Name: 蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）と生鮮・冷凍ラット脳組織からのFos発現ニューロンの遺伝子発現解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶFACSを用いたラット脳組織からのFos発現ニューロンの遺伝子発現解析。生鮮・冷凍組織両方に対応し、複数の脳領域から細胞を効率的に分離して行動活性化ニューロンの分子神経適応を研究する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、NIDA学内研究プログラム（Bruce T. Hope, Yavin Shaham）によって支援されました。F.J.R.は、国立衛生研究所が後援し、オークリッジ科学教育研究所が管理するNIDA研究参加プログラムへの任命によって支援を受け、CONICYTとロスアンデス大学が管理するBecas-Chile奨学金から追加の財政的支援を受けました。 チリ、サンティアゴ。ジョンズ・ホプキンス大学のFACSコア施設は、国立衛生研究所の国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所の賞P30AR053503の支援を受けました。

<ol><li>Bossert, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+medial+prefrontal+cortex+neuronal+ensembles+mediate+context-induced+relapse+to+heroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin.</a> Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).</li>
<li>Cruz, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nucleus+accumbens+shell+neuronal+ensembles+in+context-induced+reinstatement+of+cocaine-seeking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking.</a> J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).</li>
<li>Fanous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+orbitofrontal+cortex+neuronal+ensembles+in+the+expression+of+incubation+of+heroin+craving%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving.</a> J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).</li>
<li>Koya, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+cocaine-activated+nucleus+accumbens+neurons+prevents+context-specific+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization.</a> Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).</li>
<li>Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-fos+to+study+neuronal+ensembles+in+corticostriatal+circuitry+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction.</a> Brain Research. 1628, 157-173 (2015).</li>
<li>Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric cell sorter.</a> Science. 156, 1364-1365 (1967).</li>
<li>Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometer%3A+new+instrument+for+ultrarapid+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis.</a> Science. 150, 630-631 (1965).</li>
<li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).</li>
<li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+identifies+unique+cocaine-induced+gene+regulation+in+selectively+activated+adult+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons.</a> J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).</li>
<li>Fanous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+gene+alterations+are+induced+in+FACS-purified+Fos-positive+neurons+activated+during+cue-induced+relapse+to+heroin+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking.</a> J Neurochem. 124, 100-108 (2013).</li>
<li>Liu, Q. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+alterations+in+methamphetamine-activated+Fos-expressing+neurons+from+a+single+rat+dorsal+striatum+using+fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> J Neurochem. 128, 173-185 (2014).</li>
<li>Rubio, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-induced+reinstatement+of+methamphetamine+seeking+is+associated+with+unique+molecular+alterations+in+Fos-expressing+dorsolateral+striatum+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons.</a> J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubation+of+methamphetamine+craving+is+associated+with+selective+increases+in+expression+of+Bdnf+and+trkb%2C+glutamate+receptors%2C+and+epigenetic+enzymes+in+cue-activated+fos-expressing+dorsal+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons.</a> J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).</li>
<li>US National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals%22">Guide for the care and use of laboratory animals</a>. , (2011).</li>
<li>Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daun02+inactivation+of+behaviourally-activated+Fos-expressing+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles.</a> Current Protocols. , (2016).</li>
<li>Cruz, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+technologies+for+examining+the+role+of+neuronal+ensembles+in+drug+addiction+and+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).</li>
<li>Mardones, G., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plasma+membrane+permeabilization+by+freeze-thawing+and+immunofluorescence+epitope+access+to+determine+the+topology+of+intracellular+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins.</a> J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).</li>
<li>Molyneaux, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeCoN%3A+genome-wide+analysis+of+in+vivo+transcriptional+dynamics+during+pyramidal+neuron+fate+selection+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex.</a> Neuron. 85, 275-288 (2015).</li>
<li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescence+activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> J Vis Exp. , e52537(2015).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

FACSは、新鮮または凍結のいずれか成体脳組織からニューロンおよび他の細胞タイプを分類するために使用することができます。冒頭で述べたように、凍結組織を使用する能力は、そのような中毒研究における自己投与および再発の研究など、複雑かつ長期化行動の手順を、受けた動物からのサンプルの最適な利用を可能にします。 2時間以上、およびすべての動物が必要です-これらの行動の手順は、通常、1をとる（10から20までの合計）が同じ日13,18上でテストされます。これは、脳の解剖、細胞解離、透過性及び免疫標識を含む4新たに解剖した脳組織試料を処理するために約4時間かかります。 30分 - 処理した後、FACSにより各サンプルを分類すると、20との間をとります。溶解緩衝液中で選別された細胞を加熱する最後のステップは、別の30分を必要とします。合計では、〜7時間は、最終的なRNA含有細胞溶解液の段階に脳の解剖から必要とされています。しかし、全体braiを凍結することが可能になりましたNSまたはたてをすぐに試験後の脳領域を解剖し、後でそれらを処理します。これは、大幅にテストを簡素化し、別の日にソートする複数の脳領域を可能にします。前FACS...

学習の間、動物は非常に特定の刺激の複雑なセット間の関連付けを形成します。この高解像度情報は、神経アンサンブル呼ばまばらに分布したニューロンの特定のパターン内の変化によってエンコードされると考えられています。ニューロンアンサンブルは最近強く行動やキュー露光時に活性化したようなフォス 、 アーク 、およびニューロンにおけるのZif268およびそのタンパク質産物として直ちに初期遺伝子（IEGs）の誘導により同定されています。特に、フォス発現ニューロンは、コンテキストに因果役割を果たしていることが示されており、キュー固有の行動1-4を学びました。したがって、これらの活性化フォス発現ニューロン内でユニークな分子神経適応は、エンコードは、このような中毒や心的外傷後ストレス障害（PTSD）5などの通常の学習および異常な学習障害、中に形成された関連を学んだ神経機構のトップ候補です。 Fluorescence活性化細胞選別（FACS）は、最近のFos発現ニューロン内で一意の分子神経適応の分析を可能にしました。フローサイトメトリーおよび細胞分取、その光散乱および免疫蛍光特性に応じて細胞を特徴付けるし、単離するために6,7、1960年代に開発された、と長い免疫学および癌研究に使用されています。しかし、フローサイトメトリーおよびFACSは、成人の脳組織から得ることが困難で解離した単一細胞を必要とします。 FACSは、第一の抗体標識8,9を必要としなかったトランスジェニックマウスからの線条体ニューロンを発現性緑色蛍光タンパク質（GFP）を単離し、分析しました。私たちは、薬物および/ ​​または野生型動物における手がかり11-15によって活性化フォス発現ニューロンに分子変化を分離し、評価するために、抗体ベースのFACS法10を開発しました。強くニューロンを活性化しながら、この方法では、ニューロンは、一般的なニューロンのマーカーのNeuNに対する抗体で標識されていますFosタンパク質に対する抗体で標識されています。新鮮な組織のためのサンプルあたり最大10匹のラットの私たちの最初の方式に必要なプーリングが、プロトコルのその後の修正はフォス発現ニューロンのFACS分離し、単一のラット13-15から離散脳領域の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）分析を可能にしました。全体的に、ユニークな分子変化は、中毒の研究12,14,15でcontext-とキュー活性化のさまざまな動作中に活性化フォス発現ニューロンで発見されました。 新鮮な組織にFACSを実行すると、主要な物流の問題は、FACSによる組織とプロセスを分離するために1丸一日かかることです。また、わずか約4つのサンプルは、日ごとに処理することができます。これは通常、唯一の脳領域は、各脳から評価することができ、残りの脳の領域が廃棄されなければならないことを意味します。これは、自己投与及び絶滅TRAIのような低スループットの行動手順のための主要な問題です手術や集中的な訓練の数週間を必要と寧。また、試験日に長く複雑な行動手順は難しい同じ日にFACSを行うことができます。直ちに行動試験後、動物から脳を凍結し、その後の研究者」が選択した異なる時点で一つ以​​上の脳領域からのFos発現ニューロンを単離できることが大きな利点であろう。 ここで我々はFACSプロトコルは新鮮凍結両方脳組織からのFos発現ニューロン（および他の細胞型）を単離することができることを示しています。例として、我々は急性メタンフェタミン注射後の注射なしナイーブラット（対照条件）から、ラットの線条体からのFos発現ニューロンを単離しました。しかしながら、このFACSプロトコルは任意の行動または薬理学的処置の後に使用することができます。我々のサンプルのその後のqPCR分析は、これらの細胞型からの遺伝子発現は、シミを用いて評価することができることが示され生鮮・冷凍の両方の組織からLAR効率。

<table><tbody><tr><td>冠状脳のスライスを得るための</td><td>脳マトリックス</td><td>CellPoint科学</td><td>69-2160-1</td></tr><tr><td>冬眠A低蛍光</td><td>脳ビット</td><td>HA-lf</td><td>プロトコルの緩衝液Aは、解離から固定ステップまでの組織および細胞を処理するために使用されます</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td>プロトコルの酵素溶液は、トリチュレーション</td></tr><tr><td>前の組織の酵素消化に使用されますProtein LoBind Tube 1.5 ml、PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td> to <td>prevent cell lost during the protocol</td></tr><tr><td>Cell Strainer, 40 & micro;m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>セル懸濁液をろ過する</td></tr><tr><td>セルストレーナー、100 & マイクロ;m</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>細胞懸濁液をろ過する</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml 丸底ポリスチレン試験管 細胞ストレーナー スナップキャップ付き</td><td>BD Bioscience</td><td>352235</td><td>フローサイトメーターを通過する前に細胞懸濁液をろ過する</td></tr><tr><td>パスツールピペット、ガラス</td><td>NIH 供給</td><td>6640-00-782-6008</td><td>組織トリチュレーションを行う</td></tr><tr><td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (マウスモノクローナル) 抗体</td><td>EMDミリポア</td><td>FCMAB317PE</td><td>ニューロン検出抗体</td></tr><tr><td>Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達技術&nbsp;</td><td>Fos発現細胞を検出するための</td><td>8677</td>抗体</tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>核を標識するための</td></tr><tr><td>PicoPure RNA単離キット</td><td>Applied Biosystems.</td><td>KIT0204</td><td>このキットには、ステップ6.14のRNA抽出バッファーが含まれています。選別された細胞を収集するために使用されます</td></tr><tr><td>Superscript III ファースト ストランド cDNA 合成システム</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td> RNA <td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td> から cDNA を合成します。<td></td> cDNA TaqMan Advance Fast Master<td>からのターゲット前増幅を行う</td>4391128</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>応用バイオシステム。</td><td>TaqManプローブを使用してPCRを行う</td><td>4444963</td></tr><tr><td>Fos TaqManプローブ</td><td>Applied Biosystems。</td><td>Rn00487426_g1</td><td>TaqMan プローブ/プライマー</td></tr><tr><td>NeuN TaqMan プローブ</td><td>Applied Biosystems.</td><td>CACTCCAACAGCGTGAC</td><td>ニューロン遺伝子マーカー</td></tr><tr><td>NeuNフォワードプライマーApplied</td><td>Biosystemsの</td>塩基配列。<td>GGCCCCTGGCAGAAAGTAG</td><td>ニューロン遺伝子マーカー</td></tr><tr><td>NeuNリバースプライマー</td><td>アプライマーアプライドバイオシステムズの</td>塩基配列。ニューロン遺伝子マーカーGfap TaqManプローブApplied Biosystemsの<td>TTCCCCCTGGTCCTTCTGA</td><td>ヌクレオチド配列</td></tr><tr><td></td><td>。</td><td>Rn00566603_m1</td> astrocityc 遺伝子マーカーiba-1 TaqMan プローブ Applied Biosystems <td>用の TaqMan プローブ/プライマー</td></tr><tr><td></td><td>。</td><td>Rn00574125_g1</td><td>microglya 遺伝子マーカー</td></tr><tr><td>Gapdh TaqMan プローブ</td><td>Applied Biosystems.</td><td>CTCATGACCACAGTCCA</td><td>参照/ハウスキーピング遺伝子</td></tr><tr><td>Gapdhフォワードプライマー</td><td>応用バイオシステムズのための</td>ヌクレオチド配列。<td>GACAACTTTGGCATCGTGGAA</td><td>参照/ハウスキーピング遺伝子</td></tr><tr><td>Gapdhリバースプライマー</td><td>応用バイオシステムズのための</td>ヌクレオチド配列。<td>CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA</td><td>参照/ハウスキーピング遺伝子</td></tr><tr><td>Oligo2 TaqManプローブ</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn01767116_m1&nbsp;</td><td>TaqMan プローブ/プライマーによるオリゴデンドロサイト遺伝子マーカー</td></tr><tr><td>P1000ピペッター</td><td>レイニン17014382</td><td></td><td>ステップ3.1と3.3では軽度の組織トリチュレーション、ステップ6.7では細胞を再懸濁するための大きな先端径を持つピペット</td></tr>と呼ばれています <tr><td>7500 高速リアルタイムPCRシステム</td><td>Applied Biosystems。</td><td>定量PCR用</td><td>446985</td></tr><tr><td>FACSAria I Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td> for <td>FACS</td></tr></tbody></table> sorting

蛍光活性化細胞ソーティング（facs）と生鮮・冷凍ラット脳組織からのfos発現ニューロンの遺伝子発現解析

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

神経可塑性と学習された行動の分子変化の研究は関連を学んだ媒介する神経のアンサンブルと呼ばれるまばらに分布し、活性化ニューロンの特定のセットの研究に全脳領域の研究からスイッチングされます。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、最近、成体ラット脳組織のために最適化し、ニューロンマーカーのNeuN及びFos蛋白質、強く活性化されたニューロンのマーカーに対する抗体を用いて活性化ニューロンの単離を可能にされています。今までは、Fosの発現ニューロンおよび他の細胞タイプは、長い処理日と長く複雑な行動手順後に評価される脳サンプルの許可非常に限られた数を伴う新鮮な組織から単離しました。 21日- 。ここでは、背側線条体からのFos発現ニューロンとのFos mRNAの収率は3 -80ºCで凍結したばかりの解剖組織と組織との間に類似していたことがわかりました加えて、我々は表現型を確認しました凍結組織はまたのFACS単離に使用することができることを示している神経細胞の評価遺伝子発現（ のNeuN）、アストロサイト（GFAP）、オリゴデンドロサイト（Oligo2）とmicrogial（IBA1）マーカーによるのNeuN陽性とのNeuN陰性選別細胞のグリア細胞型。全体的に、収集解剖複数FACSセッションの脳組織を凍結することが可能です。これは、多くの場合、長くて複雑な行動手順を受けた貴重な動物被験体から得られたデータの量を最大化します。

急性メタンフェタミン注射した後、単一のラットからの生鮮・冷凍背側線条体組織からのFos陽性とフォス陰性ニューロンを並べ替え。 上記のプロトコルは、メタンフェタミン（5mg / kg）の腹腔内注射後に1匹のラットの背側線条体90分からのFos陽性とフォス陰性ニューロンをソートするために使用されました。それらのホームケージにおけるナイーブラットを対照として使用しました。背側線条体組織は、直ちにそのコレクション（新鮮な組織）の後に処理または1,7または21日間凍結し、-80ºCに格納された後に処理しました。これらの凍結時点からの結果は、互いに有意差がなかったので、データをプールしました。 機器のソート条件を設定するには、いずれかのホームケージ制御またはmethamphetaから（上記の）コ​​ントロールサンプル鉱山注射群を使用しました。こ...

ここでは、生鮮・冷凍の両方の脳組織から神経アンサンブルをフォスが発現に分子変化を研究するための蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）プロトコルを提示します。凍結組織の使用は、貴重な動物被験体の使用を最大化するために、複数のセッションに比べて多くの脳領域のFACS単離を可能にします。

蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）と生鮮・冷凍ラット脳組織からのFos発現ニューロンの遺伝子発現解析

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

この手順の全体的な目的は、新鮮または凍結保存された成体ラットの脳組織からFos発現ニューロンを解離させ、その後の蛍光活性化細胞分選（FACS）に供することです。この手法は、行動活性化ニューロンの固有な分子神経適応を特定するために、目的の神経細胞を単離する場合に使用できます。この技術の主な利点は、凍結組織の使用が可能であるため、異なる日に複数の脳領域から細胞を単離できる点にあります。この新鮮な脳組織を処理するには、氷冷した脳スライス用マトリクスのスロットに、あらかじめ冷却したカミソリの刃を2本以上挿入し、目的の脳領域を含む1～2 mmの冠状断スライスを作成します。切り出された切片は、順次冷却ガラスプレート上に配置してください。まず、目的の脳領域を切り出し、その他の領域を廃棄して、白質を除去します。組織を凍結させるには、サンプルをマイクロチューブに移し、-40 °Cのイソペンタンに20秒間浸漬させ、次回の処理まで-80 °Cで保存します。組織を細切するため、サンプルを冷やしたガラスプレート上で1分以内に解凍し、Buffer A溶液を1〜2滴加えて覆います。次に、カミソリの刃をプレートに対して完全に垂直に持ち、組織を各直交方向に100回ずつ細切します。組織を十分に細切するためには、Buffer Aで組織を濡らした状態に保ち、指定された細切回数と方向に従うことが不可欠です。組織の解剖時には、大部分の白質を除去することが極めて重要です。また、ミンシングの効率を高め、細胞の健全性を維持するために、組織は常にBuffer Aに浸しておいてください。組織の処理が完了したら、カミソリを使用して組織片を1 mLの冷えたBuffer Aが入ったマイクロ遠心チューブに移し、チューブを3〜5回反転させて、ミンシングした組織すべてを溶液に浸します。組織片を単一細胞懸濁液に解離させるため、遠心分離によってサンプルをペレット化します。上清を捨てます。次に、解凍直後の冷えた酵素溶液 1 mL を、マイクロチューブの内壁に沿ってゆっくりと加えます。そして、口径の大きいチップを装着したピペットを用いて、各ペレット全体を直ちに 4 回吸引・吐出させ、細切された組織片を分散させます。次に、ペレットがチューブ底に付着するのを防ぐためにマイクロチューブを素早く反転させ、4 °Cで30分間、エンドオーバーエンドミキシングでサンプルをインキュベートします。消化終了後、チューブを再度遠心分離し、0.6 mLの冷やしたBuffer Aを細胞に加えます。同じピペットチップを使用して、すぐにペレットを5回吸引・吐出してください。次に、1.3 mmのガラスピペットを選択し、それを用いてサンプルを穏やかに10回ピペッティングします。サンプルを氷上に2分間置き、デブリおよび未解離細胞をチューブの底に沈殿させます。その後、上清を新しい15 mLチューブに移します。次に、残ったペレットに600 µLの緩衝液Aを加え、直径0.8 mmのピペットを用いてサンプルをさらに10回ピペッティングします。実演した通りに組織を沈殿させた後、上清を最初の細胞懸濁液と合わせ、ペレットにさらに600 µLの緩衝液を加えます。続いて、0.4 mmのピペットでサンプルをピペッティングし、チューブを2分間氷上に置いて組織を沈殿させます。ソートを成功させるには、プロトコルにある機械的なトリチュレーション（撹拌）の手順に従うことが重要です。その後、上清と解離した細胞を合わせて回収します。次に、サンプルにBuffer Aを600 µL加え、0.4 mmのピペットでのトリチュレーションをさらに3回繰り返します。細胞を沈殿させるため、チューブを氷上に2分間置きます。その後、上清を2本目の15 mLチューブに回収します。最も細いガラスピペットを用いて、このトリチュレーション（破砕）工程をさらに3回繰り返すことで、後続のソーティングに用いる細胞の回収率を大幅に向上させることができます。すべての上清を回収した後、氷上の4本のマイクロチューブに、-20℃の100%エタノールを800 µLずつ加えます。次に、回収した上清の1本目のチューブから800 µLの細胞分画をエタノールの入った最初の2本のチューブにそれぞれ移し、2本目の上清チューブから800 µLの細胞分画を残り2本のチューブにそれぞれ移します。チューブを転倒混和してサンプルを混ぜ合わせます。次に、サンプルを氷上に15分間置き、5分ごとに転倒混和させます。インキュベーション後、細胞を遠心分離します。その後、マイクロチューブの壁面にのみ触れるようにマイクロピペットを使用し、各上清の最後の50 µL以外をゆっくりと除去します。2組の異なるセルストレーナーを用い、2つの細胞懸濁液をそれぞれ個別にろ過します。これで、目的の細胞マーカーに対する抗体による標識と、フローサイトメトリーによるソートが可能な状態になります。新鮮および凍結保存された脳組織サンプルの解析により、サイズと顆粒性が類似した、少数の均質な神経細胞集団の存在が明らかになります。少数の均質な集団をゲーティングして細胞凝集物を除外し、NeuNおよびDAPI陽性によってニューロンを特定できます。新鮮および凍結の両方の組織サンプルにおいて、NeuN mRNAレベルはNeuN陽性集団の方がNeuN陰性集団よりも有意に高くなります。対照的に、グリア細胞およびオリゴデンドロサイトの細胞マーカーmRNAレベルは、NeuN陽性集団よりもNeuN陰性集団の方が高くなります。NeuN陰性細胞集団においても、マイクログリア細胞マーカーのmRNAレベルが高くなる同様の傾向が観察されましたが、これは統計的に有意ではありませんでした。さらに、Fos mRNAレベルはFos陰性ニューロンよりもFos陽性ニューロンで高く、新鮮組織由来のFos陽性ニューロンではFos mRNAが3倍に増加し、凍結組織由来のFos陽性ニューロンでは11倍に増加しました。これにより、新鮮組織および凍結組織の両条件において、フローソートした細胞から目的の特定遺伝子を同定するための本手法の妥当性が確認されました。この手順を行う際は、細胞溶解を防ぐための重要なステップを遵守することが不可欠です。この手順の後、フローサイトメトリーによる細胞分取（FACS）などの他の手法を用いて、目的の細胞サブセットを単離し、さらなるダウンストリームの分子解析を行うことができます。組織を凍結保存することで、別の日に行い分取することが可能となり、これは組織の採取や調製に時間と手間がかかる複雑な実験において極めて重要です。また、この技術は、数ヶ月または数年保存された死後凍結ヒト脳サンプルのフローサイトメトリーによる分取調製にも適用可能です。この手法は、神経科学分野の研究者が、Fos発現ニューロンやその他の免疫ラベル化された目的の野生型細胞の行動の根底にある分子メカニズムを探索するための道を切り開きました。このビデオを視聴することで、目的のニューロンや細胞型を蛍光活性化細胞分取（FACS）するために、新鮮なまたは凍結したラット脳組織から細胞を分離する方法について深く理解できるはずです。

fluorescence-activated-cell-sorting-facs-gene-expression-analysis-fos

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、非放射性の関係...

二重蛍光その場で</em新鮮な脳切片における>ハイブリダイゼーション

ここでは、半厚い脳スライスの画像蛍光標識細胞に迅速かつ簡単な方法を説明します。...

セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

胎児のマウス組織からの神経堤由来の神経前駆細胞を精製する最適化された手順が記載されています。このメソッドは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって離散的集団を分離するために蛍光レポーター遺伝子からの発現を利用しています。技術が開発を通して、大人の組織から神経細胞集団を単離するために適用することができます。...

蛍光活性化細胞選別（FACS）胎児マウスの内臓からの自律神経前駆細胞の分離用に最適化された手順

このビデオは、ニューロン、星状細胞、ミクログリアなどのラット海馬から細胞を分離するプロトコルを示しています。...

ラット海馬から種々の神経細胞集団を得る

このビデオでは、酵素消化と機械的トリチュレーションを使用して、凍結ラットの脳組織を単一細胞懸濁液に解離する様子を説明しています。調製した細胞は固定され、フローサイトメトリーや遺伝子発現解析などのダウンストリームアプリケーションのためにエタノールで透過処理されます。...

凍結ラット脳組織からの単一細胞懸濁液の取得

このプロトコルの目標は、蛍光活性化細胞選別(FACS)技術を使用して、細胞型特異的な遺伝子発現、エピジェネティックマーカー、およびまたはタンパク質発現のその後の解析のために、特定のタイプの神経細胞を選別することです。...

蛍光活性化セルソーティングを用いたラット脳組織における細胞型特異的遺伝子発現の検討

本研究の目的は、ラットの脂肪と砂糖の新規摂取後のドーパミン経路と端末サイトにおける同時変化を測定するために、携帯のc-fosの活性化を使用して、信頼性の高い免疫組織学的手法を描くことで報酬関連の分散型の脳のネットワークを識別することです。...

ラットにおけるナイーブ砂糖と脂肪の摂取後の中脳辺縁系と中間皮質ドーパミン報酬サイトからのc-Fosの活性化の同時検出

このプロトコルでは、高深度単一細胞 RNA 配列のため mRNA...

絶対数のシーケンス (Seq 歌姫) と手動並べ替えおよび二重の in Vitro転写を使用してマウスの蛍光に分類されたニューロンの単一細胞 RNA シーケンス

ここでは、近赤外染料と免疫組織化学、高分解能走査を併用し、脳領域におけるアッセイタンパク質を測定するプロトコルを紹介します。...

げっ歯類の脳におけるタンパク質発現を測定するために近赤外蛍光と高解像度走査を用いること

このプロトコルはmultilabel FISHおよび蛍光性のIHC信号を達成することを目標に、新しい凍結および固定マウス頭脳セクションの蛍光性in situ の交配(魚)および蛍光性のimmunohistochemistry...

マルチプレックス蛍光 In Situ ハイブリダイゼーションと蛍光免疫組織化学の融合による新鮮、凍結、または固定マウスの脳切片の結合(英語)

蛍光活性化細胞選別 - 放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)は、アルツハイマー病における18 kDaトランスロケータータンパク質またはセロトニン5HT2A受容体発現の役割を細胞規模で研究するための強力なツールです。このプロトコールは、TgF344−ADラットモデルにおけるFACS−RTTの エクスビボ...

蛍光活性化細胞選別-放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)による放射性シグナルの細胞起源の決定

学ぶFACSを用いたラット脳組織からのFos発現ニューロンの遺伝子発現解析。生鮮・冷凍組織両方に対応し、複数の脳領域から細胞を効率的に分離して行動活性化ニューロンの分子神経適応を研究する方法です。

蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）と生鮮・冷凍ラット脳組織からのFos発現ニューロンの遺伝子発現解析

さらに動画を探す