。ハエがアリーナに均等に分布していない場合は、アリーナをリセットする必要があります。コントロールフライの挙動をきれいな空気だけにテストすることが重要です。
これにより、すべてのバックグラウンド条件が正常であることがすぐに確認できます。光の漏れ、温度の不均衡、アリーナの傾き、または臭いの汚染はすべて問題を引き起こす可能性があります。必要に応じて、ハエを捨ててアリーナを再度清掃します。
臭気物質の汚染が疑われる場合は、すべてのチューブを交換してください。動物が4つの象限のいずれにも選好を示さなくなるまで、新しいコホートで対照試験を繰り返し続けます。次に、三方弁を使用して試験臭気チャンバーをセットアップに接続するか、チューブを再度接続して5〜10分間試験実験を実行します。
実験記録を長時間行う場合は、トラッキングプログラムを20分ごとに迅速に停止して再開しないと、データファイルが大きすぎます。テストの合間に、ハエを捨て、アリーナとガラスプレートを70%エタノールで清掃し、コネクタチューブを交換します。乾燥した空気の流れを維持して、システムを継続的にフラッシュします。
効率を上げるには、走行中に清掃ができるようにアリーナを2つ用意するとよいでしょう。同じ日に複数の実験が間違っている場合は、前回の実行からシステムに臭いが残らないように細心の注意を払ってください。これは通常、低濃度の匂い物質やCO2では問題になりませんが、高濃度の刺激では、実験の実行間に最大24時間の間隔が必要になる場合があります。
データ解析には、付属のカスタムメイドの Matlab ルーチンを使用して、データを Matlab 形式に変換します。トラッキングソフトウェアでリアルタイムに作成した生データファイルを読み込み、アリーナの輪郭に沿った空間マスクを作成します。生データにマスクを適用して、アリーナの外側にあるすべてのデータポイント(ノイズを表すため)を削除します。
次に、毎秒 0.163 センチメートル未満で 3 秒以上移動するすべてのデータポイントを削除します。このデータは、ノイズや動かないハエである可能性が高いです。次に、残りのデータポイントを記録期間を通じてプロットして
視覚化します。データは 1 つの軌跡として表示することもできます。臭気の境界は、ハエの行動データに基づいて迅速に推定できます。次に、引力指数を計算し、テキストプロトコルで説明されているように統計テストを行います。
25匹のオスと25匹のメスのハエが行動装置でテストされました。乾燥した空気に反応して、ハエはどの象限も好まずにアリーナ全体を探索しました。この線は、1 つのフライの追跡軌跡を示しています。
アップルサイダービネガーが左上の象限の空気流に導入されたとき、ほとんどのハエはその臭いの象限に引き付けられました。忌避臭剤であるプロピオン酸10%エチルを左上の象限に導入したとき、その象限は避けられました。その象限の魅力的な指数は0.68を獲得しました。
魅力的な指標は、嗅覚反応測定で最も広く使用されている指標です。ゼロより上または下の値は、引力または反発を示します。このスクリプトは、トライアル間のアリーナポジションのわずかな違いを補いました。
ノイズや動かないハエであった可能性のあるデータポイントは削除されました。テストは任意の期間実行できますが、10 秒のビン全体でコホートの動きの変化を見て、匂いの慣れやその他の現象を理解するのは興味深いことです。このビデオを見れば、4フィールドアッセイで嗅覚行動を効果的に実行し、分析する方法を十分に理解できるはずです。
一度マスターすれば、各嗅覚実験は約1時間で完了し、私たちは日常的に1日に4〜6回の実験を行っています。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、酢虫（ショウジョウバエ）の嗅覚反応を評価するための行動セットアップとデータ分析方法を紹介します。このシステムは単一または複数の嗅覚刺激に使用するように設計されており、ニューロンのサブセットのオプトジェネティック操作に適応させることができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 行動生物学
- 嗅覚システム
背景
- この研究は、嗅覚ニューラルシステムが外部刺激をどのように検出するかに焦点を当てています。
- 脳が感覚情報をどのようにデコードするかを理解することは、行動決定にとって重要です。
- 嗅覚測定装置のセットアップにより、嗅覚反応の制御されたテストが可能になります。
- この方法は、繰り返しテストのために大規模なハエの集団に対応できます。
研究目的
- ショウジョウバエの嗅覚行動を分析すること。
- 嗅覚検出と行動反応のメカニズムを調査すること。
- 将来の研究のための汎用的で堅牢な実験フレームワークを提供すること。
使用された方法
- 行動アッセイに4象限の嗅覚測定装置を利用すること。
- データ収集のための自動ハエ追跡ソフトウェア。
- テスト用の特定の設定を持つ臭気室の準備。
- 比較のためにテスト臭気と並んで溶媒コントロールを含めること。
主な結果
- このセットアップにより、大規模なハエの集団における嗅覚反応の評価が可能になります。
- 様々な嗅覚刺激によるテストの汎用性が実証されています。
- 自動追跡による堅牢なデータ収集が実験の信頼性を高めています。
- アッセイ中にニューロンの活動を操作するためのオプトジェネティック応用の可能性。
結論
- この方法は、ショウジョウバエの嗅覚行動を研究するための包括的なアプローチを提供します。
- 嗅覚処理の神経基盤を探る道を開きます。
- このセットアップは、神経科学研究における様々な実験ニーズに適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This assay enables high-throughput, quantitative evaluation of olfactory-driven behaviors in Drosophila, supporting target validation in neuropharmacology and sensory neuroscience. By providing reproducible behavioral readouts linked to neural circuit function, it facilitates mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses involving olfactory processing or chemosensory pathways. The system’s adaptability to multiple stimuli and genetic models enhances its utility in early discovery workflows for lead identification and predictive confidence in target engagement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of olfactory neural circuits to validate targets involved in sensory detection and behavioral response pathways.
- Operational Value: Supports population-level behavioral screening with automated tracking, reducing variability and increasing throughput for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative attraction/repulsion indices that serve as phenotypic readouts for compound or genetic screening campaigns.
- Operational Value: Standardized airflow control and arena design ensure reproducibility across runs, enabling reliable assay validation for downstream applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from gene or target manipulation to measurable behavioral output, supporting translational biomarker alignment in sensory phenotypes.
- Operational Value: Compatible with genetic models (e.g., transgenic lines), allowing assessment of target knockdown or overexpression effects on olfactory-guided behavior.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genetic or pharmacological perturbations to quantifiable behavioral outputs, supporting progression from target identification to phenotypic validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of olfactory circuit function by measuring real-time behavioral responses to controlled stimuli.
- Screening: Provides assay-ready, standardized conditions for evaluating large cohorts of flies under defined olfactory challenges.
- Analytics: Delivers spatial behavioral data and attraction index calculations that allow quantitative comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects neural manipulation to observable behavior, supporting preclinical validity of targets in sensory processing pathways.
- Enterprise Reuse: The modular olfactometer design allows reuse across multiple projects, stimuli, and genotypes, promoting platform-level efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target-behavior relationships by reducing noise through automated tracking and behavioral filtering.
- Operational Value: Ensures reproducibility via strict airflow validation, arena cleaning protocols, and control experiment checks.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing clear, quantifiable behavioral phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on behavioral de-risking data from olfactory assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, behavioral assay design, and basic MATLAB or equivalent data analysis.
- Depends on airflow regulation equipment, odorant delivery systems, and video tracking hardware with environmental controls.
- Necessitates standardization of starvation protocols, arena cleaning, and control experiments to eliminate positional or contamination biases.
- Must account for genotype-specific survival rates during starvation and adjust protocols accordingly to maintain cohort viability.
- Limited by the need for frequent system flushing and potential cross-contamination with high-concentration odorants, requiring extended downtime between runs.
