Name: ウィリスのマウスサークルを単離するためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 学ぶマウスウィリスサークル単離法。脳血管の大血管を構造を変えずに迅速に採取し、アルツハイマー病や脳アミロイドアンギオパチーなどの脳血管疾患における遺伝子発現研究を支援します。

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この作品は、パリVI大学とピエールファーブルイノベーション助成金によってサポートされていました。

すべての手順は、動物実験（イル=ド=フランス・パリ委員会、認可4270）のためのローカルの倫理委員会の承認を得て、実験動物の管理と使用のための欧州共同体の基準に準拠して行きました。 1.麻酔<ol><li>手術前に成体マウスにペントバルビタール（1ミリグラム/体重10gまで）を腹腔内（27ゲージの針および1-mlの注射器）の致死量を注入。 </li></ol> 2.船舶灌流注：血管灌流の間に目に獣医軟膏を適用する必要はありません。この手順は、（5-10分）迅速であり、動物の死で終わります。つま先のピンチと応答の欠如を確認してください。 <ol><li>ちょうど胸郭の下に、腹壁および腹膜に、虹彩のはさみを使用して、切開を行い、約4センチ。 </li><li> continuその後、振動板に小切開（数ミリ長い）を作成し、E胸郭の全長に沿って振動板の切開は胸膜腔を露出させます。 </li><li>離れて胸骨を持ち上げて、止血剤と胸骨の先端をクランプします。首に止血剤を配置します。慎重に心臓への胸骨を連結する脂肪組織をトリミングします。 </li><li>心尖に左心室を通って15ゲージの灌流針を渡します。 </li><li>最後に、コンセントを作成するために、肝葉の1をカットするはさみを使用しています。 注：代替出口は右心房への切開部を作成するために、虹彩のはさみを使用して作成することができます。 </li><li> 2.5ml /分の速度で作動するポンプを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の25〜50ミリリットルで動物を灌流。肝臓は血液のような湯通しをPBSに置換されるべきです。 </li><li>肝臓からの流体が完全にクリアされた後、約5分後、灌流を停止します。 </li><li>免疫染色や定期的な染色が計画されている場合は、パラホルムアルデヒド50mlで動物を灌流（PFA; PBS中4％）で15分間。 注：注意、PFAの煙は有毒です。 PFAと動物の灌流は、換気ドラフト内で行われるべきです。 </li></ol> 3.脳の単離とウィリスのサークル<ol><li> 脳の単離 <ol><li>手術用ハサミで頭を削除します。 </li><li>鼻に首から皮膚に沿って、アイリスハサミで正中切開を行います。 </li><li>頭蓋骨を露出させ、アイリスハサミで任意の残留筋肉や脂肪組織を除去するために皮膚を切り落とします。 </li><li>片側に大後頭孔にアイリスはさみの鋭い端を置き、慎重に（また、外耳道として知られている）外耳道に頭蓋骨の内面に沿って、それらをスライドさせます。 </li><li>対側に3.1.4で説明切開を再現し、矢状縫合の開始に間頭頂骨の内面に沿って切断正中線を作ります。 </li><li>植物アイリス前頭骨ではさみ、右眼の間、矢状縫合で、その後2で頭蓋骨を分割するためにそれらを開きます。 </li><li>嗅球をつかみ、その腹面に神経接続を遮断する虹彩のはさみを使用して、脳を持ち上げます。 </li><li>脳を外し牛の分離のための氷冷PBSを含む60 mmのペトリ皿に入れてください。完全にPBSで脳を浸します。脳は4％PFAで固定した場合（後続セク免疫染色や定期的な染色のため）、24時間4℃で4％PFAの浴に保管してください。 </li></ol></li><li> ウィリス動脈輪の単離 注：解剖顕微鏡をするCoW分離のために必要とされます。脳は全体の手順を通して4℃に保たれるべきです。 <ol><li>牛を可視化するために逆さまに（ すなわち、その背側表面上）脳を置きます。 </li><li> （嗅覚葉の基部で前大脳動脈（ACA）をつかむために、小さな鉗子を使用して、 <strオング&gt;、図1）および及ぼす圧力容器の連続からそれらを分離します。 B（ 図1）に、中大脳動脈（MCA）をカットするために、同じ手順を使用します。 </li><li>皮質から牛を形成する主要な動脈を持ち上げて除去するために鉗子の鋭い端を使用してください。 </li><li>ピンセットで中大脳動脈（MCA）を把持することにより、脳からそれらを切断し、後方の通信動脈（PCA）の開始を持ち上げます。前方動脈（ACAとMCA）をピックアップし、前方、背側方向の視交叉上で静かにそれらを引きます。 CoWの破壊を防止するために、他の動脈に対処するための手順を中断。 </li><li>繰り返しはdorsal-でそれらを引っ張って、3.2.2と優れたと後部小脳動脈（SCA）/（PCA）3.2.3（C、図1）および脳底動脈（BA） の（d、図1）のためのステップ前方方向。私記載された手順の最後で停止nは3.2.4。 </li><li>ピンセットで軽く引っ張ることにより、全体のCoWを削除します。氷冷PBSで満たされた60 mmのペトリ皿に牛を置き、小さなピンで所定の位置に牛を保持し、2鉗子で残っている添付の脳組織を除去します。 </li><li>またはタンパク質の抽出 - その後のRNA精製のための処理（約500 ngのRNAの抽出収率大量のRNA）のために-80℃で収穫したCoWを保管してください。 注：牛は、単離されたマウス嗅覚動脈用に開発された器官槽システムを適合させることにより、24時間のex vivoで維持することができる7。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> 図1：マウス脳牛をハイライト牛は2前大脳動脈（ACA）に由来している2つの内部頚動脈（MCA）、から形成されているの腹側図の略図;。脳底動脈（BA）事後（PCA）と優れた（SCA）に分岐し、脳動脈、および2つの椎骨動脈（VA）。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここではウィリス動脈輪の単離のための再現可能なプロトコルを記述します。牛を含む最も一般的な脳血管障害は、動脈血管の壁に影響を与えるのすべてがCAA関連血管障害、頭蓋内アテローム性動脈硬化症と頭蓋内動脈瘤、です。危険因子にはよく知られているが、これらの脳疾患の分子的病因はよくわかっていないままであり、その発生を予測するための特異的な生物学的マーカーが欠如しています。分子変化と肉眼観察をリンクするトランスジェニックマウスから牛を単離する方法にかなりの関心があります。例えば、（保坂ら 8で説明したように）特定の遺伝子がノックアウトされたマウスモデルで一貫動脈瘤を誘発し、牛を分析することにより、治療がこの遺伝子によってコードされるタンパク質を標的とするかどうかを決定することが可能でなければならない可能性頭蓋内動脈瘤および/またはクモ膜下出血を防ぎます。 Obviouずる、この方法はまた、ADの種々のトランスジェニックマウスモデルにおけるCAA関連血管障害の進行に対する特定の薬物の効果を分析するために使用することができます。 全体のマウスの微小血管を精...

また、ウィリス（のCoW）、Willisorウィリス多角形のループの円として知られる脳動脈円（大脳動脈輪）は、）最初のそれは、光学キアズマとすることができ、視床下部の周囲に位置する循環吻合である1664にトーマス・ウィリスによって記述されました脳および周囲の構造に血液を供給する中央ハブとみなすこと。血液は、内頸動脈と椎骨動脈を経由してこの構造体に入り、それが内部の中間及び後大脳動脈を経由して、円の外に流れます。これらの動脈の各々は、円の両側の枝を左右しています。完全な円を動脈通信基底、郵便通信、及び前方（ 図1及び図2）。流出動脈のいずれかに血流障害のリスクは、それによって、十分な血液がBに供給されることを保証し、頸動脈および大脳動脈の円に入る血液の融合によって最小化されます雨。この構造は、内頸動脈の重症閉塞性疾患における側副血流のための主経路として機能します。 脳血管障害のいくつかの種類の牛にその起源を持っています。最も一般的には1、2、3これらの障害が原因で血管拡張に低灌流につながる可能性があります。脳アミロイド血管症（CAA）関連血管障害、頭蓋内アテローム性動脈硬化症と頭蓋内動脈瘤であり、脳内および/またはくも膜下出血は、最終的には、虚血性または出血性脳卒中またはに変換しますせいぜい、一過性脳虚血発作。おそらく血管造影法と組み合わせた神経画像などの診断手順における最近の進歩は、それが可能な脳生検を必要とせず、臨床的にこれらの主要な脳血管疾患を診断するために行きました。それにもかかわらず、効果的かつ具体的な治療法（薬理学的または血管内）は、現在不足していると、新しい定義する必要性が存在します分子標的。 ヒトにおけるこれらの疾患の予防のための新規な薬物標的の同定は、動物モデル牛などの脳血管系を単離する方法を必要とします。このようなモデルは、頭蓋内動脈瘤、CAAまたは頭蓋内アテローム性動脈硬化症の動物モデルにおける大血管の壁に生じる、炎症性変化を含む特定の変更、にの証拠や手がかりを提供する必要があります。4、5、6 当社は、CAAのようなアルツハイマー病（AD）における血管の炎症の研究および関連疾患を容易にするために、マウスのCoWを単離するための方法を確立しました。マウスの牛を単離するためのこの方法は、疾患の進行中の炎症性脳血管遺伝子発現の評価のために開発されました。一緒に軟膜および軟膜動脈の壁内のアミロイドβ沈着の検出と、この方法は、簡単に阻止するために作ることができます鉱山炎症性脳血管壁での遺伝子発現およびAβペプチドの蓄積の間の可能な関係。くも膜下空間内の軟膜および軟膜を含む脳の血管網は、ウィリス動脈輪を形成する大きな動脈の拡張です。ここに記載された方法は、任意のマウス系統の牛を単離するために使用することができ、マウスの脳血管系の大きな血管のスクリーニング（ 例えば 、遺伝子発現、タンパク質産生、および翻訳後タンパク質修飾）すべてのタイプのために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコS リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>硬化ファインアイリスハサミ&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>はさみ-ストレート/シャープ/シャープ&nbsp;&nbsp;16.5 cm</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #7b 鉗子&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>立体ズーム顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND 表面 60mm 培養皿</td><td>コーニング</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&eacute;アニマル</td><td>FR/V/2770465 1992</td><td></td>年3月</tr></tbody></table>

ウィリスのマウスサークルを単離するためのプロトコル

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

ウィリス（のCoW）の大脳動脈輪（大脳動脈輪）または円は、脳や周囲の構造に血液を供給する光学キアズマと視床下部を取り囲む循環吻合術です。これは、脳アミロイド血管症（CAA）関連血管障害、頭蓋内アテローム性動脈硬化症と頭蓋内動脈瘤を含むいくつかの脳血管障害、に関与しています。その予防のための新規な薬物標的の同定のために、これらの疾患の根底にある分子メカニズムの研究は、動物モデルを必要とします。他のものは、ここで説明CoW.The方法は、任意のマウス系統でのCoW分離に適しており、（タンパク質産生の遺伝子の発現をスクリーニングするための大きな可能性を有しているなどの、脳血管系の単離を含むであろう一方、これらのモデルのいくつかは、トランスジェニックであってもよいです翻訳後タンパク質修飾など secretome分析、）マウスの脳の大型船舶に関する研究血管系。それはまた、単離されたマウスの嗅覚動脈のために開発された臓器槽システムを適合させることにより、ex vivoでの研究のために使用することができます。

<html> PBS-灌流マウスが殺され、プロトコルのセクション3.2で説明したようにCoWが単離されます。解剖が正しく実行されると、牛は一枚で出てくるべきであるとによる血管系の残留血液の不在にわずかに透明であるべきです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> 図2： 分離後のマウスのCoW。 10-cmのペトリ皿中のCoWの（A）の概要。（B）のCoWの様々な枝の詳細。中大脳動脈のためのMCA、前大脳動脈、脳底動脈のためのBAのためのACA、PCA優れた脳動脈のための後大脳動脈とSCAのために。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54352/54352fi...

ここでは、ウィリスのマウスサークルを分離するための再現可能なプロトコルについて説明します。

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

この解剖手順の全体的な目的は、マウスのウィリス動脈輪を単離し、マウス脳血管系の大血管の研究を容易にすることです。この手法は、アルツハイマー病や脳アミロイドアンギオパチーなど、脳血管に影響を及ぼす様々な疾患における脳血管の遺伝子発現の研究において、重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、血管構造を変化させることなく、大血管を迅速かつ容易に単離できることです。まず、アイリス剪刀を使用して、致死量のアネステジアを投与したマウスの肋骨直下の腹壁および腹膜に4 cmの切開を加えます。次に、横隔膜に数mmの切開を加え、肋骨の全長に沿って切開を広げ、胸腔を露出させます。胸骨を持ち上げ、その先端を止血鉗子で固定し、鉗子を頸部に乗せて保持します。次に、胸骨と心臓を繋いでいる脂肪組織を慎重に除去します。続いて、15ゲージの灌流針を左心室から心尖部へと刺入し、ハサミで肝葉の1つを切除して灌流液の流出口を設けます。ポンプ速度2.5 mL/minで、PBS 25〜50 mLを約10分間投与して動物を灌流します。血液がPBSに置き換わるにつれて、肝臓は白くなっていくはずです。肝臓からの流出液が完全に透明になったら、灌流を停止します。脳を単離するために、アイリス剪刀を用いて、首から鼻にかけて皮膚に正中切開を加えます。アイリス剪刀を用いて皮膚を切り取り、頭蓋骨を露出させ、残っている筋肉や脂肪組織を除去します。次に、アイリス剪刀の先端を大後頭孔の片側に挿入し、頭蓋骨の内壁に沿って外耳道まで慎重に滑らせます。大後頭孔の反対側にも同様に切開を加え、続いて間頂骨の内壁に沿って正中切開を行い、矢状縫合の始点まで切開します。閉じたアイリス剪刀を、両眼間の前頭骨にある正中縫合に挿入し、刃を開いて頭蓋骨を2つに分割します。ピンセットで嗅球を把持し、アイリス剪刀を用いて脳の腹側の神経接続を切断します。その後、脳を氷冷PBSを入れた60 millimeterのシャーレに浸します。ウィリス動脈輪を単離するため、ディッシュを解剖顕微鏡下の氷上に置き、脳を背側に向けてウィリス動脈輪を可視化します。小鑷子を用いて嗅球基部の前大脳動脈を把持し、圧力を加えて動脈を血管連続体から分離させます。中大脳動脈も同様に切断します。次に、ピンセットの尖端を用いて中大脳動脈を把持し、後交通動脈の起始部を持ち上げて、両方の動脈群を脳から切り離します。続いて前大脳動脈を持ち上げ、視交叉を越えて前背方向にゆっくりと牽引します。同様の手順で上小脳動脈と後小脳動脈を除去し、その後に基底動脈をずらします。最後に、ピンセットを使用してウィリス動脈輪全体を氷冷PBSを入れた60mmペトリ皿に慎重に移し、小さなピンで血管を固定します。2本のピンセットを用いて、残っている脳組織を注意深く取り除いてください。ウィリス動脈輪は一体となって取り出されるはずであり、血管内に残留血液がないため、わずかに透明に見えます。洗浄されたウィリス動脈輪では、Smooth Muscle Actin、Smooth Muscle-Myosin Heavy Chain、Smoothelinなどの血管平滑筋細胞マーカーが特異的に発現します。対照的に、myelin oligodendrocyte glycoproteinやmicrotubule-associated protein 2などの神経マーカーは、ウィリス動脈輪ではかろうじて検出できる程度であるはずです。さらに、ウィリス動脈輪以外の神経組織における血管内皮マーカーであるE-Selectinの発現は、ウィリス動脈輪のサンプルで得られた結果と非常に似ており、これは脳毛細血管ネットワークの存在を反映している可能性があります。この手法を習得し、適切に実施すれば、2時間で完了させることができます。この手順を行う際は、マウスの脳血管は非常に細く、破れやすいことに留意することが重要です。したがって、構造全体を一体として回収できるよう、急がず、細心の注意を払って解剖を行う必要があります。本手法の開発により、炎症性神経疾患分野の研究者が、アルツハイマー病や脳アミロイドアンギオパチーなどの関連疾患のマウスモデルを用いて、脳血管障害を探索することが可能になります。このビデオを視聴することで、マウスからウィリス動脈輪を単離する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、マウスの脈絡叢から免疫細胞を分離する手順を示しています。この手順は、脈絡叢の免疫細胞が脳の健康やさまざまな神経疾患にどのように影響するかを理解するための神経免疫学の研究で使用されます。...

マウス脈絡叢からの免疫細胞の単離

我々は、再現性を高めるために左前下行枝（LAD）に結紮の位置決めにおいてより明確にするために可能にするマウスモデルにおける心筋梗塞（MI）をシミュレートするための実験的虚血/再灌流（I / R）傷害を誘導するための外科的方法を紹介マウスでのMIの実験の。...

左前下の動脈の結紮を通して心筋虚血再灌流傷害のマウスモデル

炎症は虚血性脳卒中の病因において中心的な役割を果たします。証拠の増加は、それが初期の脳損傷を悪化させるだけでなく、後の修復にも寄与する両刃の剣として機能することを示唆しています。このプロトコルは、虚血性脳からの免疫細胞の単離と、その後のフローサイトメトリー表現型について記述しています。...

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

このプロトコルの目的は、冠循環からマウスの一次血管平滑筋細胞（VSMC）の単離および培養技術を実証することです。たVSMCが単離されたら、それらは、多くの標準的な培養技術のために使用することができます。...

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

マウス頸動脈および大動脈の顔面の準備を行う手順が記載されている。そのような調製物は、特異的抗体で免疫蛍光染色されたとき、共焦点顕微鏡法によってタンパク質の局在化および血管壁全体の細胞型の同定を研究することができる。...

マウスの血管の顔面準備

ここでは、健康で機能的なプライマリ...

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

ここでは、微生物学的手法とMALDI-TOF質量分析によるその後の同定を用いたユニークな眼綿棒および培養ベースの濃縮ステップを用いた有酸素性および気性嫌気性マウスの結合性のコンメンサルト菌の分離と増幅のためのプロトコルを提示する。...

マウスにおける結膜経月の分離と同定

細胞および分子機能実験の心臓病学のゴールドスタンダードは心筋細胞です。この記事では、マウス心筋細胞を単離するための非ランゲンドルフ法への適応について説明します。...

マウス心筋細胞を一貫して単離するための簡単で効果的な方法

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。...

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

この論文では、真皮リンパ管からマウス内皮細胞を磁気ビーズベースで単離する方法について説明しています。単離されたリンパ内皮細胞は、下流の in vitro 実験やタンパク質発現解析に使用できます。...

マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離

学ぶマウスウィリスサークル単離法。脳血管の大血管を構造を変えずに迅速に採取し、アルツハイマー病や脳アミロイドアンギオパチーなどの脳血管疾患における遺伝子発現研究を支援します。

ウィリスのマウスサークルを単離するためのプロトコル

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