Name: 再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶ Yarrowia lipolytica Po1gにおける遺伝子工学手法。KU70欠失による相同組換え効率化とCre/LoxPマーカー回収システムを用いた標的遺伝子欠失プロトコル。バイオ燃料・生化学的生産のための株改良に有用です。

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私たちは感謝シンガポール（ETRP 1201102）の国家環境庁からの資金援助を認める、シンガポール国立研究財団（NRF-CRP5-2009-03）、シンガポールの科学技術研究庁の競争研究プログラム（ 1324004108）、グローバルR＆Dプロジェクトの計画、知識経済部、大韓民国（N0000677）、国防脅威削減局（DTRA、HDTRA1-13-1-0037）と合成生物学シンガポール国立大学のイニシアティブ（ DPRT / 943/9月14日）。

Yの1世代KU70欠失株リポリティカ <ol><li>破壊カセットの構築 注：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅に使用されるすべてのプライマーは、 表1を参照のこと。 <ol><li> LEU2発現カセットをPCR増幅するために設計プライマー20は、Yから（ 表1参照します） リポリティカ（lipolytica）発現ベクターおよび長いフォワードプライマー（＃1、 表1）を用いてLEU2カセットの5 &#39;および3&#39;末端にLoxP部位を導入し、それぞれ、長逆方向プライマー（ 表1＃2）。クローニングプロセスの後続のステップのために追加の制限部位を導入するために、プライマー＃1におけるBamHI制限部位を加えます。 </li><li> 表2に詳述するように、高忠実度DNAポリメラーゼを用いてPCRを行います。 </li><li> PCR purificatioを使用して、PCR産物のLoxP-プロモーター-LEU2-ターミネーターのLoxPカセットを精製製造元の指示に従って、n個のキット。製造業者の説明書21に記載の精製されたPCR産物に3&#39;-Aオーバーハングを加えます。 表3の通りプラスミドT-LEU2を得るためのTAクローニングベクターにAテールPCR産物を連結するために使用T4 DNAリガーゼ。 </li><li> PCRは、Yからプライマー＃3 /＃4を使用してKU70遺伝子の1キロバイトの5 &#39;上流配列を増幅しますリポリティカ Po1g 表2に従って、ゲノムDNA 22は、製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いてPCR産物を精製します。 <ol><li>ダブル。 表4のとおりのSacIIおよびBam HI酵素で精製したPCR産物とT-LEU2プラスミドの両方を消化し ​​、製造元の説明書に従ってPCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。精製を連結するためにT4 DNAリガーゼを使用して、 サック IIにPCR産物を消化/ T-LEU2ののBamHI部位を生成しますプラスミドT-LEU2-5E 表3のとおり。 </li></ol></li><li> PCRは、Yからのプライマーを＃5 /＃6を使用してKU70遺伝子の1キロバイトの3 &#39;下流配列を増幅しますリポリティカ Po1g 表2に従って、ゲノムDNA 22は、製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いてPCR産物を精製します。ダブル精製したPCR産物と表4のとおりのNot Iおよびんで酵素とT-LEU2-5Eプラスミドの両方を消化。 <ol><li>製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。その後、精製を結紮およびNot I / んで 表3に従ってT4 DNAリガーゼを用いてプラスミドT-KOを生成するT-LEU2-5EのI部位にPCR産物を消化し ​​ました。 </li></ol></li><li>破壊カセットを生成するために、表4のとおりのSacIIおよびんで I酵素によるプラスミドのT-KOダイジェスト（ 図1 </stronグラム&gt;）。製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いて消化したDNA断片を精製します。 </li></ol></li><li>コンピテントセルの調製およびYの変換Po1g株リポリティカ <ol><li>コンピテント細胞調製<ol><li> Yのコロニーを植菌YPD培地10ml（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％デキストロースおよび50mMのクエン酸緩衝液pH 4.0）を100mlフラスコ中で、新鮮な酵母抽出物-ペプトン-デキストロース（YPD）プレートからリポリティカ Po1g株。飽和するまで20時間（分光光度計を用いて測定し、OD約15の600）を225 rpmで30℃の振盪インキュベーター中でインキュベートします。 </li><li>室温で5000×gで5分間遠心して細胞をペレット化。 20ミリリットルのTris-EDTA（TE）緩衝液（10mMのTris、1mMのEDTA、pH7.5）で細胞を洗浄し、ステップ1.2.1.2で説明したように、細胞をペレット。 （酢酸で調節してpH 6.0）を1mlの0.1M酢酸リチウム中で細胞を再懸濁し、そして室テンペで10分間インキュベートrature。 </li><li>滅菌1.5ミリリットルチューブにテント細胞（100μl）を等分。直下変換ステップに進む、または長期保存のために-80℃で、最終濃度25％（v / v）を、店舗にグリセロールを加えます。 </li></ol></li><li>変換<ol><li>穏やかにコンピテント細胞100μlと共に変性サケ精子DNA（10 mg / mlで）、精製破壊カセット1-5μgの10μLを混合し、15分間30℃でインキュベートします。 </li><li> （0.1 M酢酸リチウム液pH 6.0に溶解した）40％ポリエチレングリコール（PEG）-4000の700μl加え、よく混ぜ、60分間225rpmで30℃の振盪インキュベーター中でインキュベートします。 注：（典型的には、従来の酵母の形質転換に使用される）の代わりにPEG-3350の、4000の平均分子量を有するPEGを使用することが重要です。 </li><li>熱は、60分間39℃の水浴中に管を配置することによって、形質転換混合物に衝撃を与えます。 </li><li> 1ミリリットルをYPD培地を追加し、30°Cおよび225 rpmで2時間回復。室温で1分間、9000×gで遠心し、上清を除去し、TE緩衝液1mlでペレットを再懸濁します。 </li><li>室温で1分間9000×gの遠心分離により細胞をRepelletし、上清を捨てます。 100μlのTE緩衝液にペレットを再懸濁し、選択プレート（ 例えば 、ロイシン欠乏プレート）上にプレートし、2〜3日間30℃でインキュベートします。 </li><li> 4〜10の単一コロニーを選択し、YPD培地2mlに別々に接種します。 225 rpmで30℃の振盪インキュベーター中で一晩インキュベートします。それぞれのプライマー＃55 /＃56、及び＃56 /＃57、の2セットを用いて、 表5のとおり形質転換体22からのゲノムDNAのPCR分析によって陽性コロニーを識別します。 注：私は、直鎖状にpYLEX1ベクターがY.に変換されるわけではありません数をカウントすることにより形質転換効率を決定するためにPo1gテント細胞リポリティカμgのプラスミド当たりのコロニー形成単位（CFU）のDNAは、23を用います。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.マーカーレスキュー<ol><li> Cre発現プラスミドの構築<ol><li> pYLEX1-CREとpYLEX1-HPHの構築<ol><li>デザインプライマー20は、CreおよびHPHのオープンリーディングフレームをPCR増幅します。フォワードプライマー＃82と＃84に開始コドンの上流の余分なアデニンヌクレオチドを追加し、PCRは、CREのオープンリーディングフレームを増幅するリバースプライマー＃83と＃85の中に終止コドンの下流のKpnI制限部位を挿入し、 表2のとおりpSH69（アクセッション番号HQ412578）24からHPH。 </li><li> CRE、製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを使用して、HPH断片の両方を精製します。 TABL通りのKpn I酵素で精製CREおよびHPH断片の両方を消化E 4。Pmlに基づくおよびKpnIでpYLEX1プラスミドは表4の通り酵素消化倍増。当たりの製造者の指示通りPCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。 </li><li> Y.のPmlに基づく I / KpnIのサイトに精製し、消化CREおよびHPH断片を連結するには、 表3の通り、T4 DNAリガーゼを使用します発現ベクターリポリティカ 、それぞれ、pYLEX1-CREとpYLEX1-HPHを得ました。 </li></ol></li><li> pSL16-CRE-HPHの構築<ol><li> PCRは、プライマーに＃86を使用してpYLEX1-CREからのcreのプロモーター-遺伝子-ターミネーターカセットを増幅/＃87、表2のとおりのSal I / PstIの制限部位に隣接する。メーカーの指示に従って、PCR精製キットを用いてPCR産物を精製。 <ol><li>精製したPCR産物およびSal IでpSL16-CEN1-1（227）プラスミド25の両方をダブル消化し ​​、PST 表4に従って、I酵素は、製造業者の指示に従って、PCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。そして、 表3に従ってT4 DNAリガーゼを用いpSL16-CREを作成するために対応する部位にpSL16-CEN1-1（227）に精製し、消化し ​​たPCR産物を連結。 </li></ol></li><li> PCRは、＃88 /＃89は、 表2の通りのXho I / のBglII制限部位に隣接するプライマーを用いてpYLEX1-HPHからHPHのプロモーター-遺伝子-ターミネーターカセットを増幅する。製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを用いてPCR産物を精製します。 <ol><li>ダブル。精製されたPCR産物および表4のとおりのXho IおよびBgl II酵素とpSL16-CREプラスミドの両方を消化し ​​、製造元の説明書に従ってPCR精製キットを用いて、消化混合物を精製します。次に、対応するでpSL16-CREに精製し、消化したPCR産物を連結サイトは、 表3に従ってT4 DNAリガーゼを用いpSL16-CRE-HPHを生成します。 注：結果のCre発現プラスミド、pSL16-CRE-HPHは、選択可能なハイグロマイシンBのマーカーを保有し、セントロメアおよびエピソーム的に複製するベクター（ 図2）です。 </li></ol></li><li> 表4の通り（ベクターからの挿入を切り出すために、 例えば 、 サル I / PstIの ）適切な制限酵素で消化することにより全ての構築物を確認してください。 </li></ol></li></ol></li><li> Creリコンビナーゼ媒介マーカーレスキュー<ol><li>上記のセクション1.2に記載の形質転換プロトコルに従ってKU70ノックアウト株のコンピテント細胞にpSL16-CRE-HPHを変換します。プレートは、YPDプラスハイグロマイシンB上に細胞（YPDH）プレート（400 / mlのハイグロマイシンBを含む）に形質転換し、2〜3日間30℃でインキュベートします。 </li><li>正識別するためのプライマー＃84 /＃85を用いて、 表5の通りコロニーPCRを行います変換後のpSL16-CRE-HPHプラスミドを含むコロニー。 注：フォワードプライマー＃84およびリバースプライマー＃85は、hph遺伝子（ 表1）のコード領域の内側に配置されています。唯一の陽性クローンをPCR反応に特異的なPCR産物を生成します。 </li><li>陽性クローンを選択し、YPDH培地2mlに接種し、飽和するまで一晩225rpmで30℃の振盪インキュベーター中でインキュベートします。分光光度計を用いて細胞のOD 600を測定します。 〜15のOD 600で細胞を回収します。室温で5分間、5000×gで遠心分離し、滅菌水2mlで1回洗浄。 </li><li>初期OD 0.1の600でYPD培地2mlに細胞を再接種し、細胞が一晩225rpmで30℃の振盪インキュベーター中で成長することができます。単一コロニー23を分離するYPDプレート上にストリーク一晩細胞培養物。 YPD、YPDH、およびロイシン欠乏プレート23上にレプリカプレートコロニー</s&gt;アップ。 注：両方のLEU2マーカーを失っているとpSL16-CRE-HPHプラスミドのみをYPDプレート（ 図3）上に成長させることができるコロニーを。 </li></ol></li></ol>アルコール脱水素酵素およびアルコールオキシダーゼ遺伝子の3削除<ol><li> Y.で検索を実行します削除の26の遺伝子候補を同定するために基本的なローカル配列検索ツール（BLAST）を使用してリポリティカゲノムデータベース。入力Sのタンパク質配列BLAST検索ツールにセレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼIを（http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&amp;db=yli&amp;seqid=aa）。 注：BLAST検索ツールは、Yに最も類似したタンパク質配列を返しますリポリティカゲノムデータベース。 </li><li> ＃56へのプライマー＃7（ 表1）を用いたPCRによって削除カセットを構築し、上記のセクション1.1に記載したのと同じ方法を用いて、制限酵素消化およびライゲーション反応を行います。 </li><li>予備校KU70ノックアウト株のコンピテントセルは、ある変換を行い、上記のセクション1.2に記載のプロトコルに従うことにより、＃81（ 表1）に＃55のプライマー、＃58で陽性コロニーを同定するためのPCRを実施します。 注：例として、YALI0E17787g遺伝子欠失のための手順は、 図4及び5に記載されています。相同組換え率に1キロバイトおよび2キロバイト長い相同領域の効果が報告されています。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

この研究のための私たちの目標は、Yに標的遺伝子ノックアウトの迅速かつ効率的な生成を可能にすることですPo1g株リポリティカ 。いくつかの考慮事項は、これを達成するために対処する必要があります。まず、高変換効率が必要です。したがって、Y.ための効率的で便利な化学的形質転換プロトコルリポリティカ Po1g株を本研究に記載されました。 PEG-4000を使用することは、この株の形質転換の成功のために重要な要素です。代わりにPEG-4000の（S.セレビシエの形質転換のために）PEG-3350を使用時に形質転換体は、プラスミド形質転換のために得られませんでした。また、新たに調製した細胞を用いてコンピテント細胞の調製は、この株において高い変換効率を得るために必要とされます。第二に、この株で優勢NHEJを介して非相同組換えおよびランダム組込み事象を減少させるために、効率的な形質転換法は、次にKU7を構築するために使用されました0ノックアウト変異体。第三に、相同組換えによる遺伝子置換の効率を向上させるために、長いフランキングア...

サッカロマイセス・セレビシエ 、 ヤロウィアリポリティカ、型にはまらない酵母とは異なり、環境条件1,2の変化に応じて、酵母または菌糸体の形で成長することができます。したがって、この二形酵母は真菌の分化、形態形成および分類3,4,5の研究のための良いモデルとして使用することができます。一般に広く、有機酸、ポリアルコール、芳香化合物、乳化剤及び界面活性剤-6,7,8,9-などの食品添加物の多様を生成するために使用される安全な（GRAS）酵母種とし ​​て見なされます。これは絶対好気性自然細胞乾燥重量10の70％まで、多量、 すなわちに脂質を蓄積することができる周知の油性酵母です。また、栄養素11,12,13として廃資源における残基の異なる種類を含む、成長のための炭素源の広いスペクトルを利用することができます。これらのユニークな機能のすべてがYを作ります以下のための非常に魅力的リポリティカ様々なバイオテクノロジー用途。 Yの全ゲノム配列が、 リポリティカが 14,15を公開されている、この型破りな酵母の遺伝子操作は、他の酵母種よりも複雑です。まず、この酵母種の変換は、それほど効率的により安定的かつ効率的な形質転換系16,17が存在しないことです。全く自然なエピソームプラスミドシステムは、この酵母18で発見されていないように、第2の線形発現カセットの面倒なゲノム組み込みは、一般に、目的の遺伝子の発現のために使用されます。この酵母で正確な相同組換えを介して効率遺伝子ターゲッティングが低く、ほとんどの統合イベントは非相同末端結合（NHEJ）19を介して発生するため、遺伝的ノックアウトおよびノックインの第三に、世代が制限されています。 本研究では、Yのための最適化された形質転換プロトコルを報告しますリポリティカ </em&gt;の、簡単迅速、効率的かつ再現性のあるPo1g株。正確な相同組換えの頻度を高めるために、我々は、NHEJ経路における重要な酵素をコードするKU70遺伝子を削除しました。最適化された形質転換プロトコルを用いて、1キロバイト、Y.のKU70遺伝子のフランキング相同領域を含む直鎖ノックアウトカセットを形質転換することによってリポリティカ Po1gは正常に削除されました。この遺伝子の欠失方法のロバスト性は、その後Po1g KU70Δ株において、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルコールオキシダーゼ遺伝子を標的にすることによって実証されました。これは、KU70欠損株は、野生型Po1g株よりも標的相同組換えを介した遺伝子のかなり高い効率を示すことが観察されました。また、ハイグロマイシンB耐性マーカーを保有する複製Cre発現プラスミドは、マーカーレスキューを実行するように構築しました。マーカーレスキューは番目に遺伝子標的の複数のラウンドを容易にEは、遺伝子欠失突然変異体を得ました。遺伝子欠失に加えて、ここに記載の遺伝的形質転換および遺伝子欠失のための我々のプロトコルは、特定の遺伝子座に遺伝子を挿入するために適用することができ、およびY.に部位特異的変異を導入することリポリティカゲノム 。

<table><tbody><tr><td>試薬/材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチドプライマー</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td></td><td>25 nmole DNAオリゴ</td></tr><tr><td>Y. lipolytica株 Po1g</td><td>Yeastern Biotech</td><td></td><td>ロイシン補助栄養誘導体野生型株W29(ATCC 20460)</td></tr><tr><td>ベクターpYLEX1</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYY203-5MG</td><td>Y. lipolytica 発現ベクター</td></tr><tr><td>大腸菌 TOP10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>プラスミドのクローニングおよび増殖用</td></tr><tr><td>pGEM-T ベクター&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td>TA クローニングベクター</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>プラスミド単離</td></tr><tr><td>用 ウィザード SV ゲルおよび PCR クリーンアップシステム</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>アガロースゲル からDNA断片を抽出し、増幅反応からPCR産物を精製</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA ポリメラーゼ</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5302</td><td>ハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0136S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>BglII&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0111S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>NotI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0189L</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>PmlI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0532S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0140S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>SacII</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0157S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>SalI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0138S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0146L</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>T4DNAリガーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0202LTaqDNA</td><td></td></tr><tr><td>ポリメラーゼ&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11593-027</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>ハイグロマイシン B</td><td>PAA</td><td>P21-014</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA ラダー</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0312</td><td>1 kb DNA ラダー</td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Sigma</td><td>95904-F</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0729</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15-632-011</td><td></td></tr><tr><td>酢酸リチウム</td><td>Σ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Σ</td><td></td><td></td></tr>ガラス<tr><td>ビーズ (425-600 & micro;m)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>DNA ローディング色素</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>バクト酵母抽出物</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>1st Base</td><td>BIO-1101</td><td></td></tr><tr><td>アミノ酸なしのYNB</td><td>シグマ</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>DOサプリメント-Leu</td><td>Clontech</td><td>630414</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Difco LBブロス</td><td>BD</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB寒天</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr>バ<tr><td>クト寒天</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCRマシン</td><td>Biorad</td><td>T100 サーマルサイクラー</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr><tr><td>固定/振とうインキュベーター</td><td>Yihder</td><td>LM-570RD</td><td></td></tr><tr><td>サーモシェーカー</td><td>Allsheng</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td>バイオフォトメーターと</td><td></td></tr><tr><td>ゲルイメージャー</td><td>GE</td><td>Amersham Imager 600</td><td></td></tr></tbody></table>

再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

ヤロウィアリポリティカは 、非病原性の二形性と厳密に好気性の酵母種です。その独特の生理機能や代謝の特性により、この型破りな酵母は真菌の分化の基本的な性質の研究のための良好なモデルだけではありませんが、また、生化学的生産と大規模な遺伝子操作を必要とする様々な生物工学的適用のための有望な微生物のプラットフォームです。 Y.のが、遺伝子操作リポリティカは 、主KU70遺伝子に起因することができ、効率的かつ安定的な遺伝的形質転換システムの欠如ならびに非相同組換えの非常に高い割合に限定されています。ここでは、効率的な遺伝的形質転換のためにとYにおける遺伝子欠失のための簡単かつ迅速なプロトコルを報告しますリポリティカ Po1g。 Y.への外因性DNAの効率的な形質転換のためにまず、プロトコルリポリティカ Po1gを確立しました。セコndは、標的遺伝子のさらなる削除のために強化された二重交差相同組換え率を達成するために、KU70遺伝子は、1kbの相同性ア ​​ームを担持破壊カセットを形質転換することにより削除されました。第三に、KU70遺伝子の欠失後の増強遺伝子欠失の効果を実証するために、我々は、個別にKU70ノックアウトプラットフォーム株に同じ手順を使用して、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルコールオキシダーゼをコードする11標的遺伝子を削除しました。これは、正確な相同組換えの割合が削除のために0.5％未満の実質的に増加することが観察されました Po1g KU70Δで11標的遺伝子の単一遺伝子欠失のための33％-71％にPo1gでKU70遺伝子の。ハイグロマイシンB耐性マーカーを有する複製プラスミドとのCre / loxPシステムを構築し、酵母ノックアウト株における選択マーカー遺伝子は、最終的にタージェ複数回のを容易にするために、Creリコンビナーゼの発現により除去しましたテッド遺伝子操作。得られた単一遺伝子欠失変異体は、バイオ燃料および生化学的生産において潜在的な用途を有します。

線形化Y.リポリティカ（lipolytica）発現ベクターは、Yのゲノム中のpBRドッキングプラットフォームに挿入し単一交差組換え27を行うことにより、 リポリティカ Po1g株。本研究で確立された迅速な化学変換の手順を使用して、線形化Y.リポリティカ（lipolytica）発現ベクターは、正常&gt; 100 CFU /μgのDNAの形質転換効率で野生型Po1g株に形質転換しました。 1キロバイトの相同配列によって隣接ノックアウトカセットは（ 図1）Po1g株に形質転換し、KU70遺伝子が正常に削除されました。ここでは、フォワードプライマー＃56は、KU70遺伝子の5 &#39;相同性ア ​​ーム内に位置する配列にアニールします。リバースプライマー＃55は、LEU2マーカーのコード領域内に位置しています。リバースプライマー＃57は、KU70遺伝子のコー...

ここでは、遺伝子欠失効率を改善するためのYarrowia lipolytica Po1g株の分子遺伝学的操作に関する方法を報告します。結果として得られた遺伝子組み換えY.リポリティカ株は、バイオ燃料および生化学生産への潜在的な応用が期待されています。

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

本手順の全体的な目的は、変換用DNAの構築、DNA形質転換、形質転換体の選択、および相同組換えによる標的遺伝子の欠損を含む、非従来型の酵母種に対する効果的な遺伝子工学的手法を開発することです。我々は、バイオ燃料およびバイオ化学品製造への応用が期待される、Yarrowia lipolytica PO1G株における高効率な遺伝子欠損技術を確立しました。PCR介在性遺伝子破壊などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、大量の遺伝子欠損クローンが得られること、および広範な選択マーカーを利用可能であることです。本研究では、効率的で簡便であり、信頼性と再現性の高い *Yarrowia lipolytica* PO1G株の遺伝子形質転換プロトコルを報告します。本研究で構築した *Yarrowia lipolytica* PO1G KU70欠損株は、非常に効率的な相同組換え頻度を示し、標的遺伝子の欠損スクリーニングをより迅速かつ容易に行うことが可能です。本手順の最初のステップは、PCRにより *Y. lipolytica* 発現ベクターから LEU2 発現カセットを増幅し、LEU2カセットの5'末端および3'末端に LoxP サイトを導入することです。クローニングプロセスの後続ステップのため、プライマー1にはBamHI制限酵素部位も導入されています。LoxPプロモーターLEU2ターミネーターLoxPカセットを精製した後、精製したPCR産物に3つのプライムAオーバーハングを付加します。次いで、Aテイル付きPCR産物をTAクローニングベクターにライゲートし、プラスミドT-LEU2を得ます。2段階目のPCRでは、Y.lipolytica PO1GゲノムDNAを用い、プライマー3および4を使用してKU70遺伝子の5'側上流1 kb配列を増幅します。その後、精製したPCR産物とT-LEU2プラスミドの両方をSacIIおよびBamHI酵素でダブルダイジェストし、精製・切断したPCR産物をT-LEU2のSacII BamHI部位にライゲーションして、プラスミドT-LEU2-5Eを作製します。3段階目のPCRでは、Y.lipolytica PO1GゲノムDNAを用い、プライマー5および6を使用してKU70遺伝子の3'側下流1 kb配列を増幅します。次に、精製したPCR産物とT-LEU2-53プラスミドの両方をNotIおよびNdeI酵素でダブルダイジェストし、精製・切断したPCR産物をT-LEU2-5EのNotIおよびNdeI部位にライゲートして、T-KOプラスミドを作製します。最後に、T-KOプラスミドをSacIIおよびNdeI酵素で切断し、破壊カセットを調製します。まず、コンピテントY.lipolytica PO1G細胞を準備して、この手順を開始してください。新鮮な酵母エキスペプトンデキストロース（YPD）プレートから Y.lipolytica PO1G 株のコロニーを、100 mL フラスコに入れた 10 mL の YPD 培地に接種します。30 °C の振盪インキュベーターを用いて 225 RPM で 20 時間、飽和するまで培養します。翌日、室温で 5000 ×g で 5 分間遠心分離し、細胞をペレット化します。20 millilitersのTEバッファーで細胞を洗浄し、再度細胞をペレット化します。上清を除去した後、細胞を1 milliliterの0.1 molar酢酸リチウムに再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。コンピテントセルを100 microliterずつ分注し、滅菌済みの1.5 milliliterチューブに保存します。10 µLの変性サケ精子DNAおよび1〜5 µgの精製済み破壊カセットを、100 µLのコンピテントセルに加えて穏やかに混合し、直ちに形質転換操作に進みます。30 °Cで15分間インキュベートします。その後、700 µLの40% polyethylene glycol 1000を加えます。よく混ぜ合わせ、30 °Cの振盪インキュベーターで225 RPMにて60分間インキュベートする。次に、チューブを39 °Cのウォーターバスに60分間浸し、形質転換混合物をヒートショックさせる。60分後、チューブに1 mLのYPD培地を加え、30 °C、225 RPMで2時間、細胞を回復させる。室温で9000 ×gで1分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを1 mLのTEバッファーで再懸濁します。細胞を再度遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを100 µLのTEバッファーで再懸濁し、ロイシン欠乏プレートに塗布します。プレートを30 °Cで2〜3日間インキュベートします。CREリコンビナーゼを介したマーカーレスキューを行う前に、本文のプロトコルに記載されている方法でCRE発現プラスミドを構築します。このエピソーム複製プラスミドの特徴には、CREリコンビナーゼ遺伝子、ハイグロマイシンB耐性マーカー、およびアンピシリン耐性遺伝子が含まれています。本手順を開始するには、前述の形質転換プロトコルに従って、CRE発現プラスミドをKU70ノックアウト株のコンピテントセルに形質転換します。形質転換した細胞をYPDおよびハイグロマイシンB含有プレートに播種し、30 °Cで2〜3日間培養します。陽性コロニーを同定するためのテキストプロトコルに従ってコロニーPCRを実施した後、陽性クローンを選択して2 mLのYPDH培地に接種し、30 °Cの振盪インキュベーターで225 RPMにて飽和するまで一晩培養します。翌日、分光光度計を用いて培養液のOD 600を測定します。細胞のOD 600が約15に達したとき、室温で5000 ×gにて5分間、遠心分離により回収します。上清を除去し、2 mLの滅菌水を加えて再度遠心分離を行います。上清を除去し、細胞をYPD培地で再懸濁します。初期OD 600を0.1として、2 mLのYPD培地に細胞を再接種します。その後、30 °Cのインキュベーター内で225 RPMで一晩培養します。翌日、単一コロニーを分離するために、一晩培養した細胞をYPDプレートにストリークします。コロニーが出現するまで30 Celsiusでインキュベートします。コロニーをYPD、YPDH、およびロイシン欠損プレートにレプリカプレートします。プレートを30°Cで2日間インキュベートします。KU70ノックアウトプラスミドの模式図を示します。SacIIおよびNdeI酵素でプラスミドを消化することで、破壊カセットが作製されます。ゲル電気泳動により、ディスラプションカセットの期待サイズである4.3 kilobaseのバンドの存在が確認された。Y. lipolytica PO1GにおけるKU70遺伝子の欠損はPCRによって確認された。レーン1から10は形質転換体のゲノムDNAから増幅したPCR産物であり、レーン11は野生株のPCR産物である。レーン7は陽性のノックアウトを示し、レーン1は偽陽性を示しています。KU70ノックアウト株の選択マーカー遺伝子は、最終的にCREリコンビナーゼの発現によって除去されました。陽性のマーカーフリー形質転換体は、YPDプレート上でのみ増殖することによって確認されました。KU70遺伝子の欠損後、遺伝子欠損率の向上を検証するため、KU70ノックアウト株を用いて同様の手順で11個の標的遺伝子を個別に欠損させました。各遺伝子の破壊はPCRにより確認し、その代表的な結果をここに示します。なお、レーン1、2、4が陽性のノックアウトとして同定されています。Yarrowia lipolytica PO1G KU70欠損プラチナ株は、他の染色体欠損変異体を構築する際のパスウェイエンジニアリングおよび株の最適化への適用において、より効率的なシステムであり、より優れた選択肢となります。このビデオを視聴することで、yarrowia lipolytica PO1G細胞における相同組み換えを用いた標的単一遺伝子欠損戦略について、包括的な理解を深めることができます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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このプロトコルは生物発光レポーターを採用しており、 Saccharomyces eubayanus...

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生産およびバキュロ ウイルスの遺伝子治療応用のための浄化

学ぶ Yarrowia lipolytica Po1gにおける遺伝子工学手法。KU70欠失による相同組換え効率化とCre/LoxPマーカー回収システムを用いた標的遺伝子欠失プロトコル。バイオ燃料・生化学的生産のための株改良に有用です。

再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

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