偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

このアッセイの全体的な目標は、ニューロンおよびエキソサイトーシスSNAREタンパク質によって駆動される個々の膜融合イベントを観察し、神経伝達物質とホルモン放出の基本的なメカニズムを理解することです。この方法は、動的融合孔を通じて貨物の放出がどのように発生するか、融合後の細孔の運命など、膜融合分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生化学的に定義された環境内の個々のイベントについて、小胞のドッキング、開口部の融合、および貨物放出速度の異なる段階を観察できることです。

この方法はエキソサイトーシスに関する洞察を得ることができますが、感染中のエンベロープウイルスと標的細胞膜との融合など、他の膜融合反応にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、微細加工からタンパク質精製およびイメージングまで、多くの異なるステップを習得する必要があるため、苦労するでしょう。まず、標準的なフォトリソグラフィー技術とここに示すテンプレートを使用して、シリコーンマスターモールドを準備します。

次に、100ミリリットルのPDMSベースと10ミリリットルの硬化剤を使い捨てプラスチックカップに加え、混合物をよく攪拌します。次に、カップを真空デシケーターに入れます。真空剤を当てますが、混合物があふれないように注意深く観察してください。

脱気したら、脱気したPDMS混合物をガラスのペトリ皿に大量に注ぎ、テンプレート側を上にして金型をPDMSに押し付けて、ウェーハの下に気泡が閉じ込められないようにします。次に、脱気したPDMSをテンプレートに注ぎ、ポリマーの5〜8ミリメートルで覆われるまで注ぎます。気泡が発生した場合は、ピペットの先端でそっと取り除

PDMSで覆われたテンプレートをオーブンの平らな面に置き、摂氏60度で3時間焼きます。次に、新しいメスの刃を使用して、成形されたチャネル構造を含む PDMS ブロックを切り取ります。切り取られたブロックは、カバースリップに収まる必要があることに注意してください。

次に、チャネルの溝の側面を上に置き、穴パンチを使用してブロックを1回の連続動作でドリルで穴を開けます。8つの穴のそれぞれからパンチアウトされたピースを必ず取り外してください。終了したら、ブロックの溝をきれいなアルミホイルに貼り付けます。

次に、チューブの一方の端がわずかに傾くようにカットし、ピンセットを使用してチューブをパンチ穴の約3分の1まで押し込みます。チューブをカットして、バッファーリザーバーとシリンジポンプに到達できるようにします。チューブをシリンジポンプのシリンジに接続するには、大きなシリコンチューブから短い部分を切り取り、片側に細いチューブを挿入します。

このすぐに使用できるPDMSのブロックは、数ヶ月間保管することができます。まず、PDMSブロックを高真空に少なくとも20分間置いて、溶存ガスを除去し、核融合実験中にマイクロ流体チャネル内の気泡のリスクを減らします。次に、顕微鏡のステージ領域が目的の温度に設定されていることを確認します。

温度が平衡化している間に、30マイクロリットルの小胞を60マイクロリットルの緩衝液で希釈することにより、t-SNAREタンパク質を含むNBD-PE蛍光標識小さな単層小胞、またはタンパク質フリーコントロールを準備します。次に、溶液を3ミリリットルの注射器に引き込みます。シリンジを垂直に保持しながら、サンプルの上の空気の大部分を押し出します。

次に、先端をパラフィンフィルムでシールし、プランジャーを引き下げて真空にします。バキュームを引っ張りながら、シリンジバレルを軽くたたいて、溶液の脱気を促進します。バキュームが適用されたときに気泡が発生しなくなるまで、このプロセスを数回繰り返します。

次に、マイクロ流体チューブよりわずかに大きい直径の皮下注射針を使用して、マイクロ遠心チューブのキャップに穴を開けます。脱気した小さな単層小胞を微量遠心チューブに充填し、顕微鏡ステージのホルダーに入れ、溶液を設定温度まで平衡化させます。清潔なカバースリップをプラズマクリーナーに入れ、カバースリップにエアプラズマを約5分間流します。

次に、カバースリップを取り外し、クッションとして機能する糸くずの出ないティッシュの上に、処理された面を上にして置きます。次に、パターン化された面を下に向けてPDMSブロックをカバースリップの上に置きます。ピンセットを使用してブロックをそっと押し下げますが、ガラスが割れるほど強く押さないでください。

組み立てたフローセルを顕微鏡ステージに置きます。次に、チューブを小さな単層小胞リザーバーとシリンジポンプに接続します。溶液がチャネルを完全に満たすまで、毎分3マイクロリットルで小さな単層小胞の吸引を開始します。

すべてのチャネルの溶液が出口側のチューブを上に移動し始めたら、流量を毎分0.5マイクロリットルに減らし、30〜45分間インキュベートします。ガラスカバースリップをプラズマ処理してからSUVをチャネルに流すまでの時間は、プラズマ処理の影響が一過性であるため、10分を超えてはなりません。低倍率対物レンズの蛍光イメージングでチャネルに漏れがないか確認し、脱気バッファーですべてのチャネルをすすぎ、結合していない小胞を洗い流します。

次に、TIRF顕微鏡用の高倍率油浸対物レンズに切り替え、フローセルを顕微鏡ステージにテープで固定します。磁場のダイアフラムを直径約40マイクロメートルに閉じ、ソフトウェアを使用して488ナノメートルの励起光強度を調整し、露光領域の蛍光を大幅に漂白しますが、完全には漂白しません。無傷のNBD-PE分子が漂白する前に一定の距離に入って拡散するため、露出領域の中央の蛍光強度は端よりも低くする必要があります。

ただし、表面に付着したSUVが破裂しない場合は、露出した領域のすべての蛍光色素が漂白する必要があります。スタディ状態の測定結果を確認するには、照明を停止し、数分後に再開して、蛍光が回復したかどうかを確認します。再構成バッファーを脱気し、それを使用してv-SNARE再構成した小さなユニラメラ小胞ストック溶液を希釈し、得られた溶液が60秒間にわたって視野内で10〜100回の融合イベントを生成するようにします。

核融合イベントが多すぎると、バックグラウンド蛍光が増加し、イベントの検出と解析が困難になります。対照的に、融合率が低すぎると、統計が不十分になる可能性があります。v-SNAREに再構成した小さな単層小胞を毎分2マイクロリットルの流量でチャネルに流し、適切な励起発光設定に切り替えて脂質混合を監視します。

次に、付属のテキストプロトコルで説明されているように、TIRF角度と偏光を調整します。561ナノメートルのレーザーを使用して、小胞の蛍光を連続的に励起し、監視します。小胞が流路に到達し、支持された二重層にドッキングして融合すると、バックグラウンド蛍光シグナルが蓄積し始めます。

ソフトウェアで励起レーザーの強度を調整し、バックグラウンド蛍光を連続的に漂白することで、新たなドッキングや融合イベントを容易に観察することができます。特定のチャンネルの異なる位置にある複数の映画を取得します。NBD-PE蛍光をチェックして、支持された二重層にこれらの位置に欠陥がないことを確認します。

光退色後の蛍光回復は、比較的欠陥がなく、流体であるt-SNARE再構成支持二重膜について示されています。この領域は、NBD標識脂質の拡散による蛍光回復を追跡するために、低光曝露で画像化されます。ドッキングや融合の観察は、脂質標識のみからの蛍光をモニタリングしながら行うのが簡単です。

ここに示す一連の画像では、フレームが 18 ミリ秒ごとに記録されています。融合すると、脂質標識は支持された二重層に移動し、融合部位から離れて拡散します。場合によっては、脂質の混合と可溶性カーゴの放出を同時に監視することが望ましい。

ここでは、脂質の混合と可溶性カーゴの放出を同時に説明する代表的なイベントを示します。カプセル化に使用される高濃度では、赤で描かれた可溶性含有量の蛍光は、最初に自己消光されます。青色で示されている脂質蛍光の急激な増加は、前述の脂質標識の単色モニタリングのように、融合イベントによる脂質混合を示しています。

細孔開口部は可溶性内容物の染料を放出し、小胞内腔での染料の最初の自己消光を緩和します。これにより、赤でプロットされた可溶性貨物信号が増加します。興味深いことに、貨物の蛍光は安定したプラトーに達しました。

これは、すべての脂質標識と可溶性貨物の一部を放出した後に、細孔が再密封されたことを示しています。最後に、赤で示した可溶性含有量のシグナルは、非常に急速に減少します。これは、急速な完全融合またはリポソームの破裂が原因である可能性があります。

このビデオを見れば、t-SNAREタンパク質で再構成された支持二重膜からマイクロ流体フローセルを調製する方法、およびTIRF顕微鏡を使用して単一の小胞融合イベントをモニターおよび分析する方法を十分に理解できるはずです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。