電気を使用してニューロンと1次元と2次元培養における磁場の外部励起

1次元および2次元培養の電気および磁気刺激のためのこのプロトコルの全体的な目標は、脳刺激の縮小モデルとしてニューロン培養を効率的に使用し、そこから洞察と重要なパラメータを抽出することです。1次元培養物を用いた電気刺激プロトコルを用いることで、神経興奮に関連する特定のパラメータ、例えば、ニューロンの異なるコンパートメントにおけるクロナキシーやレオベースを測定することができます。磁気刺激技術により、神経細胞培養に対する磁界と電界の影響を比較することができます。

このモデルにより、脳障害をより適切に診断および治療することもできます。私たちは、一次元ネットワークを含むあらゆるデザインパターンでパターンニューロンネットワークを培養するための効果的で簡単な方法を提案します。次に、これらのネットワークに対して電場と時間変動磁場を向けて、ニューロンの異なるコンパートメントからの寄与を分離して観察することができます。

この技術の主な利点は、人間の被験者や動物モデルを必要とせず、ニューロン刺激の適切なパラメーターを広範かつ網羅的に検索できることです。この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるユーリ・ブルニシェフと、研究室の博士課程の学生であるアミ・アイゼンです。まず、バイオリジェクション層で部分的にコーティングされたガラスカバースリップに神経細胞を播種することにより、パターン化されたニューロン培養物を調製します。

これを行うには、25ミリメートルのカバースリップを清掃します。そして、スパッタリングマシンを使用して、カバーガラスをバイオリジェクト層でコーティングします。成膜プロセスのパラメータを調整して、コーティングの安定性を確保する6〜10オングストロームの薄いクロムフィルムと、コーティングにチオール反応性を提供する30オングストロームの厚さの金層からなる層を作成します。

プロセスが完了したら、スパッタリングマシンからカバースリップを取り外し、得られたコーティングを調べます。次に、プロッターペンのインク先端を鋭利な金属エッチング針に交換して、変更されたペンプロッターシステムを組み立てます。硬いプレートに接着されたゴムシートをプロッタにセットして、エッチング時に頑丈で高摩擦の表面を確保します。

次に、プロッターに付属のボタンを押して、シートの位置を調整します。ゴムシートが所定の位置に配置されたら、その表面に小さな水滴をピペットで入れ、事前にコーティングされたカバースリップを液滴の上に置きます。次に、プロッタを使用して、200マイクロメートルの太さの線を生成する反復引っかき傷によって金属層をエッチングし、目的のパターンを作成します。

電気刺激の前に、播種したカバーガラスをイメージングチャンバーに入れます。一定方向の電界で細胞を刺激するには、11ミリメートル離れて、13ミリメートルのカバースリップにメッキされた培養物の反対側に位置する2つの平行電極を使用します。次に、ワイヤー電極が細胞外培地に浸され、培養物の1mm上に配置されるように、培養イメージングチャンバーと一致する電極ホルダーを組み立てます。

次に、1つの電極ペアをオペアンプに接続し、発電機からの信号を増幅します。50%のデューティサイクルと22ボルトの振幅を持つバイポーラ方形波の単一パルスを適用します。電極で発生する可能性のある電気分解を避けるために、DC成分を含まないバイポーラ波を使用してください。

10マイクロ秒から4ミリ秒のパルスを印加して、効果的な刺激を確保しながら細胞の損傷を防ぎます。方向が変化する電界で細胞を刺激するには、2つの垂直な電極ペアを使用します。2対の電極、およびそれらの電源端子と監視端子が互いに電気的に完全に絶縁されており、アースから浮いていることを確認してください。

電界の向きを変更するには、2つの電極ペアに印加される電圧の振幅を変化させます。次に、ベクトル加算によって結果のフィールドの強度と方向を決定します。固定振幅の回転場を生成するには、一方の電極ペアに正弦波を印加し、もう一方のペアに余弦波を供給します。

磁気刺激を開始するには、円形に成長したニューロン培養物を顕微鏡下に配置します。市販されている標準的な円形磁気刺激コイルと支持刺激装置を使用して培養物を刺激します。非標準の磁場強度で培養物を刺激するには、カスタムメイドの磁気刺激コイルをカスタムメイドの刺激装置に接続します。

次に、レーザーポインターを使用して、培養物の中心をコイルの中心に合わせ、刺激が成功するようにします。コイルの位置を調整して、培養物の中心から約5mm上に留まるようにします。刺激コイルが適切に配置されたら、刺激装置を最大5キロボルトの電位に負荷をかけます。

次に、大電流高電圧スイッチを使用して、高電圧電流を刺激コイルに放電し、培養ニューロンの活動を刺激する磁気パルスを生成します。最後に、ニューロン培養物と同じ位置にピックアップコイルを取り付け、生成された磁場の強度を測定します。この概略図は、2対の電極に異なる振幅の電圧パルスを印加することにより、手動で培養物を回すことなく、電界をあらゆる角度に向けることができることを示しています。

これは、異なる印加電圧での電気刺激によるカルシウム過渡現象の記録例です。一定の持続時間の電界を印加すると、電界に発火して応答するニューロンの数は、電圧の振幅の関数として累積ガウス分布を示します。そして、これは、このプロトコルを採用して得られた強度-持続時間曲線の一例です。

磁場に応答するリング培養では、培養半径とともに刺激の成功率が増加します。このグラフは、リングのサイズと磁場の強さの関係を示しています。培養物の最も成功した励起は、実験的にアクセス可能な相の空間と高確率領域との間の重なりにあります。

習得すれば、1次元培養物の調製は3〜4時間以内に行うことができます。電気刺激と磁気刺激を行うときは、刺激ステップから培養物を完全に回復させ、すべての機器が電気接地に対して浮いていることを確認することを忘れないでください。この手順に従うことで、脳のさまざまな領域からニューロンを培養したり、皮質ニューロンなどの統計を測定したりするなど、他の問題に対処できます。

別の可能性は、任意の疾患モデルニューロンのパラメータを測定することです。開発後、この技術は、効果的かつ安全な脳刺激に必要な強度と持続時間の最適化への道を開くことができる。このビデオを見た後、ニューロン培養の任意の望ましいパターンを作成する方法、およびニューロンと電磁場との相互作用の研究のためにそれらを電気的または磁気的に刺激する方法について十分に理解しているはずです。