Name: 偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層を持つシングルプロテオリポソームのSNARE媒介性の融合 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学ぶ偏光TIRF顕微鏡を用いたマイクロ流体フローセル内でのSNARE媒介性膜融合の単一分子検出法。リポソームと支持二分子層の融合動態を高時間分解能で観察し、神経伝達物質放出メカニズムの解明に貢献する。

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偏光TIRF顕微鏡の設計と建設について、ウラジミール・ポレエフ氏(イェール大学西キャンパスイメージングコア)に感謝します。また、2色検出装置の開発を支援してくださったDavid Baddeley氏(イェール大学)、そして議論を刺激してくださったJames E. Rothman氏(イェール大学)とBen O'Shaughnessy氏(コロンビア大学)とそのグループのメンバーに感謝します。EKは、Kavli FoundationからのKavli Neuroscience Scholar AwardとNIH助成金1R01GM108954によってサポートされています。

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

ここで説明するSUV-SBL融合アッセイの実装を成功させるには、良質のSBLsを得、そのようなリポソームへのタンパク質の機能的再構成などのいくつかの重要なステップ、に大きく依存し、単一分子を検出するために右の撮像パラメータを選択します。それが成功するためにいくつかの時間と労力がかかることがありますが、アッセイが正常に実装されれば、それははじめに考察される任意の他のインビトロ融合アッセイからは利用できません融合プロセスに関する豊富な情報を提供します。 SUV車が上にドッキングするとSBL、ドッキング・ツー・融合時間の分布と融合する料金で、脂質の拡散、すべての融合リポソームの大きさ、および与えられた融合イベントの脂質リリースがdiffusion-または細孔制御缶であるかどうか決定されます。リリースが拡散から予想よりもはるかに遅い場合は、細孔のちらつきを前提としたモデルは、脂質リリース利回りの遅滞、P 0、時間の割合の基礎となる細孔私融合27時のオープンです。 SBLs 15-17,21,22,3...

膜融合は、細胞内の脂質とタンパク質の輸送、分泌、受精、発育、および宿主生物1-3へのウイルスの侵入をエンベロープするために必要な普遍的生物学的プロセスです。エキソサイトーシスを介したホルモンや神経伝達物質の放出を含むほとんどの細胞内の核融合反応では、2つの脂質二重層を融合させるエネルギーが内に固定、同族可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体 （SNARE）タンパク質間の4ヘリックスバンドルの形成によって提供されています小胞（V-SNARE）及び標的膜（T-SNARE）4、。シナプス小胞のエキソサイトーシスは、最も厳密に制御核融合反応であり、活動電位1,4,5の到着後ミリ秒以内に行われます。融合孔、2融合区画間の最初の接続は、オープンちらつきおよび再密封または5-7不可逆的に拡大する前に複数回を閉じすることができます。前者の結果過渡、「キス＆ラン」の融合で、完全な融合に後者リードしながら。これら2つの融合のモードと細孔のちらつきを調整する機構との間のバランスを支配する要因はよく5,8を理解されていません。 SNAREタンパク質は、エキソサイトーシスのために必要とされます。シナプス小胞の融合は、神経毒9でのSNAREの切断の際に廃止されています。小さ ​​な単層ベシクル（SUV車）を使用してバルク融合実験は、膜融合10を駆動するのに十分のSNAREのみが必要とされないことを示したが、。このバルクアッセイでは、V字のSNARE（V-SUV）で再構成のSUVは、蛍光リン脂質（Nでドープされた- （7-ニトロ2-1,3-benzoxadiazol -4-イル）-phosphoethanolamine（NBD-PE）及び（ N - 。（リサミンローダミンBスルホニル）-phosphoethanolamine（LR-PE）およびt-SNAREと（T-SUV）を含む非標識小胞と混合当初のv-SUV車でNBD-PEの蛍光は蛍光共鳴エネルギー移動により消光される（FRET ）LR-PEへ。研究室として、ELED V-SUVが非標識T-SUV車と融合、今組み合わせた膜中の蛍光体表面密度が減少し、NBD-PEの蛍光の結果の増加は、脂質が10を混合の程度を報告します。バルクアッセイがセットアップし、分析することが容易であるように、広くSNARE媒介融合10-14のメカニズムを研究するために使用されています。しかし、そのような低感度と悪い時間分解能など、いくつかの制限を有します。ドッキングおよび融合との識別だけでなく、困難なhemifusion中間体の検出を行うすべてのイベントで最も重要なのは、アンサンブル測定など、その平均値をもたらします。 私たちを含め、過去十年間、いくつかのグループ、の上、単一小胞レベル15-27で融合イベントを監視するための新しいアッセイを開発しました。ハらは、表面に係留さV-SUV車を使用し、無料のT-SUV車18,19との融合を監視しました。脂質混合は脂質結合蛍光団のemのペア間のFRETを用いてモニターしました全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡18を用いて、それぞれ、VおよびTのSUVにベッド。その後、Brungerの研究室では、脂質と内容が20,28の混合の同時検出のためのコンテンツマーカーと一緒に単一の脂質ラベル種を使用しました。脂質およびコンテンツマーカーの両方が高い、自己消光濃度で含まれていました。非標識のSUVとの融合は、20,28の脱消光蛍光をもたらしました。 その他がt-SNAREと15-17,21-27,29で再構成平面二重層にV-のSUVを融合させています。ターゲットの平面形状（T-SNARE含む）二重層より良い模倣フラット形質膜と小、大きく湾曲した小胞の生理的な融合プロセスを。 T-のSNAREで再構成細孔貫通膜を用いスタイネム基は、多孔質窒化ケイ素基板上に懸濁させ、共焦点レーザー走査顕微鏡23を使用して個々 の V-SUV車との融合を検出しました。その他FT-SNAREとで再構成平面二重層するために使用されるV-SUVが、ガラス基板15-17,21,22,24-27,29でサポートされています。サポートされている二重層（SBLs）を使用することの大きな利点は、マイクロフルイディクスを使用しても使用してシングルイベント分解能を提供するが、TIRF顕微鏡法は、優れた信号対雑音比と、無料V-SUV車からの干渉なしにドッキングおよび融合事象を検出するために使用することができるということです標準の遠視野落射蛍光顕微鏡24。 主な関心事は、どのように基板-二重層相互作用がサポートされている二重層の品質と融合プロセスに影響を与えるかどうかです。初期の研究は、直接ガラスや石英基板15-17でサポートされていました平面SBLsを利用しました。これらSBLsは、基板上に拡散し、T-SUV膜の融合、破裂、吸着することによって作製しました。これは、すぐにキートン-SNAREコンポーネントを省略し、SNAP25は、このようにして調製SBLsからのv-SUVのドッキングおよび融合反応速度indistinguisをもたらしたこと、しかし、実現しました完全なT-SNAREと17を使用して得られたものからhable。 SNAP25は絶対に生体内 30,31 に融合するために必要とされるので、これらの初期の試みの生理学的関連性は疑問に入れました。タムのグループは、より良好に制御サポート二重層形成21を使用することで、この課題を克服しました。これは、T-SUV車21と、その単分子膜の融合が続くSBLのタンパク質を含まない最初のリーフレット、ためにラングミュア-ブロジェット堆積を使用していました。これは、SNAP25依存融合をもたらしました。 直接ラングミュア-ブロジェット法を使用することなく、ガラス基板上に支持二重層に関連する潜在的なアーチファクトを避けるために、Karatekin らは 、二重層と基板24との間に柔らかい、水和したポリ（エチレングリコール）（PEG）クッションを導入しました。この変形例はまた、SNAP25依存融合24を生じました。軟質ポリマー層上にクッション二層は、より良好な貫通を維持することが知られていましたタンパク質の移動度と機能32、およびウイルス33との融合の研究で使用されていました。また、PEG化された二重層は、自己治癒すると34,35非常に堅牢であるにいくつかの能力を保持するように見えます。まず、市販の、脂質結合PEG鎖の画分は、T-SUV膜に含まれています。これらのT-SUVのバーストと、ガラス基板上に平面二重層を形成する場合、PEGブラシは、平面二重層の両方の弁尖を覆います。平面二重層の形成は親水性のガラス表面上のT-SUV車の周囲のPEG鎖の付着によって駆動されるので、リポソームの破裂及び平面二重層の形成は、使用される脂質組成物に対して比較的鈍感です。コレステロールの大量に含まれている場合しかし、SUV車の凝集性を増加させる、SUVが自然に破裂しないことができます。この場合、浸透圧ショック、又は二価のイオンは、平面二重層の形成25を助けるために使用することができます。 このAPに、上記のようにPEGブラシが平面の両側をカバーローチ、二重層を支持しました。マイクロ流体流路に面するブラシはまた、通常、PEGの層で覆われている着信V-SUV車の非特異的付着を防止するのに役立ちます。 V-とt-SNARE複合体の形成は、膜近位領域36に向かって段階的に膜遠位N末端 ​​および進行から始まります。 V-SUV車がt-SBL、V-およびアッセイの条件下でケースのように思われるPEGブラシ、上に突出するT-SNARE N末端必要とやり取りするために。ブラシの高さは、PEG化脂質の濃度及びPEG鎖長37,38を変化させることによってのSNARE以外のタンパク質を研究するために適合させることができます。融合二重層の近位表面を覆うPEGブラシのもう1つの利点は、平方ミクロン39あたり30,000〜40,000内在性膜タンパク質で充填されている生体膜の混雑した環境を模倣することです。ただ、このアッセイにおけるPEG鎖のように、repu生体膜をカバーlsiveタンパク質層が発生する核融合のための2つのリン脂質二重層の間の接触を可能にするために脇にプッシュする必要があります。 彼らはユニークな利点を提供するように、マイクロ流体流路は、このアッセイで使用されています。まず、マイクロ流体の流れがt-SBLを形成するために拡散し、融合するT-SUV車のより均一な成膜を可能にします。第二に、小さなチャネル容量（&lt;1μl）をサンプルの消費を最小限に抑えます。第三に、必要な少量は、全実験は一定流量下で行うことを可能にします。流れは、弱いSBL 16からおそらく非特異的に、付着したV-のSUVを削除します。また、動力学的分析17を簡素化し 、T-SBLの上のv-SUV車の一定の密度を維持します。最後に、ドッキングされた小胞は、簡単に流れ25によって運ばれる無料のものと区別されています。第四に、いくつかのマイクロ流体チャネルは、各々が異なる状態をプロービング、同じカバーガラス上で使用することができます。これは、条件ドゥリの比較を可能にします同じ実験ランをngの。同様のアプローチは、インフルエンザウイルスとクッションSBLs 33との間の融合を研究するためにバンOijenグループが使用されてきました。 TIRF顕微鏡では、（〜100 nmの減衰定数を持つ）エバネセント場の指数関数的減衰は、ガラスバッファインタフェースの非常に近接している分子に蛍光励起を閉じ込めます。これは、遠く離れている蛍光分子の寄与を最小にする信号対雑音比を増加させ、10〜40ミリ秒のフレームの露光時間を有する単一分子感度を可能にします。エバネッセント場はまた、融合時の信号の増加につながる：SBLへのSUVからの標識脂質転送として、彼らはより強力な励起場で、平均して、自分自身を見つけます。蛍光の増加は、より大きなリポソームのために強いです。 偏光がエバネッセント場を生成するために使用される場合、付加的な効果は、T際の蛍光の変化に寄与するSBLへのSUVからのラベルのransfer。いくつかの脂質染料は、それらが埋め込まれた二層に対して好適な平均の角度で配向遷移双極子を持っています。偏光ビームが異なる二つの膜に色素を励起するので、これは、彼らがSBL 対 SUVにあるときに蛍光団によって放出される蛍光量の差を作成します。後者のために、双極子の向きが平坦SBLジオメトリによって制限される一方、前者の場合、励起光は、球状のSUVの周りに配向遷移双極子と相互作用します。染料は、膜29,40の脂質色素遷移双極子配向並列用SUVよりもSBLにあるとき、例えば、s偏光（入射面に垂直な偏光）の入射光を用いる場合には、励起がより効率的です（そのようなのDiIのことやDID 41-43など）。このような蛍光体でドープされたSUVは、ときにドックSBL（ 図7、Representatに暗く表示されます<html>アイブ結果）。融合孔が開き、SUVとSBL膜を接続するように、蛍光プローブは、SBL内に拡散し、s偏光エバネッセント場25,27,29によって励起される可能性が高くなります。その結果として、融合部位の周囲に統合蛍光シグナルは、SBL 27（ 図3及び図7）にSUVの色素転写中に急激に増加します。 SBLに移す際に、それらが希釈されるように融合を伴う変更を知らせるために貢献する追加の要因は、蛍光標識の脱消光です。なぜなら小さな割合のみ（脱消光の寄与は、ここに記載されたアッセイにおけるエバネッセント場の減衰や偏光効果に比べて、通常軽微であります<img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" /> ）脂質のは標識されています。 融合時のシグナル増加は、時間を比較することにより、融合細孔特性を推定するために利用することができ、1 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg &quot;/&gt;、脂質は実際の解放時間に脂質が自由に透過性である細孔を通って脱出するために必要な、 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" /> 。二つの時間スケールが同等である場合、細孔が脂質流れに対してほとんど抵抗を示すと結論されます。実際の放出時間が長い拡散制限のリリースのための時間よりも大幅にある場合は、これは脂質の放出を遅らせる、このような細孔ちらつきとして、プロセスを示すであろう。拡散制限解除時間、 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" /> 、定着リポソームおよび脂質拡散の大きさに依存します。その推定は、これら2つのパラメータを定量化することが必要です。アッセイの単一分子感度は、脂質拡散率は、すべての融合イベント26用SBLへのそれらのリリース後に、いくつかの単一の脂質の蛍光団を追跡することにより測定することができます。すべての融合小胞の大きさ（I）単脂質色素の強度、SUVの（ii）のすべてのフルオロフォアが融合時SBLに転送された後、ドッキング部位の周囲の合計の蛍光の変化、（III）は、公知の標識密度を組み合わせることにより、27を推定することができます脂質、および（iv）脂質当たりの面積。均一なSUVのサイズ44を想定して先に述べたように、多くの融合イベントでは、実際の脂質の放出時間は、拡散制御放出27で予想よりはるかに遅いことが判明しました。脂質リリースの遅延がちらつき細孔によるものであると仮定すると、定量的なモデルは「ポア開放性」の推定を可能にする、時間の割合は、細孔が融合27の間、開いたままになります。 たびに実用的な、脂質および可溶性内容のラベルの両方を使用して、融合メカニズムをテストすることが重要です。例えば、脂質リリースは、このようなトンを囲むSNAREタンパク質による脂質拡散の制限として細孔ちらつき以外のプロセスによって遅らせることができました彼は細孔。この場合であれば、次に、脂質標識の放出に先行することになる内容物の放出孔可溶性プローブ​​の通過を可能にするのに十分な大きさで提供。アプローチで、より根本的な欠陥は、SBLに対する標識脂質の転送が大きく、その融合前の形状を保持している小胞にSBLを接続する狭い融合孔を介して起こることを前提である可能性があります。以前脂質放出データだけでは29に基づいて提案されているようSBLへの脂質の転送はまた、SBL膜に付随するとの融合細孔の急速な拡張、SUVの非常に急速な崩壊から生じる可能性があります。両方の脂質を監視し、内容物を同時に放出し、それは多くの細孔がすべての脂質のラベルを解放した後再密封することを発見しましたが、その可溶性貨物27の一部を保持しました。これは、少なくともいくつかのリポソームが融合後SBLに崩壊し、SBLへの脂質色素転写が融合孔を介して発生することはありませんことを示しています。また、LIPIDと内容のリリースでは、脂質の放出の遅延は、細孔45を囲むSNAREタンパク質による脂質拡散の障害のために起因したこと、それはそうなって、同時に27が発生しました。 可溶性コンテンツのリリースを監視しませんでしたSUV-SBL融合プロトコルは、以前Karatekinとロスマン25によって出版されました。ここでは、より最近の開発は、含まれる脂質のすなわち同時モニタリング及び内容は解放し、SUV、脂質、および融合細孔特性27の推定されています。プロトコルは、カバーガラス25との溝を含むポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）エラストマーブロックを接合することによって作られたマイクロ流体細胞を調製するための命令で始まります。次に、脂質及びコンテンツマーカーの両方を有するV型のSUVの調製を説明します。セクション4および5は、電圧vSの導入を、マイクロ流体セルを組み立て、その場で SBLsを形成し、欠陥および流動性をチェックするための命令を提供しますフローセルと融合事象の検出にUVS。第6節は、データ分析のための手順を説明します。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Milli-Q (MQ) 水</td><td>ミリポア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 190 プルーフ</td><td>デコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A416P4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>コライドナトリウム (KCl)</td><td>AmericanBio</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490</td><td></td></tr><tr><td>N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-エタンスルホン酸] (HEPES)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409911000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>HEPES-KOH緩衝液(pH 7.4)</td><td></td><td></td><td>25 mM HEPES-KOH、140&nbsp;mM KCl、100&nbsp;&mu;エグタ、1&nbsp;mM DTT</td></tr><tr><td colspan="4">Solvents</strong</td></tr><tr><td>>Chloroform&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>9180-01</td><td>in glass bottle, CAUTION, wear PPE</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-03</td><td>in glass bottle, CAUTION, 着用 PPE</td></tr><tr><td colspan="4">Liposome preparation</td></tr><tr><td>Gastight Hamilton syringe</td><td>Hamilton</td><td>var. sizes</td><td>only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)</td></tr><tr><td>Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm スクリューキャップ培養チューブ</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td>70825-16</td><td>クロロホルム</td></tr><tr><td>1-パルミトイル-2-オレオイル-SN-グリセロ-3-ホスホコリン、16:0-18:1 PC (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td>脂質は、CHCl3 に溶解するか、密封されたバイアルに溶解した粉末として提供されます。開封時にアリコート。乾燥脂質膜として-20°Cで不活性雰囲気下で余分に保管します。CHCl3/MeOH (2:1, v/v) で-20°Cで貯蔵します。</td></tr><tr><td>1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(ナトリウム塩)、18:1 PS (DOPS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td>上記と同じです。</td></tr><tr><td>1-ステアロイル-2-アラキドノイル-SN-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、18:0-20:4 PE(SAPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850804</td><td>上記と同じ。</td></tr><tr><td>L-&α;-ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスリン酸(脳、ブタ)(アンモニウム塩)、脳PI(4,5)P2</td><td>Avanti極性脂質</td><td>840046</td><td>同じ。</td></tr><tr><td>1,2-ジオレオイル-SN-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-<>N-(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)(アンモニウム塩)、18:1 NBD PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145</td><td>上記と同じ。</td></tr><tr><td>1,2-ジオレオイル-SN-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-<>N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩)、18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880130</td><td>上記と同じ。</td></tr><tr><td>コレステロール(ヒツジウール、>98%)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>同上。</td></tr><tr><td>DiD'オイル;DiIC18(5)オイル(1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニン過塩素酸塩)</td><td>分子プローブ</td><td>D-307</td><td></td></tr>ロ<tr><td>タバポラリーR-210</td>ビ<td>ュッヒ</td><td>R-210</td><td>脂質のTm以上の熱浴</td></tr><tr><td>OG n-オクチル-ベータ;-D-グルコピラノシド</td><td>Affymetrix</td><td>0311</td>は<td>-20>で保存します。C、シェーカーを開く前にRTに来ましょう</td></tr><tr><td>- Eppendorf Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyze透析カセット、20k MWCO、3&nbsp;ml</td><td>life technologies</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 吸着剤</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&nbsp;密度勾配ミディア</td>ム <td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ、薄肉、超透明、13.2&nbsp;ml, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41 Ti ローター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スフロロダミンB</td><td>分子プローブ</td><td>S-1307</td><td></td></tr><tr><td>エコノカラム&nbsp;クロマトグラフィーカラム、2.5 &times;10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0150-01</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange Protein Gel Stain</td><td>Molecular Probes</td><td>S-6650</td><td>5,000x Concentrate in DMSO</td></tr><tr><td colspan="4">PDMS block</strong</td></tr><tr><td>>Sylgard 184 シリコーンエラストマーキット、PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>パイレックスガラスシャーレ、150 x 20 mm、カバー付き</td><td>コーニング</td><td>3160-152</td><td></td></tr><tr><td>ホールパンチャー - 再利用可能な生検パンチ、0.75&nbsp;mm</td><td>ワールド精密機器</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>手動穴あけ機&nbsp;</td><td>SYNEO</td><td>MHPM-UNV</td><td></td></tr><tr><td>ドリル .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN コーティング丸パンチ</td><td>SYNEO</td><td>CR0350265N20R4</td><td>ドリル直径: 0.9 mm、パンチ穴径: 0.74 mm</td></tr><tr><td>タイゴン マイクロボア チューブ、0.25 mm 内径 0.25 mm 、外径 0.76 mm</td><td>コール・パーマー</td><td>06419-00</td><td>0.010 インチ ID、0.030 インチ</td></tr><tr><td>OD シリコン・チューブ (0.51 mm 内径、2.1 mm 外径</td><td>コール・パーマー</td><td>95802-00</td><td>0.020 インチ内径 0.083 インチ</td></tr><tr><td colspan="4">カバーガラス - クリーンルーム清掃済み</td></tr><tr><td>Schott NexterionカバースリップガラスD</td><td>ショット</td><td>1472305</td><td></td></tr><tr><td>プラズマ</td><td>クリーナーHarrick</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">pTIRFセットアップとアクセサリー</td></tr><tr><td>IX81顕微鏡本体</td>オ<td>リンパス</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>EM CCDカメラ</td><td>Andor</td><td>ixon-ultra-897</td><td></td></tr><tr><td>サーモプレート、加熱顕微鏡ステージ</td>東<td>海ヒット</td><td>MATS-U52RA26</td><td></td></tr><tr><td>1 ml ハミルトンガラスシリンジ (4x)</td><td>ハミルトン</td><td>81365</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>kd サイエンティフィック</td><td>KDS-230</td><td></td></tr></tbody></table>

偏光tirf顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのsnare媒介性の融合

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

膜融合のユビキタス過程で融合孔の開口部は2以前は別々の区画との間の第1の接続を確立します。エキソサイトーシスを介した神経伝達物質やホルモンのリリース時には、融合孔が一過開閉することができ、繰り返し、貨物の放出動態を制御します。細孔ダイナミクスも小胞のリサイクルのモードを決定します。過渡、「キス・アンド・ラン」の融合で不可逆的な再スケーリング結果、拡張が完全融合につながる一方。より良好な細孔力学を支配するものの要素を理解するために、我々は、単一分子感度と〜生化学的インビトロ系内で明確に定義された15ミリ秒の時間分解能で偏光全反射蛍光（TIRF）顕微鏡を用いて膜融合をモニターするためのアッセイを開発しました。 Fusionは、蛍光軟質ポリマークッション（T-SBL、トン・サポート二重層上に支持され、T-SNAREとベアリング平面二重層とのv-SNAREタンパク質（V-SUV車）を含む単層小胞を標識しました）、監視されます。アッセイは、SUV車の一定の密度を供給しながら、最小限のサンプル消費量を確保するためのマイクロ流体流路を使用しています。融合時のSBLへのSUVからの脂質のラベルの転送時に迅速なシグナル増強を利用して、脂質色素転写の動態を監視します。 TIRF顕微鏡法の感度は、脂質拡散とSUVのサイズはすべての融合イベントを推定することが可能な単一の蛍光脂質標識を追跡することができます。脂質色素放出時間は、恒久的に開気孔を通じて妨げられずに通過させるために予想よりもはるかに長くすることができます。脂質リリースの遅延がちらつき細孔によるものであると仮定したモデル、細孔「開放性」、時間の割合を使用して、細孔が融合中に開いたまま、推定することができます。可溶性マーカーは、脂質および可溶性貨物リリースの同時モニタリングのためのSUVの中にカプセル化することができます。このような測定は、いくつかの細孔が可溶性貨物の一部を失った後、再密閉することができる示します。

SBLの品質 融合実験の前にSBLの品質および流動性を検証することが重要です。マイクロ流体チャネルの下、ガラス側での蛍光は、任意の明白な欠陥のない、均一でなければなりません。気泡がチャネルも合格した場合、それは通常、SBLに見える傷跡を残します。このような大規模な傷跡/欠陥がある場合は、そのチャネルを使用しないでください。時々、SUVが基板上に付着するが、連続SBLを破裂し、形成するために失敗することがあります。その場合は、蛍光はまだ非常に均一に見えるかもしれませんが、小さな領域を漂白した後に回復することはありません。導入を10mMのMg 2+は、多くの場合、この問題を解決するのに役立ちます。他の薬剤は、他の二価の陽イオン51、高分子溶液52、または浸透圧ショック25として、SUVの破裂を助けるために導入することができます。 </...

ここでは、単一分子感度と〜15ミリ秒の時間分解能で、偏TIRFMを用いたマイクロ流体チャネルにおけるリポソームおよびサポートされている二重層の間の単一、SNARE媒介融合事象を検出するためのプロトコルを提示します。脂質可溶性貨物放出を同時に検出することができます。リポソームサイズは、脂質拡散、および融合細孔特性が測定されます。

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

本アッセイの全体的な目的は、神経およびエキソサイトーシスに関与するSNAREタンパク質によって駆動される個々の膜融合イベントを観察し、神経伝達物質やホルモン放出の基本的なメカニズムを理解することです。この手法は、ダイナミックな融合孔を通じてどのようにカーゴの放出が起こるか、また融合後の融合孔の運命など、膜融合分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、生化学的に定義された環境下で、個々のイベントにおける小胞のドッキング、開口のための融合、およびカーゴ放出キネティクスの異なる段階を観察できることです。この手法はエキソサイトーシスの解析に有用ですが、感染時にエンベロープウイルスが標的細胞膜と融合する反応など、他の膜融合反応にも適用可能です。一般的に、マイクロファブリケーションからタンパク質精製、イメージングまで、習得すべき工程が多岐にわたるため、この手法を初めて扱う方は苦労することがあります。まず、標準的なフォトリソグラフィー技術とここに示すテンプレートを用いて、シリコンマスターモールドを作製してください。次に、100 millilitersのPDMSベースと10 millilitersの硬化剤を使い捨てプラスチックカップに加え、混合物をよく撹拌します。その後、カップを真空デシケーターに入れます。真空をかけますが、混合物が溢れ出さないよう注意深く監視してください。脱気後、脱気したPDMS混合液をガラス製ペトリ皿に大きく1滴滴下し、ウェハーの下に気泡が閉じ込められないよう、テンプレート側を上にしてモールドをPDMSの上に押し付けます。次に、ポリマーで5〜8 mmの厚さで覆われるまで、テンプレートの上に脱気したPDMSを流し込みます。気泡が生じた場合は、ピペットチップを用いて慎重に取り除いてください。PDMSで覆ったテンプレートをオーブンの水平な面に置き、60 °Cで3時間加熱します。次に、新しいメス刃を使用して、成形されたチャネル構造を含むPDMSブロックを切り出します。切り出したブロックがカバーガラスに適合させる必要があることに注意してください。次に、チャネル溝の側面を上に向け、穴あけパンチを使用して、一連の動作でブロックに穴を開けます。8か所の穴あけ箇所から、打ち抜かれた破片を必ず取り除いてください。完了したら、ブロックの溝を下にして、清潔なアルミホイルの上に貼り付けます。次に、チューブの一端をわずかに斜めにカットし、ピンセットを使用して、パンチで開けた穴の約3分の1までチューブを押し込みます。チューブは、バッファーリザーバーとシリンジポンプに届く長さにカットしてください。シリンジポンプのシリンジにチューブを接続するには、太めのシリコンチューブを短く切り、その一方の端に細いチューブを挿入します。この調整済みPDMSブロックは数ヶ月間保存可能です。まず、溶存ガスを除去し、接合実験中のマイクロ流路内での気泡発生リスクを低減させるため、PDMSブロックを高真空下に少なくとも20分間置きます。次に、顕微鏡ステージ領域が目的の温度に設定されていることを確認してください。温度が平衡に達するまで、t-SNAREタンパク質を含むNBD-PE蛍光ラベル化小単層小胞、またはタンパク質を含まないコントロールを、小胞30 microlitersを緩衝液60 microlitersで希釈して調製します。次に、この溶液を3 milliliterシリンジに吸い込みます。シリンジを垂直に保持したまま、サンプルの上の空気の大部分を押し出します。次に、パラフィンフィルムでチップを密封し、プランジャーを引いて真空状態にします。真空状態を維持しながら、シリンジのバレルを軽く叩き、溶液の脱気を促進させます。真空をかけた際に気泡が出なくなるまで、この操作を数回繰り返します。次に、マイクロ流路チューブよりもわずかに直径の大きい皮下注射針を使用して、マイクロ遠心チューブのキャップに穴を開けます。脱気した小型単層小胞（small unilamellar vesicles）をマイクロ遠心チューブに満たし、それを顕微鏡ステージ上のホルダーに設置して、溶液を設定温度まで平衡化させます。清潔なカバーガラスをプラズマクリーナーに入れ、約5分間エアプラズマ処理を行います。次に、カバーガラスを取り外し、処理した面を上にして、クッション代わりの糸くずの出ないティッシュペーパー数枚の上に置きます。続いて、PDMSブロックのパターン形成面を下にして、カバーガラスの上に配置します。ピンセットを使用してブロックを軽く押し付けますが、ガラスが割れないように強く押しすぎないでください。組み立てたフローセルを顕微鏡ステージに設置します。次に、チューブを小型単層小胞（small unilamellar vesicle）リザーバーとシリンジポンプに接続します。溶液がチャネルを完全に満たすまで、小型単層小胞を3 µL/minの速度で吸引し始めます。すべてのチャネルの溶液が出口側のチューブを上昇し始めたら、流量を0.5 µL/minに下げて、30〜45分間インキュベートします。プラズマ処理の効果は一時的であるため、ガラスカバースリップのプラズマ処理からチャネルへのSUVの注入までの時間は10分を超えないようにしてください。低倍率の対物レンズを用いた蛍光イメージングでチャネルに漏れがないかを確認し、その後、すべてのチャネルを脱気したバッファーでリンスして、未結合のベシクルを洗い流します。次に、TIRF顕微鏡用の高倍率油浸対物レンズに切り替え、フローセルをテープで顕微鏡ステージに固定します。視野絞りを直径約40 µmまで絞り、ソフトウェアを用いて488 nmの励起光強度を調整し、照射領域の蛍光を大幅に、ただし完全ではない程度に退色させます。未反応のNBD-PE分子が進入し、退色するまでに一定の距離を拡散するため、照射領域中央の蛍光強度は端の部分よりも低くなるはずです。しかし、表面吸着したSUVが破裂しなかった場合、露出領域内のすべての蛍光分子が退色するはずです。定常状態測定の結果を確認するには、一度照明を停止し、数分後に再開して蛍光が回復しているかを確認してください。再構成バッファーを脱気し、それを用いてv-SNARE再構成小単層小胞（SUV）ストック溶液を希釈し、視野内で60秒間に10～100回の融合イベントが発生するように調整してください。融合イベントが多すぎると背景蛍光が増加し、イベントの検出および解析が困難になります。逆に、融合速度が低すぎると統計的な信頼性が低下する可能性があります。v-SNAREを再構成した小型単層小胞を、2 µL/minの流速でチャネル内に流し、適切な励起・蛍光波長設定に切り替えて脂質ミキシングをモニターします。次に、付属のテキストプロトコルに従ってTIRF角度と偏光を調整します。561 nmレーザーを用いて、ベシクルの蛍光を連続的に励起およびモニタリングします。ベシクルがフローチャネルに到達し、支持脂質二層膜にドッキングして融合すると、背景蛍光信号が蓄積し始めます。ソフトウェアを介して励起レーザー強度を調整し、背景蛍光を連続的に退色させることで、新たなドッキングおよび融合イベントを容易に観察できるようにします。特定のチャンネルにおいて、異なる位置でいくつかの動画を取得します。NBD-PE蛍光を確認し、これらの位置で支持脂質二重層に欠陥がないことを検証してください。ここでは、欠陥が比較的少なく流動的な、t-SNAREを再構成した支持脂質二重層における光退色後蛍光回復（FRAP）を示します。NBD標識脂質の拡散による蛍光回復を追跡するため、低光量で領域をイメージングしています。脂質標識からの蛍光のみをモニタリングすることで、ドッキングおよび融合イベントをより容易に観察することができます。ここに示す一連の画像では、18ミリ秒ごとに1フレームが記録されました。融合が起こると、脂質ラベルが支持脂質二重層へと移行し、融合部位から拡散します。場合によっては、脂質の混合と可溶性カーゴの放出を同時にモニタリングすることが望ましいことがあります。脂質の混合と可溶性カーゴの放出が同時に起こっている代表的なイベントをここに示します。封入に使用される高濃度では、赤色で示されている可溶性内容物の蛍光は、当初は自己消光しています。青色で示されている脂質蛍光の急激な上昇は、前述の脂質ラベルの単色モニタリングと同様に、融合イベントによる脂質混合を示しています。細孔が開口すると、可溶性の内容物である色素が放出され、小胞内腔における色素の初期の自己消光が解消されます。これにより、赤色でプロットされた可溶性カーゴのシグナルが増加します。興味深いことに、カーゴの蛍光は安定したプラトーに達しました。これは、すべての脂質ラベルと可溶性カーゴの一部が放出された後に、孔が再封鎖したことを示しています。最後に、赤色で示されている可溶性内容物のシグナルが非常に急速に減少します。これは、急速な完全融合またはリポソームの破裂によるものと考えられます。このビデオを視聴することで、t-SNAREタンパク質で再構成した支持脂質二重層によるマイクロ流体フローセルの作製方法と、TIRF顕微鏡を用いた単一小胞融合イベントのモニタリングおよび解析方法について、十分に理解していただけるはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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