蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）と生鮮・冷凍ラット脳組織からのFos発現ニューロンの遺伝子発現解析

この手順の全体的な目標は、Fos発現ニューロンを新鮮または凍結した成体ラット脳組織から解離させ、その後の蛍光活性化細胞選別(FACS)を行うことです。この方法は、行動活性化ニューロンのユニークな分子神経適応を特定するために、目的のニューロン細胞を単離するために使用できます。この技術の主な利点は、凍結組織の使用を可能にし、異なる日に複数の脳領域から細胞を分離することを容易にすることです。

この新鮮な脳組織を処理するには、氷のように冷たい脳スライスマトリックスのスロットに2枚以上の予冷済みのカミソリの刃を挿入して、関心のある脳領域を含む1〜2ミリメートルの冠状スライスを切断し、切片を冷却したガラス板の上に置きます。まず、関心のある脳の領域を解剖し、他の領域を破棄し、白質を取り除きます。組織を凍結するには、サンプルをマイクロチューブに移し、チューブをマイナス40°Cのイソペンタンに20秒間浸し、さらに処理するまでマイナス80°Cで保存します。

組織をミンチするには、サンプルを冷たいガラスプレートで1分以内解凍してから、サンプルを1〜2滴のバッファーA溶液で覆います。次に、カミソリの刃をプレートに対して完全に垂直に保持し、ティッシュを直交方向にそれぞれ100回ミンチにします。組織を完全にミンチするには、組織をバッファーAで濡らし、指定されたミンチ時間と方向に従うことが重要です。

組織解剖中に白質の大部分を除去し、組織をバッファーAで覆ったままにしておくことは、ミンチ効率を改善し、細胞の健康を維持するために重要です。組織が十分に処理されたら、かみそりの刃を使用して、1ミリリットルの冷たいバッファーAが入った微量遠心チューブにピースを移し、チューブを3〜5回反転させて、ミンチした組織をすべて溶液に沈めます。組織片を単一細胞懸濁液に解離するには、遠心分離によりサンプルをペレット化します。

上清を捨てます。次に、解凍したばかりの冷たい酵素溶液1ミリリットルをマイクロチューブの内壁にゆっくりと加えます。また、先端径の大きいピペットを使用して、各ペレット全体をすぐに吸引して4回分注し、ミンチ組織片を分散させます。

次に、ペレットがチューブの底にくっつかないようにマイクロチューブをすばやく反転させ、摂氏4度で30分間エンドオーバーエンド混合しながらサンプルをインキュベートします。消化の最後に、チューブを再度遠心分離し、0.6ミリリットルの冷たいバッファーAを細胞に加えます。同じピペットチップを使用して、すぐに吸引し、ペレットを5回分注します。

次に、1.3mmのガラス製ピペットをセレクトし、それを使用してサンプルを10回静かに粉砕します。サンプルを氷上に2分間置き、破片と未解離細胞がチューブの底に沈殿します。次に、上清を新しい15ミリリットルのチューブに移します。

次に、残りのペレットに600マイクロリットルのバッファーA溶液を加え、直径0.8mmのピペットを使用してサンプルをさらに10回粉砕します。示したように組織を沈降させた後、上清を最初の細胞懸濁液とプールし、さらに600マイクロリットルの緩衝液をペレットに加えます。次に、0.4mmピペットを使用してサンプルを粉砕し、チューブを氷上に2分間置いて組織が沈殿するまで待ちます。

プロトコールの機械的なトリチュレーション手順に従うことは、ソーティングを成功させるために重要です。その後、上清を解離した細胞とプールします。次に、600マイクロリットルのバッファーAをサンプルに加え、0.4ミリメートルのピペットトリチュレーションをさらに3回繰り返します。

チューブを氷上に2分間置き、細胞が落ち着くまで待ちます。次に、上清を2番目の15ミリリットルのチューブにプールします。最小のガラスピペットを使用してトリチュレーションプロセスをさらに3回繰り返すと、その後のソーティングのための細胞の収量が大幅に増加します。

すべての上清が収集されたら、氷上の4つのmirotubesに800マイクロリットルのマイナス摂氏100%エタノールを追加します。次に、収集した上清の第1のチューブから800マイクロリットルの細胞をエタノールの最初の2本のチューブのそれぞれに移し、上清の第2のチューブから800マイクロリットルの細胞をエタノールの最後の2本のチューブのそれぞれに移す。チューブを反転させてサンプルを混合します。

次に、サンプルを氷上に15分間置き、5分ごとに反転して混合します。インキュベーションの最後に、細胞を遠心分離します。次に、マイクロチューブの壁だけに触れて、マイクロピペットを使用して、各上清の最後の50マイクロリットルを除くすべてをゆっくりと取り除きます。

2つの細胞懸濁液のそれぞれを、2つの異なる細胞ストレーナーを使用して別々にろ過します。その後、細胞は、目的の細胞マーカーに対する抗体で標識し、フローサイトメトリーでソーティングする準備が整います。新鮮および凍結した脳組織サンプルの分析により、同様のサイズと粒度を持つニューロン細胞の小さな均質な集団が存在することが明らかになりました。

小さな均質な集団は、任意の細胞凝集体を排除するためにゲート化することができ、ニューロンはそれらのNeuNおよびDAPI陽性によって識別できます。新鮮組織サンプルと凍結組織サンプルの両方で、NeuN mRNAレベルは、NeuN陰性集団よりもNeuN陽性集団で有意に高くなっています。対照的に、グリア細胞マーカーとオリドゴデンドロサイト細胞マーカーのmRNAレベルは、NeuN陽性集団よりもNeuN陰性集団の方が高い。

NeuN陰性の集団では、小径細胞マーカーのmRNAレベルが高いという同様の傾向が観察されますが、これは統計的に有意ではありませんでした。さらに、Fos mRNAのレベルは、Fos陰性ニューロンよりもFos陽性ニューロンの方が高く、新鮮組織からのFos陽性ニューロンのFos mRNAは3倍に増加し、凍結組織からのFos陽性ニューロンではFos mRNAが11倍増加し、新鮮組織条件と凍結組織条件の両方でフローソーティング細胞から目的の特定の遺伝子を同定する方法の有効性が確認されています。この手順を試みる際には、重要な細胞溶解防止手順に従うことを忘れないようにすることが重要です。

この手順に続いて、蛍光活性化細胞ソーティングなどの他の方法を実行して、目的の細胞サブセットを分離し、さらに下流の分子分析を行うことができます。凍結組織を使用すると、サンプルを別々の日に選別できるため、長くて複雑な組織の採取と調製手順を伴う実験に不可欠です。この手法は、フローサイトメトリーによる選別のために数か月または数年保存した死後凍結ヒト脳サンプルの調製にも使用できます。

この技術は、神経科学分野の研究者が、Fos発現ニューロンやその他の免疫標識野生型細胞の振る舞いの根底にある分子メカニズムを探求する道を開きました。このビデオを見れば、新鮮または凍結したラットの脳組織から細胞を解離し、ニューロンや目的の細胞タイプの蛍光活性化細胞選別を行う方法についてよく理解できるはずです。