再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

この手順の全体的な目標は、トランスフォーミングDNAの構築、DNAトランスフォーミング、トランスフォータント選択、相同組換えによる標的遺伝子欠失など、型破りな酵母種に対する効果的な遺伝子工学的方法を開発することです。私たちは、ヤロウィア脂肪ポリチカPO1G株で高度に視野の遺伝子欠失技術を確立し、バイオ燃料およびバイオ化学生産への応用の可能性を秘めています。PCRを介した遺伝子破壊のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、大量の遺伝子欠失三日月と幅広い選択可能なマーカーが利用可能であることです。

この研究では、効率的で、簡単で、評判が良く、再現性のあるヤロウィア脂肪ポリチカPO1G株の遺伝学変換プロトコルを報告します。この研究で構築されたヤロウィア脂肪ポリチカPO1G KU70欠失株は、非常に効率的な相同組換え頻度を示しており、これにより標的遺伝子欠失の迅速かつ容易なスクリーニングが可能になります。この手順の最初のステップは、Y.lipolytica発現ベクターからLEU2発現カセットをPCRによって増幅し、LEU2カセットの5プライム末端と3プライム末端にLoxP部位を導入することです。

BamHI制限部位は、クローニングプロセスの後続のステップのためにプライマー1でも導入されています。LoxPプロモーターLEU2ターミネーターLoxPカセットを精製した後、精製したPCR産物に3つのprime-Aオーバーハングを添加します。次に、AテールPCR産物をTAクローニングベクターにライゲーションして、血漿T-LEU2を生成します。

2番目のPCRステップは、Y.lipolytica PO1GゲノムDNAからのプライマー3および4を使用して、KU70遺伝子の1キロベース5プライムアップストリーム配列を増幅することです。その後、精製されたPCR産物とT-LEU2プラスミドの両方をSacIIおよびBamHI酵素で二重に消化し、精製および消化されたPCR産物をT-LEU2のSacIIのBamHI部位にライゲーションして、プラスミドT-LEU2-5Eを生成します。3番目のPCRステップは、Y.lipolytica PO1GゲノムDNAからのプライマー5および6を使用して、KU70遺伝子の1キロベース3プライムダウンストリーム配列を増幅することです。

次に、精製したPCR産物とT-LEU2-53プラスミドの両方をNotIおよびNdeI酵素で二重消化し、精製および消化したPCR産物をT-LEU2-5EのNotI NdeI部位にライゲーションしてT-KOプラスミドを生成します。最後に、T-KOプラスミドをSacIIおよびNdeI酵素で消化し、破壊カセットを作製します。この手順は、有能なY.lipolytica PO1G細胞を準備することから始めます。

100ミリリットルのフラスコに10ミリリットルのYPD培地に新鮮な酵母抽出物ペプトンデキストロースまたはYPDプレートからY.lipolytica PO1G株のコロニーを接種します。摂氏30度の振とうインキュベーターで225 RPMで飽和するまで20時間インキュベートします。翌日、室温でGの5000倍で5分間セトリフティングすることにより、細胞をペレット

細胞を20ミリリットルのTEバッファーで洗浄し、細胞を再度ペレット化します。上清を除去した後、細胞を1ミリリットルの0.1モル酢酸リチウムに再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。コンピテントセルを滅菌1.5ミリリットルチューブ内の100マイクロリットルアリコートに分割します。

10マイクロリットルの変性サケ精子DNAと1〜5マイクログラムの精製された破壊カセットを100マイクロリットルのコンピテントセルと一緒に穏やかに混合することにより、すぐに形質転換手順に進みます。摂氏30度で15分間インキュベートします。700マイクロリットルの40%ポリエチレングリコールを1000リットル加えます。

よく混合し、摂氏30度の振とうインキュベーターで225 RPMで60分間インキュベートします。次に、チューブを摂氏39度のウォーターバスに60分間入れて、形質転換混合物をヒートチャックします。60分後、1ミリリットルのYPD培地をチューブに加え、細胞を摂氏30度、225RPMで2時間回復させます。

室温で1分間、Gの9000倍で遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルのTEバッファーに再懸濁します。細胞を再度遠心分離し、上清を捨てます。

ペレットを 100 マイクロリットルの TE バッファーに再懸濁し、ロイシン欠乏プレートにプレートします。プレートを摂氏30度で2〜3日間インキュベートします。CRE組換え酵素媒介マーカーレスキューを実施する前に、CRE発現プラスミドは、テキストプロトコルに記載されているように構築されます。

このエピソーム複製プラスミドの特徴には、CREリコンビナーゼ遺伝子、ハイグロマイシンB耐性マーカー、およびアンピシリン耐性遺伝子が含まれます。この手順を開始するには、CRE発現プラスミドを、前に示した形質転換プロトコルに従ってKU70ノックアウト株のコンピテントセルに形質転換します。形質転換細胞をYPDとハイグロマイシンBプレートに播種し、摂氏30度で2〜3日間インキュベートします。

コロニーPCRを実施した後、陽性コロニーを同定するためのテキストプロトコルに記載されているように、陽性クローンを選択して2ミリリットルのYPDH培地を接種し、摂氏30度の振とうインキュベーターで225RPMで一晩飽和するまでインキュベートします。翌日、分光光度計で培養物のOD600を測定します。細胞が約15のOD600にあるとき、室温で5000倍のGで5分間遠心分離することにより回収します。

上清を取り除き、2ミリリットルの滅菌水を加えて再度回転させます。上清を取り除き、細胞をYPD培地に再懸濁します 初期OD600が0.1のYPD培地の2ミリリットルに細胞を再接種します。そして、細胞を摂氏30度のインキュベーターで225RPMで一晩増殖させます。

翌日、一晩の細胞培養をYPDプレートに縞模様にして、単一コロニーを単離します。コロニーが現れるまで摂氏30度でインキュベートします。YPD、YPDH、およびロイシン欠損プレート上のレプリカプレートコロニー

プレートを摂氏30度で2日間インキュベートします。KU70ノックアウトプラスミドの概略図を示します。SacIIおよびNdeI酵素によるプラスミドの消化により、破壊カセットが生成されます。

ゲル電気泳動により、ディスラプションカセットの予想サイズである4.3 kgbaseバンドの存在が確認されます。Y.lipolytica PO1GのKU70遺伝子欠失はPCRによって確認されます。レーン1〜10には、形質転換体のゲノムDNAから増幅されたPCR産物が含まれ、レーン11には、野生型株のPCR産物が含まれています。

レーン 7 は陽性のノックアウトを示し、レーン 1 は偽陽性を示しています。KU70ノックアウト株の選択マーカー遺伝子は、最終的にCREリコンビナーゼの発現によって除去されました。ポジティブマーカーフリーの形質転換体は、YPDプレート上でのみの成長によって検証されました。

遺伝子欠失率の増加を確認するため、KU70遺伝子を欠失させた後、KU70ノックアウト株で同様の手順で11個の標的遺伝子を個別に欠失させました。各遺伝子の破壊はPCRによって確認され、代表的な結果をここに示し、レーン1、2、および4が陽性ノックアウトとして識別されました。ヤロウィア脂肪ポリチカPO1G KU70欠失プラチナ株は、他の染色体欠失変異体を構築する際のパスウェイエンジニアリングおよび株最適化のアプリケーションに対して、より効率的なシステムとより良い選択肢を提供します。

このビデオを見れば、ヤロウィア脂肪ポリチカPO1G細胞における相同組換えによる標的単一遺伝子欠失戦略を包括的に理解できるはずです。