Name: 電気を使用してニューロンと1次元と2次元培養における磁場の外部励起 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶ 電気・磁気刺激法を用いた1次元・2次元ニューロン培養モデルの構築と神経興奮パラメータ測定。クロナキシー・レオベース測定により脳刺激技術の理解と神経疾患診断・治療への応用を促進する。

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著者たちは、Ofer Feinerman、Fred Wolf、Menahem Segal、Andreas Neef、Eitan Reuvenyに非常に有益な議論に感謝します。著者は、この技術の初期バージョンの開発について、Ilan BreskinとJordi Sorianoに感謝します。作者は理論的概念の助けを借りてTsvi TlustyとJean-Pierre Eckmannに感謝します。この研究は、ミネルバ財団、イスラエル科学技術省、イスラエル科学財団助成金1320/09およびバイナショナル科学財団助成金2008331によって支援された。

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

1Dパターニングは、様々な用途に使用することができる重要なツールです。例えば、我々は、ラット海馬ニューロン5のクロナキシーおよび基電流を測定するために、より最近ニューロン培養物29からの論理ゲートを作成するための1次元パターニングを使用している、とと比較してダウン症候群海馬ニューロンにおける発火活動の信号伝搬速度の減速します野生型（WT）海馬ニューロン27。 1Dパターニングの推奨プロトコルは、ロバストであり、任意の所望のパターンを形成することが容易です。私たちは、測定がその機能に影響を与える可能性があるネットワークの任意の可能な切断、を認識する前に、1D文化を観察することをお勧めします。 ニューロンの構成のケミカルパターニングを区別履歴30、31、32を</sup...

ニューロンおよび外部電場との相互作用は、基本的な意味合いだけでなく、実用的なものを持っています。それは外部から印加される電界が組織を励起することができるボルタの時代から知られているが、ニューロンにおける結果として得られる活動電位の生成を担うメカニズムは、ごく最近、4 3、2、1解明され始めています。これは、電場2、5に応答ニューロンにおける膜電位の脱分極、膜特性のとイオンチャネルの役割、さらには地域の原因となるメカニズムに関する質問への回答を見つけることが含まれます。治療的神経刺激6、7、8、9、 <supクラス=「外部参照」は&gt; 10個の方法論は、被災地を標的とすると治療の結果を理解するために重要であることができ、この情報に特に依存しています。このような理解はまた、治療プロトコルと、脳内の異なる領域を刺激するための新しいアプローチを開発するのに役立ちます。 in vivoでの脳内の相互作用を測定することは、この理解に重要な要素が追加されますが、頭蓋骨内の測定の不正確さと低制御性によって妨げられています。対照的に、培養物中の測定を容易に高精度、ノイズ性能に優れた信号と再現性と制御性の高い大量に行うことができます。集合的ネットワーク動作のニューロン特性の多種多様を14、13、12、11明らかにすることができる培養物を使用して、 </sup&gt; 15、16。同様に、このよく制御されたシステムは、他の刺激方法がoptogeneticallyアクティブニューロン17、18の光刺激の間のチャネル開口部、19は活動電位を生成するための責任がある方法、例えば、動作するメカニズムを解明するには非常に効率的であることが期待されます。 ここでの焦点は、効率的に外部電界を経由してニューロンを励起することができるツールの開発と理解を記述するにあります。本稿では、バス電極によって異なる構成と直接印加される電界の向きを使用して、刺激を二次元の調製と一次元パターン化された海馬培養物を記述し、そして最終的に二次元の刺激とによって一次元培養をパターニング時間的に変化する電界を誘起する磁界を、5、20、21。

<table><tbody><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8054</td><td>ネットワークを切断します。セクション2.4.2</td></tr><tr><td>B27 supp</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>メッキ媒体で言及されています。セクション1.1.1で言及</td></tr>されている<tr><td>bicuculline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14343</td>ネットワーク<td>を切断します。セクション2.4.2で言及されている</td></tr><tr><td>ホウ砂(四ホウ酸ナトリウム十水和物)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640</td><td>ホウ酸緩衝液。セクション1.1.2で言及</td></tr>されている<tr><td>ホウ酸</td><td>Frutarom Ltd</td><td>5550710</td><td>ホウ酸緩衝液。セクション1.1.2で言及</td></tr>されています<tr><td>CaCl2、1 M</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>21098</td><td>細胞外記録ソリューション。セクション1.5.2CNQX</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td>に記載されている<td>ネットワークを切断します。セクション 2.4.2</td></tr><tr><td>COMSOL</td><td>COMSOL Inc</td><td>Multiphysics 3.5</td><td>数値シミュレーションで言及されています。セクション3.5.2で言及</td></tr>されている<tr><td>D-(+)-グルコース、1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>65146</td><td>めっき培地、細胞外記録溶液。セクション1.1.1および1.5.2</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td>細胞培養で言及されています<td>。セクション 1.2.4 および 1.2.6</td></tr><tr><td>FCS (FBS)</td> <td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>めっき媒体に記載されています。セクション1.1.1</td></tr>フィ<tr><td>ブロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td>バイオコーティングで言及されています<td>。セクション1.2.6</td></tr>、<tr><td>Fluo4AM、</td><td>生命技術</td><td>、F14201</td>、<td>自発的または誘発された活動のイメージングで言及されています。セクション1.5.1、1.5.3、および1.5.5FUDR</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td>交換媒体で言及されています<td>。セクション1.4.1</td></tr><tr><td>ジェンタマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1272</td><td>メッキ媒体、チェンジングメディウム、ファイナルメディウムで言及されています。セクション 1.1.1</td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>めっき媒体、交換媒体、最終媒体で言及されています。セクション1.1.1</td></tr><tr><td>Hepes、1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td>細胞<td>外記録溶液で言及されています。セクション1.5.2</td></tr><tr><td>HI HS</td><td>BI</td><td>04-124-1A</td><td>メッキ媒体、交換媒体、最終媒体で言及されています。セクション1.1.1、1.4.1、および1.4.2</td></tr><tr><td>KCl,&nbsp; 3 M</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td>Extracellular recording solutionで言及されています。セクション1.5.2で言及</td></tr>されています <tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>L2020</td><td>バイオコーティング。セクション 1.2.6</td></tr><tr><td>MEM x 1</td><td>Gibco</td><td>21090-022</td><td>めっき媒体、交換媒体、最終媒体で言及されています。セクション1.4.1&nbspで言及されています。&nbsp;&nbsp;1.4.2</td></tr><tr><td>MgCl2、1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>細胞外記録溶液。セクション1.5.2</td></tr><tr><td>NaCl、4 M</td><td>Bio-Lab</td><td>19030591</td><td>細胞外記録溶液で言及されています。セクション1.5.2</td></tr><tr><td>オクタデカンチオール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01858Cr-Au</td><td>コーティングカバースリップ(1D培養)のクリーニングで言及されています。セクション1.2.3で言及</td></tr>されています <tr><td>Pluracare F108 NF Prill</td><td>BASF Corparation&nbsp;</td><td>50475278</td><td>バイオリジェクションコーティング、バイオコーティング。セクション1.2.4および1.2.6で言及</td></tr>されている<tr><td>ポリ-L-リジン0.01%溶液&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>&nbsp;P47075</td><td>細胞分裂の促進。セクション1.1.4</td></tr>ショ<tr><td>糖、1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td>細胞<td>外記録溶液で言及されています。セクション1.5.2</td></tr>チ<tr><td>オール&nbspで言及されています。</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1858</td><td>バイオリジェクションコーティング。セクション1.2.3</td></tr><tr><td>URIDINE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>Changing mediumで言及されています。セクション1.4.1で言及</td></tr><tr><td>されているスパッタリングマシン</td><td>AJAインターナショナル株式会社</td><td>ATC Orion-5シリーズ&nbsp;</td><td>ガラスを薄い金属層でコーティングします。セクション1.2.2</td></tr>ペン<tr><td>プロッターで言及されています&nbsp;</td><td>ヒューレット・パッカード&nbsp;</td><td>HP 7475A</td><td>はコーティングされたカバースリップに模様のエッチング。セクション1.2.5</td></tr>電極<tr><td>ワイヤーで言及されています&nbsp;</td><td>AMシステム、カールスボーWA</td><td>767000</td><td>ニューロン培養の電気刺激。セクション2.1、2.2、2.3、および2.4.5</td></tr>信号<tr><td>発生器</td><td>BKPrecision</td><td>4079</td><td>電気信号の整形で言及されています。セクション2.3で言及</td></tr>されている <tr><td>Amplifier</td><td></td><td></td>自家製<td>電圧 amp信号発生器から電極への信号の増幅。セクション2.3</td></tr><tr><td>電源</td><td>マトリックス&nbspで言及されています。</td><td>MPS-3005 LK-3&nbsp;</td><td>スパッタリング装置への電源供給セクション1.2.2.3</td></tr><tr><td>経頭蓋磁気刺激</td>マグ<td>スティム、スプリングガーデン、英国</td><td>ラピッド2</td><td>ニューロン培養の磁気刺激で言及。セクション3.1、3.3、および3.4</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Cognis</td><td>Versamid 140</td>自家製<td>コイルの鋳造で言及されています。セクション3.4</td></tr><tr><td>エポキシ</td><td>シェル</td><td>EPON 815で言及されています。</td><td>自家製コイルの鋳造。セクション3.4で言及されている</td></tr><tr><td>プラチナワイヤー0.005インチの厚さ。A-M Systems,&nbsp;</td><td>&nbsp;カールスボーWA&</td><td>nbsp;767000</td><td>ニューロン培養の電気刺激。セクション2.1で言及</td></tr>された<tr><td>円形磁気コイル</td><td>自家製</td><td></td>ニューロン<td>培養の磁気刺激。セクション3.3</td></tr><tr><td>WaveXpress SW</td><td>B&で言及Kプレシジョン&nbsp;</td><td></td><td>波形編集ソフト。セクション2.1.32</td></tr><tr><td>Xion Ultra 897</td><td>Andor</td><td></td><td>Sensitive EMCCDカメラで言及されています。セクション2.4.4で言及</td></tr></tbody></table>

電気を使用してニューロンと1次元と2次元培養における磁場の外部励起

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

その膜電位が一定の閾値を超えた場合、ニューロンは活動電位を発射します。脳の典型的な活動では、これは、シナプスへの化学入力の結果として生じます。しかし、ニューロンも課せられ、電界によって励起することができます。特に、最近の臨床応用には、外部から電場を作成することによって、神経細胞を活性化させます。これは、ニューロンが外部磁場に応答して、何が活動電位が発生する方法を検討することが重要です。幸いなことに、外部電場の正確かつ制御されたアプリケーションは、切除解離、および培養物中で増殖させ、胚性神経細胞のために可能です。これは、再現性の高いシステムではこれらの質問の調査を可能にします。 本論文では、ニューロン培養物に対する外部電界の制御された適用のために使用される技術のいくつかが検討されています。ネットワークは、いずれか1次元、 すなわちリネアにパターニングすることができますR形態または基板の全体面上に成長させ、したがって、二次元。また、励起は、流体中に浸漬電極を介して電界の直接適用（バス電極）または磁気パルスのリモート作成を使用して電場を誘導することによって作成することができます。

提示プロトコルは、神経細胞培養の容易なパターニングが可能になります。それは私たちが刺激のために開発され、いくつかの方法と組み合わせると、それは、健康と病気のニューロン27の特性を比較するための関数としての文化を刺激するための最適な方法を見つけるために、そのような時値および基電流5のように、いくつかの固有のニューロンの特性の測定を行うことができますその構造と、より多くの斬新なアプローチ。いくつかの例を次の図に示されています。 図3に示します 図1Dは、バイオ拒絶層にエッチングされた構成をパターニングします。約170ミクロン幅の細い線は、典型的には、例えば、典型的には、変化する半径（ 図3A）又は平行線と同心リングできることが刻まれ〜11ム・ロング（ <str...

神経細胞培養は、単一ニューロンまたはニューロンの人口への影響を通じて新興脳刺激技術を研究するための良いモデルです。ここに提示バス電極によって直接生成または時間変化する磁場によって誘起される電界によりパターニング神経細胞培養物の刺激のための異なる方法があります。

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

1次元および2次元培養の電気および磁気刺激のためのこのプロトコルの全体的な目標は、脳刺激の縮小モデルとしてニューロン培養を効率的に使用し、そこから洞察と重要なパラメータを抽出することです。1次元培養物を用いた電気刺激プロトコルを用いることで、神経興奮に関連する特定のパラメータ、例えば、ニューロンの異なるコンパートメントにおけるクロナキシーやレオベースを測定することができます。磁気刺激技術により、神経細胞培養に対する磁界と電界の影響を比較することができます。このモデルにより、脳障害をより適切に診断および治療することもできます。私たちは、一次元ネットワークを含むあらゆるデザインパターンでパターンニューロンネットワークを培養するための効果的で簡単な方法を提案します。次に、これらのネットワークに対して電場と時間変動磁場を向けて、ニューロンの異なるコンパートメントからの寄与を分離して観察することができます。この技術の主な利点は、人間の被験者や動物モデルを必要とせず、ニューロン刺激の適切なパラメーターを広範かつ網羅的に検索できることです。この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるユーリ・ブルニシェフと、研究室の博士課程の学生であるアミ・アイゼンです。まず、バイオリジェクション層で部分的にコーティングされたガラスカバースリップに神経細胞を播種することにより、パターン化されたニューロン培養物を調製します。これを行うには、25ミリメートルのカバースリップを清掃します。そして、スパッタリングマシンを使用して、カバーガラスをバイオリジェクト層でコーティングします。成膜プロセスのパラメータを調整して、コーティングの安定性を確保する6〜10オングストロームの薄いクロムフィルムと、コーティングにチオール反応性を提供する30オングストロームの厚さの金層からなる層を作成します。プロセスが完了したら、スパッタリングマシンからカバースリップを取り外し、得られたコーティングを調べます。次に、プロッターペンのインク先端を鋭利な金属エッチング針に交換して、変更されたペンプロッターシステムを組み立てます。硬いプレートに接着されたゴムシートをプロッタにセットして、エッチング時に頑丈で高摩擦の表面を確保します。次に、プロッターに付属のボタンを押して、シートの位置を調整します。ゴムシートが所定の位置に配置されたら、その表面に小さな水滴をピペットで入れ、事前にコーティングされたカバースリップを液滴の上に置きます。次に、プロッタを使用して、200マイクロメートルの太さの線を生成する反復引っかき傷によって金属層をエッチングし、目的のパターンを作成します。電気刺激の前に、播種したカバーガラスをイメージングチャンバーに入れます。一定方向の電界で細胞を刺激するには、11ミリメートル離れて、13ミリメートルのカバースリップにメッキされた培養物の反対側に位置する2つの平行電極を使用します。次に、ワイヤー電極が細胞外培地に浸され、培養物の1mm上に配置されるように、培養イメージングチャンバーと一致する電極ホルダーを組み立てます。次に、1つの電極ペアをオペアンプに接続し、発電機からの信号を増幅します。50%のデューティサイクルと22ボルトの振幅を持つバイポーラ方形波の単一パルスを適用します。電極で発生する可能性のある電気分解を避けるために、DC成分を含まないバイポーラ波を使用してください。10マイクロ秒から4ミリ秒のパルスを印加して、効果的な刺激を確保しながら細胞の損傷を防ぎます。方向が変化する電界で細胞を刺激するには、2つの垂直な電極ペアを使用します。2対の電極、およびそれらの電源端子と監視端子が互いに電気的に完全に絶縁されており、アースから浮いていることを確認してください。電界の向きを変更するには、2つの電極ペアに印加される電圧の振幅を変化させます。次に、ベクトル加算によって結果のフィールドの強度と方向を決定します。固定振幅の回転場を生成するには、一方の電極ペアに正弦波を印加し、もう一方のペアに余弦波を供給します。磁気刺激を開始するには、円形に成長したニューロン培養物を顕微鏡下に配置します。市販されている標準的な円形磁気刺激コイルと支持刺激装置を使用して培養物を刺激します。非標準の磁場強度で培養物を刺激するには、カスタムメイドの磁気刺激コイルをカスタムメイドの刺激装置に接続します。次に、レーザーポインターを使用して、培養物の中心をコイルの中心に合わせ、刺激が成功するようにします。コイルの位置を調整して、培養物の中心から約5mm上に留まるようにします。刺激コイルが適切に配置されたら、刺激装置を最大5キロボルトの電位に負荷をかけます。次に、大電流高電圧スイッチを使用して、高電圧電流を刺激コイルに放電し、培養ニューロンの活動を刺激する磁気パルスを生成します。最後に、ニューロン培養物と同じ位置にピックアップコイルを取り付け、生成された磁場の強度を測定します。この概略図は、2対の電極に異なる振幅の電圧パルスを印加することにより、手動で培養物を回すことなく、電界をあらゆる角度に向けることができることを示しています。これは、異なる印加電圧での電気刺激によるカルシウム過渡現象の記録例です。一定の持続時間の電界を印加すると、電界に発火して応答するニューロンの数は、電圧の振幅の関数として累積ガウス分布を示します。そして、これは、このプロトコルを採用して得られた強度-持続時間曲線の一例です。磁場に応答するリング培養では、培養半径とともに刺激の成功率が増加します。このグラフは、リングのサイズと磁場の強さの関係を示しています。培養物の最も成功した励起は、実験的にアクセス可能な相の空間と高確率領域との間の重なりにあります。習得すれば、1次元培養物の調製は3〜4時間以内に行うことができます。電気刺激と磁気刺激を行うときは、刺激ステップから培養物を完全に回復させ、すべての機器が電気接地に対して浮いていることを確認することを忘れないでください。この手順に従うことで、脳のさまざまな領域からニューロンを培養したり、皮質ニューロンなどの統計を測定したりするなど、他の問題に対処できます。別の可能性は、任意の疾患モデルニューロンのパラメータを測定することです。開発後、この技術は、効果的かつ安全な脳刺激に必要な強度と持続時間の最適化への道を開くことができる。このビデオを見た後、ニューロン培養の任意の望ましいパターンを作成する方法、およびニューロンと電磁場との相互作用の研究のためにそれらを電気的または磁気的に刺激する方法について十分に理解しているはずです。

external-excitation-neurons-using-electric-magnetic-fields-one-two

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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