ウィリスのマウスサークルを単離するためのプロトコル

この解剖手順の全体的な目標は、マウスの脳血管系の大きな血管の研究を容易にするために、ウィリスのマウス輪を分離することです。この方法は、アルツハイマー病や脳アメロイド血管障害など、脳血管に影響を与えるさまざまな疾患における脳血管遺伝子発現の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、血管の構造を変えることなく、大きな血管を迅速かつ容易に分離できることです。

まず、虹彩ハサミを使用して、胸郭のすぐ下にある致死的な麻酔をかけたマウスの腹壁と腹膜に長さ4センチメートルの切開を行います。次に、横隔膜に数ミリメートルの長さの切開を行い、胸郭の全長に沿って切開を続けて胸膜腔を露出させます。胸骨を持ち上げ、先端を止血器で固定し、止血器を首に置きます。

次に、胸骨と心臓をつなぐ脂肪組織を慎重にトリミングします。次に、15ゲージの増殖針を左心室から心臓の頂点に通し、はさみを使用して肝葉の1つを切断し、灌流液の出口を作成します。動物に25〜50ミリリットルのPBSを毎分2.5ミリリットルのポンプ速度で約10分間灌流します。

血液がPBSに置き換わると、肝臓は白くなるはずです。肝臓からの液体が完全に透明になったら、灌流を停止します。脳を分離するには、虹彩はさみを使用して、首から鼻までの皮膚に沿って正中線を切開します。

アイリスハサミで皮膚を切り取り、頭蓋骨を露出させ、残っている筋肉や脂肪組織を取り除きます。次に、虹彩はさみの先端を大孔の片側に置き、頭蓋骨の内面に沿って先端を外耳道まで慎重にスライドさせます。大孔の反対側で同様の切開を行い、続いて壁間骨の内面に沿って矢状縫合の開始まで正中線を切開します。

矢状縫合糸の目の間の前頭骨に閉じた虹彩はさみを植え、刃を開いて頭蓋骨を2つに分割します。鉗子を使用して嗅球をつかみ、虹彩はさみを使用して脳の腹側表面の神経接続を切断します。次に、氷のように冷たいPBSの60ミリメートルのペトリ皿に脳を浸します。

ウィリスの円を分離するには、解剖顕微鏡で皿をアイスパックに移し、脳をその背側表面に向けると、ウィリスの円が視覚化されます。小さな鉗子を使用して、嗅葉の基部にある前大脳動脈をつかみ、動脈を血管連続体から解離するように圧力をかけます。同様に中大脳動脈を切断します。

次に、鉗子の鋭い端を使用して中大脳動脈をつかみ、後部連通動脈の始まりを持ち上げて、両方の動脈セットを脳から切断します。次に、前動脈を持ち上げ、視交叉を前方背方向にそっと引っ張ります。同様に上小脳動脈と後小脳動脈を切除し、続いて脳底動脈を変位させます。

最後に、鉗子を使用して、ウィリスの円全体を氷のように冷たいPBSを含む60ミリメートルのシャーレに穏やかに移し、血管を小さなピンで所定の位置に固定し、2つの鉗子を使用して残っている脳組織を慎重に取り除きます。ウィリスの円は一体で出てくるはずで、血管系に残留血液がないため、わずかに透明である必要があります。ウィリスのきれいな円は、平滑筋アクチン、平滑筋-ミオシン重鎖、スムースリンなどの血管平滑筋細胞マーカーを特異的に発現する必要があります。

対照的に、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質や微小管関連タンパク質2などのニューロンマーカーは、ウィリスの円ではほとんど検出できないはずです。さらに、内皮マーカーであるE−セレクチンの発現は、ウィリス神経組織の非円中で、ウィリスサンプルの円について得られたものと非常に類似しており、おそらく脳−毛細血管ネットワークの存在を反映している。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば2時間で完了することができます。

この手順を試みる際には、マウスの脳血管が非常に細かく、簡単に壊れることを覚えておくことが重要です。したがって、解剖は、構造全体が一体で収穫されることを確実にするために、急ぐことなく非常に慎重に実施する必要があります。この技術の開発後、この技術は、炎症性神経疾患の分野の研究者が、アルツハイマー病および脳アミロイド血管症などの関連疾患のマウスモデルで脳血管障害を探求する道を開きます。

このビデオを見た後、マウスからウィリスの円を分離する方法をよく理解しているはずです。